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1、现代微生物发酵及技术教程现代微生物发酵及技术教程4.4.微生物发酵工程概述微生物发酵工程概述 4.1 4.1 微生物发酵的类型微生物发酵的类型 4.2 4.2 4.2 4.2 原料的选择和处理原料的选择和处理原料的选择和处理原料的选择和处理4.3 4.3 4.3 4.3 灭菌和空气净化工程灭菌和空气净化工程灭菌和空气净化工程灭菌和空气净化工程4.5 4.5 菌种的培养菌种的培养4.6 4.6 发酵过程的分析检验发酵过程的分析检验4.4.微生物发酵工程概述微生物发酵工程概述4.7 4.7 发酵培养方法发酵培养方法 2 发酵工程是利用微生物细胞的代谢过程生产发酵工程是利用微生物细胞的代谢过程生产有
2、用的各种产物的过程，它由有用的各种产物的过程，它由三个核心部分三个核心部分组成：组成：一、生产特定产物的微生物一、生产特定产物的微生物菌种的选育菌种的选育；二、利；二、利用适当的设备和技术为菌种用适当的设备和技术为菌种提供最佳条件提供最佳条件，充分，充分发挥菌种的生产能力；三、将发酵产生的产物经发挥菌种的生产能力；三、将发酵产生的产物经分离、纯化，以分离、纯化，以提高收率获得质量合格的产品提高收率获得质量合格的产品。 微生物发酵工业以微生物发酵工业以发酵为主发酵为主，发酵水平的好，发酵水平的好坏是整个生产的关键，但坏是整个生产的关键，但后处理后处理在发酵生产中也在发酵生产中也占有重要的地位占有
3、重要的地位。完整的微生物发酵工程应该包。完整的微生物发酵工程应该包括从原料到获得终产品的过程，即括从原料到获得终产品的过程，即菌种是基础，菌种是基础，发酵是关键，分离纯化是保障发酵是关键，分离纯化是保障。34.1 4.1 微生物发酵的类型微生物发酵的类型 按照微生物对按照微生物对氧气的要求、发酵采用的方式、发氧气的要求、发酵采用的方式、发酵产物的特性酵产物的特性，将发酵分为不同的类型：，将发酵分为不同的类型：4.1.1 4.1.1 按照微生物对按照微生物对氧气的要求分类氧气的要求分类1 1、好氧发酵：好氧发酵：指发酵产物形成时指发酵产物形成时需要充足的氧气需要充足的氧气。如。如柠檬酸发酵、草酸
4、发酵、谷氨酸发酵以及各种抗生柠檬酸发酵、草酸发酵、谷氨酸发酵以及各种抗生素发酵等。素发酵等。2 2、厌氧发酵：厌氧发酵：指发酵时指发酵时不需要提供氧气不需要提供氧气，如丙酮，如丙酮- -丁丁醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵、丁酸发酵等。醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵、丁酸发酵等。3 3、兼性厌氧发酵：兼性厌氧发酵：产生酒精的酵母菌是一种兼性厌氧产生酒精的酵母菌是一种兼性厌氧微生物，在缺氧条件下进行酒精发酵，积累酒精，微生物，在缺氧条件下进行酒精发酵，积累酒精，在大量通气条件下则进行好氧发酵，产生大量酵母在大量通气条件下则进行好氧发酵，产生大量酵母细胞。细胞。44.1.2 4.1.2 按微生物发酵采用的培
5、养基状态分类按微生物发酵采用的培养基状态分类1 1、固体发酵、固体发酵 固态发酵是指没有或几乎没有自由水固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度下的固态基质中，存在下，在有一定湿度下的固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。用一种或多种微生物的一个生物反应过程。5固体发酵的固体发酵的优点优点： 操作简便、发酵过程容易控制、对无菌操作简便、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染；要求相对较低、不易发生大面积的污染； 基质含水量低，生物反应器的体积小；基质含水量低，生物反应器的体积小； 发酵的副产物可以综合利用，不需废水发酵的副产物可以综合利用，不需废水处
6、理；处理； 供氧由气体扩散或间接通风完成，能耗供氧由气体扩散或间接通风完成，能耗低；低； 能在一定程度上解除产物抑制，可获得能在一定程度上解除产物抑制，可获得较高的次级代谢产物。较高的次级代谢产物。6缺点：缺点： 厂房面积大；厂房面积大； 生物反应器设计不够完善；生物反应器设计不够完善； 难以准确测定含水量、菌体量和二氧化难以准确测定含水量、菌体量和二氧化碳生成量等发酵参数；碳生成量等发酵参数； 微生物生长速度缓慢，容易污染；微生物生长速度缓慢，容易污染； 只适合用于耐低活性水的菌等的发酵。只适合用于耐低活性水的菌等的发酵。72.2.液体发酵液体发酵 液体发酵的方式：液体发酵的方式： 1 1、
7、将培养基放在瓷盘内，进行静止培、将培养基放在瓷盘内，进行静止培养，称养，称浅盘发酵（表面发酵）浅盘发酵（表面发酵）。该法存在。该法存在不少的缺点，如劳动强度大，占地面积大，不少的缺点，如劳动强度大，占地面积大，产量小，易染杂菌等，因此迅速被液体深产量小，易染杂菌等，因此迅速被液体深层发酵所取代。层发酵所取代。 2 2、将培养液放入不锈钢制成的发酵罐，、将培养液放入不锈钢制成的发酵罐，在罐内进行在罐内进行深层发酵深层发酵。8液体深层发酵的液体深层发酵的优点优点： 1 1、液体为悬浮状态为许多微生物提供最适合生、液体为悬浮状态为许多微生物提供最适合生长环境，长环境，菌体生长快，发酵产率高，发酵周期
8、短菌体生长快，发酵产率高，发酵周期短； 2 2、在液体中，菌体、底物、产物以及发酵产生、在液体中，菌体、底物、产物以及发酵产生的热量易于扩散，使发酵可在均质条件下进行，的热量易于扩散，使发酵可在均质条件下进行，易易于控制，便于扩大生产规模于控制，便于扩大生产规模； 3 3、厂房面积小，生产效率高，易进行自动控制，、厂房面积小，生产效率高，易进行自动控制，产品质量稳定产品质量稳定； 4 4、产品、产品易于提取和精制易于提取和精制。 但液体深层发酵消耗能源多，设备复杂，需要但液体深层发酵消耗能源多，设备复杂，需要较大的投资，有废物排除等较大的投资，有废物排除等缺点缺点。94.1.3 4.1.3 发
9、酵的一般工艺过程发酵的一般工艺过程 微生物发酵产物虽然多种多样，发酵类型不微生物发酵产物虽然多种多样，发酵类型不一，但总体上的一，但总体上的工艺流程工艺流程是相似的，包括以下过是相似的，包括以下过程：程： 1 1、原料的处理和灭菌；、原料的处理和灭菌； 2 2、空气的净化除菌；、空气的净化除菌； 3 3、菌种的扩大培养；、菌种的扩大培养； 4 4、发酵的条件控制；、发酵的条件控制； 5 5、产品的提取精制等阶段。、产品的提取精制等阶段。104.2 4.2 原料的选择及处理原料的选择及处理 培养基是微生物生长繁殖需要的营养环境。培养基是微生物生长繁殖需要的营养环境。培养基成分包括碳源、氮源、无机
10、盐、微量元素培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和水等。和水等。4.2.1 4.2.1 选择合适的原料选择合适的原料标准：标准：1 1、原料中碳的可利用率高；、原料中碳的可利用率高；2 2、发酵率高，而且尽可能使发酵残余物少；、发酵率高，而且尽可能使发酵残余物少；3 3、原料质量好，成分稳定，污染变质少，易灭菌；、原料质量好，成分稳定，污染变质少，易灭菌；4 4、廉价，来源方便，易于保藏。、廉价，来源方便，易于保藏。114.2.2 4.2.2 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 淀粉是由葡萄糖组成淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子，除少数霉的生物大分子，除少数霉菌可以直接利用淀粉外，目前菌可以
11、直接利用淀粉外，目前大多数微生物都不能大多数微生物都不能直接利用淀粉直接利用淀粉，如氨基酸产生菌、酒精酵母、抗生，如氨基酸产生菌、酒精酵母、抗生素产生菌等。因此在氨基酸、抗生素有机酸等的生素产生菌等。因此在氨基酸、抗生素有机酸等的生产中，都要求产中，都要求先对淀粉或淀粉原料进行糖化，制成先对淀粉或淀粉原料进行糖化，制成淀粉水解糖后使用淀粉水解糖后使用。 将淀粉水解为葡萄糖的过程称为将淀粉水解为葡萄糖的过程称为糖化糖化，制得的，制得的糖溶液叫糖溶液叫淀粉水解糖淀粉水解糖。 淀粉蓝糊精红糊精无色糊精麦芽糖葡萄糖（C6H10O5)n+nH2O n C6H12O6酸或酶12一、淀粉水解糖的制备方法一、
12、淀粉水解糖的制备方法 葡萄糖值葡萄糖值-DE-DE值值 工业上用工业上用DEDE值（也称值（也称G G值）表示值）表示淀粉糖的糖组成淀粉糖的糖组成。糖。糖化液中的还原糖含量（以化液中的还原糖含量（以G G计算）占干物质的百分率称为。计算）占干物质的百分率称为。 还原糖含量还原糖含量DEDE值值 = = 100% 100% 干物质含量干物质含量 用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、大米等富含淀粉的农产品。根据大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质原料淀粉的性质及及采采用的催化剂不同用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有，淀粉水解为葡萄糖的方法
13、有酸解法酸解法、酶解法酶解法以及以及酸酶结合法酸酶结合法等三种。等三种。 13 又称又称酸糖化法酸糖化法，它是以酸为催化剂在高温下将，它是以酸为催化剂在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：优点：生产方便，设备简单，水解时间短，设备生产生产方便，设备简单，水解时间短，设备生产能力大；能力大；缺点：缺点：a a反应在反应在高温高压及酸条件下进行高温高压及酸条件下进行，对设备有耐，对设备有耐腐蚀、耐高温和耐高压的要求；腐蚀、耐高温和耐高压的要求； b b发生副反应，葡萄糖损失，发生副反应，葡萄糖损失，淀粉的转化率低淀粉的转化率低； c c对原料要求严格对原料要求严格
14、。1 1、酸解法、酸解法 14 酶解法是利用专一性很强的酶解法是利用专一性很强的淀粉酶淀粉酶及及糖化酶糖化酶将淀将淀粉水解为葡萄糖的方法。粉水解为葡萄糖的方法。 酶解法可分为两步：酶解法可分为两步：第一步，利用第一步，利用-淀粉酶淀粉酶将淀粉将淀粉液化液化；第二步，利用第二步，利用糖化酶糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转化将糊精或低聚糖进一步水解转化为为葡萄糖葡萄糖。生产上这两步分别称为。生产上这两步分别称为液化和糖化液化和糖化。由于。由于在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的。因此酶解法又称为的。因此酶解法又称为双酶法或多酶法双酶法或多酶
15、法。 2 2、酶解法、酶解法 151.1.酶酶解解法法是是在在酶酶的的作作用用下下进进行行的的，反反应应条条件件较较温温和，和，不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备；不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备；2.2.酶酶作作为为催催化化剂剂的的特特点点是是专专一一性性强强，副副反反应应少少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；3.3.可可在在较较高高的的淀淀粉粉乳乳浓浓度度下下水水解解。如如酸酸解解法法一一般般使使用用含含18%-20%18%-20%淀淀粉粉的的淀淀粉粉乳乳，而而酶酶解解法法可可用用含含34%-40%34%-40%淀粉的淀粉乳，淀粉的淀粉乳，并且可以采用粗原料并
16、且可以采用粗原料。4.4.用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，质量高，有利于糖液的充分利用有利于糖液的充分利用。 优优点点16缺点缺点 酶解法酶解法反应时间较长反应时间较长，设备要求较设备要求较多，多，且酶是蛋白质，易且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困引起糖液过滤困难难。当然，随着酶制剂生产及应用技术。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。制糖。 173 3酸酶结合法酸酶结合法 酸酶结合法是集中了酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优酸解法和酶解法制糖的优点点而采用的生产方法
17、，它又可分为：而采用的生产方法，它又可分为： A A、酸酶法：、酸酶法：是先将是先将淀粉淀粉用用酸水解成糊精或低聚糖酸水解成糊精或低聚糖，然后再用然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。一般采的工艺。一般采用将淀粉先用酸水解到用将淀粉先用酸水解到DEDE值达值达10-1510-15，在降温中和后，在降温中和后，用糖化酶进行糖化。用糖化酶进行糖化。 优点：优点：酸液化速度快酸液化速度快，糖化时可以采用较高的，糖化时可以采用较高的淀粉乳浓度，淀粉乳浓度，提高生产效率提高生产效率；酸用量少，产品的色；酸用量少，产品的色泽浅，泽浅，糖液质量高糖液质量高。18B B、酶酸法、酶酸法：
18、是先将淀粉乳用：是先将淀粉乳用-淀粉酶液化淀粉酶液化到一定到一定程度，再用程度，再用酸水解成葡萄糖酸水解成葡萄糖的工艺。有些淀粉原的工艺。有些淀粉原料颗粒大小不一，如用酸法水解，则料颗粒大小不一，如用酸法水解，则常使水解不常使水解不均匀，出糖率低均匀，出糖率低。生产中应用。生产中应用酶酸法酶酸法，可采用粗，可采用粗淀粉为原料，粉料浓度较酸解法高，淀粉为原料，粉料浓度较酸解法高，生产易控制，生产易控制，耗时短，且酸解时耗时短，且酸解时PHPH值稍高，以减轻淀粉水解的值稍高，以减轻淀粉水解的副反应。副反应。 从水解糖的质量和降低糖耗，从水解糖的质量和降低糖耗，提高原料的出提高原料的出糖率来看，酶解
19、法最好，酸解法最差糖率来看，酶解法最好，酸解法最差。从制糖过。从制糖过程程所需的时间看，酸解法最短，酶解法最长所需的时间看，酸解法最短，酶解法最长。194.2.2.2 4.2.2.2 淀粉酸水解原理及技术淀粉酸水解原理及技术1 1、淀粉酸水解原理、淀粉酸水解原理 淀粉淀粉蓝糊精蓝糊精红糊精红糊精无色糊精无色糊精麦芽糖麦芽糖葡萄糖葡萄糖水解过程：水解过程：水解过程中存在三大化学反应：水解过程中存在三大化学反应： 复合二糖复合二糖 复合低聚糖复合低聚糖 水解水解淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 5-羟甲基糖醛羟甲基糖醛 有机酸、有色物质有机酸、有色物质13220（1 1）水解反应速度）水解反应速度（C C6
20、 6H H1010O O5 5)n+nH)n+nH2 2O n CO n C6 6H H1212O O6 6酸酸影响水解反应速度常数影响水解反应速度常数k k的几个因素的几个因素 k=N 1 1）为为催化剂活性系数催化剂活性系数催化剂HClH2SO4H3PO4HACHBrHI值10.5-0.520.30.0251.72.5各种酸的各种酸的值值2 2）N N为酸为酸的摩尔浓度的摩尔浓度3）为为多糖的水解性常数多糖的水解性常数多糖的种类棉花淀粉木材稻草半纤维素蔗糖值14002.0-2.510-400100214 4）为水解温度为水解温度不同温度下淀粉水解反应速度常数不同温度下淀粉水解反应速度常数
21、温度119133138143k值0.1250.4700.7701.200结论：结论：淀粉水解所用的淀粉水解所用的催化剂种类催化剂种类、浓度浓度、反应温度反应温度均对均对水解反应速度有很大的影响水解反应速度有很大的影响，是我们在水解过程，是我们在水解过程中必须注意的主要因素。中必须注意的主要因素。（2 2）葡萄糖的复合反应）葡萄糖的复合反应2C6H12O6 C12H22O11+H2O 酸和热酸和热 复合反应中两个葡萄糖分复合反应中两个葡萄糖分子通过复合反应子通过复合反应聚合成二糖聚合成二糖时，时，并不是经过并不是经过1 1，4-4-糖苷键糖苷键聚合聚合成为麦芽糖，而主要是经由成为麦芽糖，而主要是
22、经由1 1，6-6-糖苷键糖苷键聚合成聚合成异麦芽糖异麦芽糖或或经由经由1 1，6-6-糖苷键聚合成糖苷键聚合成龙胆龙胆二糖二糖。当然此复合反应是可逆。当然此复合反应是可逆的，复合糖可以再水解变成葡的，复合糖可以再水解变成葡萄糖。萄糖。 22（3 3）葡萄糖的分解反应）葡萄糖的分解反应葡萄糖（失水） 5-羟甲基糠醛 +甲酸 腐植质（色素）实验结果证明：实验结果证明： 1 1）5-5-羟甲基羟甲基糠糠醛是产生色素的根源；醛是产生色素的根源； 2 2）色素的生成量随）色素的生成量随葡萄糖浓度的增加而增加葡萄糖浓度的增加而增加； 3 3）PHPH值等于值等于3 3时，色素的生成量最小。时，色素的生成
23、量最小。 酸法水解淀粉过程中，由于酸法水解淀粉过程中，由于反应温度、压力过高，时间过长，反应温度、压力过高，时间过长，葡萄糖受酸和热的影响发生分解葡萄糖受酸和热的影响发生分解反应，生成反应，生成5-羟甲基糠醛羟甲基糠醛，因，因5-羟甲基糠醛的性质不稳定，又可羟甲基糠醛的性质不稳定，又可进一步分解生成进一步分解生成乙酰丙酸、蚁酸乙酰丙酸、蚁酸等物质，而这些物质又能自身相等物质，而这些物质又能自身相互聚合，或与淀粉中所含的其他互聚合，或与淀粉中所含的其他有机物质相结合，产生有机物质相结合，产生色素色素。231 1）酸）酸法法糖化工艺流程糖化工艺流程淀粉淀粉盐酸盐酸蒸汽蒸汽水水调浆调浆糖化糖化冷却冷
24、却中和脱色中和脱色压滤压滤滤渣滤渣糖液糖液活性炭活性炭Na2CO32 2、酸水解工艺、酸水解工艺 淀粉的酸水解工淀粉的酸水解工艺是根据淀粉在水解艺是根据淀粉在水解过程中的过程中的水解反应水解反应和和复合反应规律性复合反应规律性来决来决定的。在制定工艺条定的。在制定工艺条件时件时既要保证淀粉的既要保证淀粉的彻底水解，达到较高彻底水解，达到较高葡萄糖量葡萄糖量，又要尽可，又要尽可能减少葡萄糖复合、能减少葡萄糖复合、分解反应的发生程度，分解反应的发生程度，此外，还要符合目的此外，还要符合目的产物的产物的发酵条件，发酵条件，符符合发酵工艺的合发酵工艺的实际情实际情况况。 242 2）水解条件选择及其控
25、制）水解条件选择及其控制 1 1、淀粉乳浓度的选择、淀粉乳浓度的选择 2 2、HClHCl用量用量 淀粉乳浓淀粉乳浓度（度（BXBX）26262424222220201919181817171616DEDE值值89.89.171789.89.272789.989.92 291.191.191.391.392.792.77 792.8192.8193.0193.01浓度控制在浓度控制在18-19BX18-19BX。 用量为淀粉量的用量为淀粉量的0.6%-0.7%0.6%-0.7%，淀粉乳，淀粉乳的的PHPH为为1.51.5左右。左右。253 3、水解时间、水解时间 4 4、水解设备水解设备 一般
26、一般15min15min，水解终点的检查，用，水解终点的检查，用无无水酒精检查无白色为止。水酒精检查无白色为止。 不锈钢或搪瓷衬底设备。不锈钢或搪瓷衬底设备。5 5、糖化液糖化液6 6、脱脱 色色 冷却降温，并加冷却降温，并加纯碱中和调节纯碱中和调节PHPH为为4.6-5.04.6-5.0，温度控制在，温度控制在60-7060-70。 活性炭脱色活性炭脱色，添加量为淀粉量的，添加量为淀粉量的0.6-0.80.6-0.8，在，在PH4.6-5.0PH4.6-5.0，温度，温度6565，搅拌脱色搅拌脱色30min30min，经过滤掉蛋白质等杂质，经过滤掉蛋白质等杂质，即获得较纯的水解糖即获得较纯的
27、水解糖。264.2.2.3 4.2.2.3 双酶法制糖原理双酶法制糖原理 酶解法也称双酶法，它是由酶解法也称双酶法，它是由淀粉酶和糖化酶淀粉酶和糖化酶将将淀粉糖转化为葡萄糖淀粉糖转化为葡萄糖的方法。的方法。 酶解法优点：酶解法优点：以作用专一性的酶制剂作为催以作用专一性的酶制剂作为催化剂，因此化剂，因此反应条件温和反应条件温和，复合和分解反应较少复合和分解反应较少，因此采用酶法生产不仅可因此采用酶法生产不仅可提高淀粉的转化率及糖提高淀粉的转化率及糖液的浓度液的浓度，而且还可大幅度地，而且还可大幅度地改善了糖液的质量改善了糖液的质量，是目前最为理想、应用最广的制糖方法。是目前最为理想、应用最广的
28、制糖方法。 缺点：缺点：时间长；过滤难。时间长；过滤难。271 1、淀粉酶解法的两个步骤、淀粉酶解法的两个步骤 酶酶 水解位置水解位置 水解次序水解次序 水解产物水解产物液化液化 淀粉酶淀粉酶 1，4糖苷键糖苷键 无先后次序无先后次序 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖 异麦芽糖、低聚糖异麦芽糖、低聚糖糖化糖化 糖化酶糖化酶 1，4和和1，6 从非还原性从非还原性 葡萄糖葡萄糖 糖苷键糖苷键 末端开始末端开始一、一、液化过程液化过程，采用高温，采用高温-淀粉酶淀粉酶，将高温糊化了，将高温糊化了的淀粉液化，的淀粉液化，生成糊精及低聚糖生成糊精及低聚糖，使淀粉和其结合，使淀粉和其结合
29、蛋白分离；蛋白分离；二、二、糖化过程糖化过程，利用，利用糖化酶糖化酶将液化生成的糊精、低将液化生成的糊精、低聚糖进一步聚糖进一步水解生成葡萄糖水解生成葡萄糖。28淀粉糊化淀粉糊化 是指是指淀粉受热淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失晶体结构消失，互相接触变成糊状液体互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。再沉淀的现象。 由于淀粉颗粒的结晶由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力性结构对酶作用的抵抗力非常强非常强, ,不能使淀粉酶直接不能使淀粉酶直接作用于淀粉作用于淀粉, ,而需要先加热而需要先加热淀粉乳淀粉乳, ,使淀粉颗粒吸水
30、膨使淀粉颗粒吸水膨胀、糊化，破坏其结晶性胀、糊化，破坏其结晶性的结构。的结构。 1 1、液化原理、液化原理1 1）淀粉的糊化与老化）淀粉的糊化与老化 29 糊化温度：糊化温度：发生糊化现象时的温度称为糊化温度，发生糊化现象时的温度称为糊化温度，一般来讲，糊化温度有一个范围。不同的淀粉有不同一般来讲，糊化温度有一个范围。不同的淀粉有不同的糊化温度。的糊化温度。 淀粉的老化：淀粉的老化：分子间分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。，也就是复结晶过程。 老化的弊端：老化的弊端：淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区淀粉酶很难
31、进入老化淀粉的结晶区起作用，使起作用，使淀粉很难液化，更不能糖化淀粉很难液化，更不能糖化。 糊化淀粉是在淀粉酶的作用下液化的，糊化淀粉是在淀粉酶的作用下液化的，-淀粉酶淀粉酶可以水解淀粉分子链的可以水解淀粉分子链的-1-1，4 4糖苷键糖苷键，不能水解，不能水解-1-1，6 6糖苷键，但能越过糖苷键，但能越过-1-1，6 6糖苷键继续水解糖苷键继续水解-1-1，4 4糖苷键，糖苷键，水解没有规律性的先后次序。水解没有规律性的先后次序。302 2、糖化的原理、糖化的原理 糖化酶又称糖化酶又称糖化型淀粉酶或葡糖淀粉酶糖化型淀粉酶或葡糖淀粉酶，它对，它对底物作用是底物作用是从非还原性末端开始切割从非
32、还原性末端开始切割，一个分子切，一个分子切割下葡萄糖单位。它不但可以水解割下葡萄糖单位。它不但可以水解-1-1，4 4糖苷键，糖苷键，而且也水解而且也水解-1-1，6 6糖苷键和糖苷键和-1-1，3 3糖苷键。它可糖苷键。它可以以直接将淀粉水解成葡萄糖直接将淀粉水解成葡萄糖，也能水解糊精、低聚，也能水解糊精、低聚糖，最终产物转化为葡萄糖。糖，最终产物转化为葡萄糖。酶的酶的用量用量原则：原则：酶活力低，液化液浓度高，用量则多酶活力低，液化液浓度高，用量则多，反之则少。，反之则少。生产用量：生产用量：30%30%淀粉，淀粉，80-10080-100单位单位/ /克淀粉。克淀粉。 314.2.3 4
33、.2.3 糖蜜预处理糖蜜预处理1 1、糖蜜稀释：、糖蜜稀释：糖蜜在处理前要加水稀释，加水量为糖蜜在处理前要加水稀释，加水量为1 1：1 1，否则黏度太高不利于后续操作；否则黏度太高不利于后续操作；2 2、糖蜜澄清：、糖蜜澄清：由于其中含有大量灰分和胶体，由于其中含有大量灰分和胶体，不但不但影响菌体的生长，也影响产品的纯度，影响菌体的生长，也影响产品的纯度，胶体使发胶体使发酵中产生大量泡末，酵中产生大量泡末，影响发酵；影响发酵；3 3、脱钙调、脱钙调PHPH值：值：对酸性原料，对酸性原料，PHPH应该调得比碱性原应该调得比碱性原料要高些，因为它具有延时缓冲性，用它配制的料要高些，因为它具有延时缓
34、冲性，用它配制的培养基在灭菌后会酸化；而碱性原料的性质正好培养基在灭菌后会酸化；而碱性原料的性质正好相反。调相反。调PHPH一般用一般用硫酸或碳酸钠，调硫酸或碳酸钠，调PH6.0-7.2PH6.0-7.2。4 4、调节金属离子的浓度：、调节金属离子的浓度：最常用的方法是采用添加最常用的方法是采用添加黄血盐（亚铁氰化钾）或黄血盐（亚铁氰化钾）或EDTAEDTA等络合剂、离子交等络合剂、离子交换树脂和活性碳吸附换树脂和活性碳吸附。324.3 4.3 灭菌与空气净化工程灭菌与空气净化工程 4.3.1 4.3.1 培养基湿热灭菌方法及设备培养基湿热灭菌方法及设备 灭菌原理灭菌原理：当温度超过最高限度时
35、，微生物细胞当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质和酶的基本成分中的原生质和酶的基本成分-蛋白质发生不可逆的蛋白质发生不可逆的变化，变化，使微生物在很短时间内死亡。使微生物在很短时间内死亡。 以能否杀死细菌的芽孢为以能否杀死细菌的芽孢为标准。标准。 杀死微生物的极端温度称为杀死微生物的极端温度称为致死温度致死温度。在致死温在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。致死时间。334.3.1.1 4.3.1.1 连续灭菌及设备连续灭菌及设备 连续灭菌也叫连消，连续灭菌也叫连消，将配制好的培养基在高温将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同
36、时经过快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温，保加温，保温，冷却温，冷却的过程进行灭菌。的过程进行灭菌。其灭菌的温度一般以其灭菌的温度一般以126-132126-132为宜。为宜。 连续灭菌时培养基可连续灭菌时培养基可瞬时被加热到瞬时被加热到144144，并，并保持此温度至灭菌要求，也能很快地被冷却，因此保持此温度至灭菌要求，也能很快地被冷却，因此是是高温瞬时灭菌法，有利于减少培养基中的营养物高温瞬时灭菌法，有利于减少培养基中的营养物质的破坏。质的破坏。3435连续灭菌的基本设备一般包括：连续灭菌的基本设备一般包括：1 1、配料预热罐、配料预热罐：将配制好的料液：将配制好的料液预热到预热到6
37、0-7060-70，以免连续灭菌料液与蒸汽温度相差过大而产生水以免连续灭菌料液与蒸汽温度相差过大而产生水气碰击声。气碰击声。2 2、连消器：、连消器：主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并混合，并使料液的温度很快提高到灭菌温度使料液的温度很快提高到灭菌温度。3 3、维持罐：、维持罐：连消器加热的时间很短，仅靠这段时间连消器加热的时间很短，仅靠这段时间灭菌不够，维持罐的作用是灭菌不够，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下使料液在灭菌温度下保持保持5-7min5-7min，以达到灭菌的目的，以达到灭菌的目的。4 4、冷却器：、冷却器：从维持罐出来的料液要经过冷却器
38、进行从维持罐出来的料液要经过冷却器进行冷却（冷却（40-5040-50）。3637连续灭菌的优缺点连续灭菌的优缺点及注意事项及注意事项优点：优点：1 1）培养基受热时间短，可缩短发酵周期；同时培养）培养基受热时间短，可缩短发酵周期；同时培养基成分破坏也较少。基成分破坏也较少。2 2）蒸汽负荷均衡蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。，锅炉利用率高，操作方便。3 3）适于自动控制，降低劳动强度适于自动控制，降低劳动强度。缺点：缺点：设备复杂，投资大。设备复杂，投资大。注意事项：注意事项：1 1）连消前，应先进行空罐、维持罐、冷）连消前，应先进行空罐、维持罐、冷却系统的灭菌。却系统的灭菌。 2 2
39、）确保管路无渗漏。）确保管路无渗漏。384.3.1.2 4.3.1.2 间歇灭菌及设备间歇灭菌及设备 间歇灭菌法：间歇灭菌法：将配制好的培养基放在发酵罐将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪通入蒸汽将培养基和所有设备仪器一起加热器一起加热，达到预定灭菌温度后维持一段时间，达到预定灭菌温度后维持一段时间，再冷却到发酵温度的湿热灭菌的过程，也称再冷却到发酵温度的湿热灭菌的过程，也称实罐实罐灭菌。灭菌。间歇灭菌的过程一般包括间歇灭菌的过程一般包括升温、保温和冷升温、保温和冷却却三个阶段。三个阶段。 间歇灭菌时，加热和冷却所需的时间长，且间歇灭菌时，加热和冷
40、却所需的时间长，且发酵罐容积越大，时间越长，就增加了发酵前的发酵罐容积越大，时间越长，就增加了发酵前的准备时间，也相应地延长了发酵周期，使准备时间，也相应地延长了发酵周期，使发酵罐发酵罐的利用率下降的利用率下降。39 1 1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 2 2、预热：预热：向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基培养基加热至加热至7070左右左右。作用：减少冷凝水的生。作用：减少冷凝水的生成；减轻噪音。成；减轻噪音。 3 3、开启蒸汽管，向培养基中
41、通入蒸汽，升温。、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。 4 4、罐压达、罐压达0.1 0.1 MPaMPa时，按装在发酵罐封头的时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。405 5、保温：、保温：调节好各进汽和排汽阀门，使调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。证灭菌
42、彻底，不留死角。6 6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至压力降至0.5kg/cm20.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温培养基降至所需温度。度。 通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压。内正压。41 间歇灭菌的优缺点间歇灭菌的优缺点优点：优点： 1 1）不需专门的灭菌设备，投资少、设备简）不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。单、灭菌效果可靠。 2 2）对蒸汽的要求较低，一般）
43、对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm23-4kg/cm2即可即可满足。满足。缺点：缺点：在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，中小型罐经常采用。荷波动大，中小型罐经常采用。424.3.2 4.3.2 空气净化及设备空气净化及设备4.3.2.1 4.3.2.1 空气净化的要求空气净化的要求 发酵用的发酵用的无菌空气无菌空气, ,就是将自然界的空气经过就是将自然界的空气经过压缩压缩, ,冷却冷却, ,减湿减湿, ,过滤过滤等过程达到等过程达到: :1连续提供一定流量的连续提供一定流量的压缩空气压缩空气。2空气的压强为空气的压强为0.2-0.4Mpa
44、0.2-0.4Mpa3进入过滤器之前，空气的相对湿度进入过滤器之前，空气的相对湿度70%70%4进入发酵罐的空气温度可比培养温度高进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-3010-305压缩空气的压缩空气的洁净度洁净度一般以失败概率为一般以失败概率为1010-3-3为指标。为指标。43空气净化的方法：空气净化的方法：（1 1）热灭菌法：）热灭菌法：加热后微生物体内的加热后微生物体内的蛋白质热变性蛋白质热变性而死亡。而死亡。 空气在进入培养系统之前，一般需要空气在进入培养系统之前，一般需要经过压经过压缩机压缩，提高压力缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需，所以，空气热灭菌时所需要的温度，就
45、不必用蒸汽或其它载热体加热，而要的温度，就不必用蒸汽或其它载热体加热，而可可直接利用空气压缩时的温度提高来实现直接利用空气压缩时的温度提高来实现的，空的，空气经过压缩后气经过压缩后温度能够升到温度能够升到200200以上以上，保持一定，保持一定时间后，便可以实现干热灭菌。时间后，便可以实现干热灭菌。44（2 2）静电除菌法：）静电除菌法： 使用使用静电除尘器静电除尘器除去空气中的水雾尘埃等，除去空气中的水雾尘埃等，同时也除去空气的微生物。静电除菌是同时也除去空气的微生物。静电除菌是采用静电采用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。 悬浮于空气中的微生
46、物及孢子大多带有不同悬浮于空气中的微生物及孢子大多带有不同的电荷，不带电荷的微粒进入高压静电场时也会的电荷，不带电荷的微粒进入高压静电场时也会被电离成带电微粒，但对于被电离成带电微粒，但对于一些直径较小的微粒，一些直径较小的微粒，所带电荷少，微粒就不容易被吸附沉降所带电荷少，微粒就不容易被吸附沉降。45过滤过滤介质介质绝对过滤绝对过滤深度过滤深度过滤 介质的空介质的空隙小于被拦截隙小于被拦截的微生物大小，的微生物大小，如用如用聚四氟乙聚四氟乙烯烯或或纤维素酯纤维素酯材料做成的微材料做成的微孔滤膜。孔滤膜。 介质孔隙大于介质孔隙大于被拦截的微生物大被拦截的微生物大小，小，但介质有一定但介质有一定
47、厚度，机理是静电，厚度，机理是静电，扩散，惯性及拦截扩散，惯性及拦截作用。作用。 如棉花过如棉花过滤器，超细玻璃纤滤器，超细玻璃纤维纸，金属烧结管维纸，金属烧结管等。等。（3 3）介质过滤除菌）介质过滤除菌46玻璃纤维玻璃纤维活性炭活性炭棉花棉花47 介质过滤除菌法是采用定期灭菌干燥介质来阻介质过滤除菌法是采用定期灭菌干燥介质来阻截流过的空气所含的微生物，从而获得无菌的空气。截流过的空气所含的微生物，从而获得无菌的空气。 棉花棉花：未脱脂棉花，纤维直径为未脱脂棉花，纤维直径为16-20m16-20m， 其实密度为其实密度为1520Kg/m1520Kg/m3 3。填充率为。填充率为8.5-10%
48、8.5-10%。 玻璃纤维玻璃纤维：用用无碱的玻璃纤维无碱的玻璃纤维介质作为过滤介介质作为过滤介质。纤维直径为质。纤维直径为3-20m3-20m， 其实密度为其实密度为2600Kg/m2600Kg/m3 3。填充率为填充率为5-11%5-11%。 活性炭活性炭：常与纤维状介质分层堆放成过滤床。常与纤维状介质分层堆放成过滤床。 通过过滤器的气流速度一般为通过过滤器的气流速度一般为0.2-0.3m/s0.2-0.3m/s。3 3484.3.2.2 4.3.2.2 空气净化流程及提高过滤除菌的效率措施空气净化流程及提高过滤除菌的效率措施 空气净化过程中，要保持空气净化过程中，要保持深层介质过滤器深层
49、介质过滤器在在较高的效率下对空气进行过滤除菌，必须有：供较高的效率下对空气进行过滤除菌，必须有：供气设备（气设备（空气压缩机空气压缩机），对空气提供足够的能量；），对空气提供足够的能量；高效的过滤除菌设备（高效的过滤除菌设备（空气过滤器空气过滤器），以除去空），以除去空气中的微生物颗粒；一系列气中的微生物颗粒；一系列加热、冷却及分离和加热、冷却及分离和除杂的附属设备除杂的附属设备来保证。来保证。491 1）. .两级冷却，加热除菌流程两级冷却，加热除菌流程特点特点：两次冷却，两次分离，适当加热。两次冷却，两次分离，适当加热。 适应性广，充分分离油水，节约冷却水。适应性广，充分分离油水，节约冷却
50、水。502 2）. .冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程 特点：特点：省去第二冷却后的分离设备和空气再加省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，热设备， 流程比较简单，冷却水用量少。适用于中流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿度的地区。等湿度的地区。513 3）. .高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程522 2、提高过滤介质除菌效率的措施、提高过滤介质除菌效率的措施设计合理设计合理预处理设备预处理设备 选择合适选择合适净化流程净化流程保证进口保证进口空气的洁空气的洁净度。净度。降低空气降低空气相对湿度相对湿度保证过滤保证过滤介质干燥介质干燥合理空气
51、合理空气过滤器，除过滤器，除菌效率菌效率高的过滤高的过滤介质介质534.5 4.5 菌种的培养菌种的培养4.5.1 4.5.1 菌种的扩大培养菌种的扩大培养 菌种的扩大培养就是为每次发酵罐投料，提供菌种的扩大培养就是为每次发酵罐投料，提供相当数量的种子。相当数量的种子。4.5.2 4.5.2 发酵阶段的条件控制发酵阶段的条件控制 反映发酵过程变化的参数分为两类：一、反映发酵过程变化的参数分为两类：一、是可是可以直接采用特定的传感器检测的参数以直接采用特定的传感器检测的参数，如温度、罐，如温度、罐压、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液的黏度等称为压、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液的黏度等称为直接参数直接
52、参数；二、；二、难以用传感器检测到的数据难以用传感器检测到的数据，如细，如细胞的生长速率、产物生成情况等，称为胞的生长速率、产物生成情况等，称为间接参数间接参数。上述参数中，对发酵过程影响较大的上述参数中，对发酵过程影响较大的有营养浓度、有营养浓度、温度、溶氧、温度、溶氧、PHPH、泡沫、泡沫等。等。544.5.2.1 4.5.2.1 营养条件的控制营养条件的控制 （1 1）碳源和氮源之比）碳源和氮源之比 在发酵培养基的配制过程中，要严格控制好在发酵培养基的配制过程中，要严格控制好碳氮比、无机盐、维生素和金属离子的浓度的比碳氮比、无机盐、维生素和金属离子的浓度的比例例，其中碳氮比的影响最为明显
53、。如，其中碳氮比的影响最为明显。如谷氨酸发酵谷氨酸发酵碳氮比为碳氮比为4 4：1 1时，菌体大量繁殖，积累少量的谷时，菌体大量繁殖，积累少量的谷氨酸；而氨酸；而碳氮比为碳氮比为3 3：1 1时，则产生大量的谷氨酸，时，则产生大量的谷氨酸，菌体增殖受到抑制。菌体增殖受到抑制。生产上用控制碳氮比以满足生产上用控制碳氮比以满足菌体大量繁殖，同时又能促进谷氨酸的产量。菌体大量繁殖，同时又能促进谷氨酸的产量。55（2 2）补料）补料 在分批发酵中在分批发酵中糖过多，会造成细胞生长过旺，糖过多，会造成细胞生长过旺，供氧不足，产量低供氧不足，产量低。解决这一问题的方法是。解决这一问题的方法是间歇间歇或连续进
54、行补糖和补料或连续进行补糖和补料。如在发酵。如在发酵进入产物合成进入产物合成期时及时补料，可以延长产物合成的旺盛阶段，期时及时补料，可以延长产物合成的旺盛阶段，避免菌体过早衰老避免菌体过早衰老，也，也可控制可控制PHPH和代谢方向和代谢方向。如。如生产生产利福霉素利福霉素的过程中，根据还原糖的变化，中的过程中，根据还原糖的变化，中途加葡萄糖延长利福霉素的合成期。途加葡萄糖延长利福霉素的合成期。 补料方法可采用补料方法可采用一次大量补料或连续流加一次大量补料或连续流加的的方法。方法。561 1、温度的影响、温度的影响 温度对发酵的影响表现在影响温度对发酵的影响表现在影响酶的反应速率，酶的反应速率
55、，改变菌体代谢产物的合成方向改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代影响微生物的代谢调控机制；还影响到发酵液的黏度、氧在发酵谢调控机制；还影响到发酵液的黏度、氧在发酵过程中的溶解度过程中的溶解度，某些基质的分解和吸收速率等，某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。4.5.2.2 4.5.2.2 温度的影响及控制温度的影响及控制572 2、影响发酵温度的因素、影响发酵温度的因素 在在发酵过程中温度是不断变化的发酵过程中温度是不断变化的。发酵开始发酵开始微生物处于延迟期，释放热量少，应提高温度，微生物处于延迟期，释放热量少，
56、应提高温度，满足菌体生长的需要；当微生物进入满足菌体生长的需要；当微生物进入对数期对数期，菌，菌体进行呼吸作用和发酵作用，放出大量的热，温体进行呼吸作用和发酵作用，放出大量的热，温度剧烈上升；度剧烈上升；发酵后期发酵后期，呼吸和发酵作用逐渐缓，呼吸和发酵作用逐渐缓慢，释放热量少，温度下降。慢，释放热量少，温度下降。 在发酵过程中，引起温度变化的因素有在发酵过程中，引起温度变化的因素有生物生物热、搅拌热、通气热、蒸发热、辐射热和显热。热、搅拌热、通气热、蒸发热、辐射热和显热。发酵热发酵热是发酵过程中是发酵过程中释放出的净热量释放出的净热量。Q Q发酵发酵 = Q= Q生物生物 + Q+ Q搅拌搅
57、拌 + Q+ Q通气通气 - Q- Q蒸发蒸发 - Q- Q显显 Q Q辐射辐射58A A、生物热、生物热 （Q Q生物）生物） 在发酵过程中，菌体不断利用培养基中在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，的营养物质，将其分解氧化而产生的能量将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于其中一部分用于合成高能化合物提供细胞合合成高能化合物提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分，其余一部分以热的形式散发出来以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫，这散发出来的热就叫生物热。生物热。 这种热的主要来源是这种热的主要来源是培养基中的碳水培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白
58、质等化合物、脂肪和蛋白质等分解为二氧化碳、分解为二氧化碳、氨气、水和其他物质时释放出来的。氨气、水和其他物质时释放出来的。59B B、搅拌热：、搅拌热：在机械搅拌通气发酵罐中，由于在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦之间的摩擦，产，产生的热量。生的热量。 搅拌热受搅拌热受搅拌设备、搅拌方式和发酵液搅拌设备、搅拌方式和发酵液的粘度的粘度等影响。等影响。C C、通气热：、通气热：是指通入空气温度高于发酵液温是指通入空气温度高于发酵液温度时所产生的热量。通气热的大小，取决于度
59、时所产生的热量。通气热的大小，取决于通入的空气和发酵液的温度差和通气量。通入的空气和发酵液的温度差和通气量。60D D、蒸发热：、蒸发热：发酵液蒸发水分带走的热量。发酵液蒸发水分带走的热量。 空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所需的热量即为需的热量即为蒸发热蒸发热。E E、显热：、显热：发酵排气散发带走的热量。发酵排气散发带走的热量。F F、辐射热：、辐射热：由于由于罐内外的温差罐内外的温差，辐射带走的热量。，辐射带走的热量。因罐内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐因罐
60、内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。体向外辐射。 辐射热的大小决定于罐内外的温差、辐射热的大小决定于罐内外的温差、罐的表罐的表面积等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过面积等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的发酵热的5 5613 3、温度控制、温度控制 温度过高、过低均对微生物发酵不利。温度过高、过低均对微生物发酵不利。过高过高微生物很少繁殖并很快衰老死亡；过低微生物生微生物很少繁殖并很快衰老死亡；过低微生物生长缓慢，发酵时间很长长缓慢，发酵时间很长，所以发酵要在最适的温，所以发酵要在最适的温度下进行，但生长最适温度不一定是积累产物的度下进行，但生长最适温度不一定是积累
61、产物的最适温度。因此要控制好发酵各阶段的不同温度，最适温度。因此要控制好发酵各阶段的不同温度，使微生物大量生长繁殖，又可得到大量产物。使微生物大量生长繁殖，又可得到大量产物。 温度影响微生物生长的机理：温度影响微生物生长的机理： (1)(1)影响酶活性。影响酶活性。 (2)(2)影响细胞膜的流动性。影响细胞膜的流动性。 (3)(3)影响物质的溶解度。影响物质的溶解度。62温度对微生物发酵的影响温度对微生物发酵的影响1 1）温度影响产物合成的速率及产量）温度影响产物合成的速率及产量 从酶动力学来看，从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大，温度升高，反应速率加大，代谢加快，生产期提前；代谢加快，生
62、产期提前；但因酶本身很易因热而失但因酶本身很易因热而失去活性，去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。 温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物影响菌的生物合成合成。黑曲霉黑曲霉生长生长最适温度最适温度33-3733-37 ，积累柠檬酸积累柠檬酸的最适温度在的最适温度在3232 。632 2）温度可能会影响终产物的质量）温度可能会影响终产物的质量 例如
63、例如凝结芽孢杆菌合成凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶淀粉酶时，发酵温度时，发酵温度控制在控制在5555时时，合成的，合成的-淀粉酶耐高温淀粉酶耐高温，在，在9090、60min60min条件下，其活性丧失仅条件下，其活性丧失仅1010左右，而左右，而发酵温度发酵温度控制在控制在3535时时，合成的，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失淀粉酶在相同条件下丧失9090。3 3）温度还可能影响生物合成的方向）温度还可能影响生物合成的方向 例如：例如：四环素四环素发酵中发酵中金色链霉菌金色链霉菌同时能产生同时能产生金霉金霉素素。在。在低于低于3030下，该菌下，该菌合成金霉素能力较强合成金霉素能力较强；温；温度提高
64、，合成四环素的比例提高；在温度达到度提高，合成四环素的比例提高；在温度达到3535时，则只产生四环素时，则只产生四环素，金霉素的合成停止。，金霉素的合成停止。644.5.2.3 4.5.2.3 溶氧的影响及控制溶氧的影响及控制 1 1、溶解氧影响、溶解氧影响 由于氧在水中的溶解度很小，在培养基中的由于氧在水中的溶解度很小，在培养基中的溶解度更小，而溶解度更小，而微生物细胞只能利用溶解氧微生物细胞只能利用溶解氧，很，很少能直接从空气泡中获得氧，所以需要不断通风少能直接从空气泡中获得氧，所以需要不断通风和搅拌，才能满足发酵需氧的要求。和搅拌，才能满足发酵需氧的要求。 引起引起溶解氧异常升高的原因溶
65、解氧异常升高的原因：a a、菌体代谢出现异常菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶解氧上，耗氧能力下降，使溶解氧上升；升；b b、污染烈性噬菌体污染烈性噬菌体，产生菌未裂解前，呼吸受到抑，产生菌未裂解前，呼吸受到抑制，溶解氧可能迅速上升，到菌体破裂后，完全制，溶解氧可能迅速上升，到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶解氧直线上升。失去呼吸能力，溶解氧直线上升。65 发酵工艺中引起发酵工艺中引起溶解氧异常下降的原因溶解氧异常下降的原因有：有：1 1、污染好气性杂菌、污染好气性杂菌，大量的溶解氧被消耗掉，可能，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧短时间内降到零附近，如果杂菌本身好养使溶解氧短时间内降到零附
66、近，如果杂菌本身好养量不强，溶解氧变化可能也不明显；量不强，溶解氧变化可能也不明显；2 2、菌体代谢发生异常现象、菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶解，需氧要求增加，使溶解氧下降；氧下降；3 3、某些设备或工艺控制发生故障或变化某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引，也可能引起溶解氧下降。如搅拌速度变慢，影响供氧能力，起溶解氧下降。如搅拌速度变慢，影响供氧能力，也会使溶解氧迅速下降。也会使溶解氧迅速下降。662 2、溶解氧浓度的控制、溶解氧浓度的控制 发酵液的溶解氧浓度是由发酵液的溶解氧浓度是由供氧和需氧供氧和需氧两方两方面决定的。当供氧量大于需氧量时，溶解氧浓面决定的。当供氧量大于
67、需氧量时，溶解氧浓度上升，直至饱和；如需氧量大于供氧量，溶度上升，直至饱和；如需氧量大于供氧量，溶解氧浓度则下降。因此控制溶解氧浓度应从供解氧浓度则下降。因此控制溶解氧浓度应从供氧和需氧两个方面考虑。氧和需氧两个方面考虑。（1 1）影响供氧的因素）影响供氧的因素a a、增加空气中氧的含量增加空气中氧的含量，使氧分压增高；，使氧分压增高；b b、提高罐压力；提高罐压力；但同时会增加但同时会增加COCO2 2的溶解度影响的溶解度影响pHpH，可能会影响菌的代谢。，可能会影响菌的代谢。c c、调节通风速率；调节通风速率；d d、调节搅拌转速。调节搅拌转速。67（2 2）影响耗氧的因素）影响耗氧的因素
68、a a、菌龄影响耗氧：、菌龄影响耗氧：呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧能力自然减弱。菌体处于衰老状态，耗氧能力自然减弱。b b、培养基的成分和浓度显著影响耗氧：、培养基的成分和浓度显著影响耗氧：培养液营养培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵液浓度高，耗丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵液浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随着增大。量随着增大。C C、发酵条件影响耗氧：、发酵条件影响耗氧：在最适条件下发酵，耗氧量在最适条件下发酵，耗氧量大。大。68不同种类微生物，对不同种类微生物，
69、对pHpH要求不同；要求不同；酵酵 母：母：pH 3.8pH 3.86.06.0细细 菌：菌：pH 6.5pH 6.57.57.5霉霉 菌：菌：pH 4.0pH 4.06.06.0放线菌：放线菌：pH 7.0pH 7.08.08.04.5.2.4 PH4.5.2.4 PH的影响及控制的影响及控制1 1、PHPH的影响的影响 69pHpH不同，微生物不同，微生物代谢产物不同代谢产物不同 黑曲霉黑曲霉pHpH：2 23 3，柠檬酸发酵，柠檬酸发酵pHpH：7.07.0，草酸发酵，草酸发酵谷氨酸菌谷氨酸菌pHpH：7 78 8，谷氨酸谷氨酸发酵发酵pHpH：5.05.05.85.8，谷氨酰胺发酵，谷
70、氨酰胺发酵酿酒酵母酿酒酵母pHpH：4.5-7.04.5-7.0，乙醇发酵，乙醇发酵pHpH：8.08.0，甘油发酵，甘油发酵70微生物生长和发酵的最适宜微生物生长和发酵的最适宜pHpH可能不同。可能不同。丙酮丁醇菌丙酮丁醇菌生长：生长：pH 5.5pH 5.57.0;7.0;发酵：发酵：pH 4.3-5.3;pH 4.3-5.3;链霉素菌链霉素菌生长：生长： pH 6.3-6.9pH 6.3-6.9发酵：发酵： pH 6.7-7.3pH 6.7-7.3青霉素菌青霉素菌生长：生长：pH 6.5-7.2pH 6.5-7.2发酵：发酵：pH 6.2-6.8pH 6.2-6.871a a、影响酶的活
71、性，、影响酶的活性，当当pHpH值值抑制抑制菌体中菌体中某些酶的活某些酶的活性时性时，会阻碍菌体的新陈代谢；，会阻碍菌体的新陈代谢；b b、影响微生物细胞膜所带电荷的状态、影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；谢产物的排泄；c c、影响培养基中某些组分的解离；、影响培养基中某些组分的解离；d d、pHpH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使，使代谢产物的质量和比例发生改变。代谢产物的质量和比例发生改变。pHpH值对发酵的影响值对发酵的影响722 2、
72、发酵过程中、发酵过程中pHpH值的调节及控制值的调节及控制最适最适pHpH值的确定：值的确定：根据实验结果根据实验结果 不同的不同的pHpH值出发进行发酵，发酵过程中定时值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节测定和调节pHpH值以维持出发值以维持出发pHpH值，或者利用缓冲液值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的菌体生长达到最高值的pHpH值为生长最适值为生长最适pHpH。 同样的方法可测得同样的方法可测得产物合成的最适产物合成的最适pHpH值值。但。但同一产物的最适同一产物的最适pHpH值，还与所用的菌
73、种、培养基组值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。成和培养条件有关。73在发酵过程中使在发酵过程中使pHpH稳定在最适合的范围的方法稳定在最适合的范围的方法1 1、在设计培养基时考虑到维持、在设计培养基时考虑到维持pHpH的需要。的需要。选择合适选择合适的营养物和适当的配比，使发酵过程中的的营养物和适当的配比，使发酵过程中的pHpH维持在维持在合适的范围。合适的范围。2 2、生理酸性和生理碱性物质的利用。、生理酸性和生理碱性物质的利用。中和代谢过程中和代谢过程中产生的碱或酸，以维持一定的中产生的碱或酸，以维持一定的pHpH。3 3、缓冲液的利用。、缓冲液的利用。在培养基中加入碳酸钙或磷
74、酸盐，在培养基中加入碳酸钙或磷酸盐，可以减缓发酵液中可以减缓发酵液中pHpH的变化。的变化。4 4、通过中间补料控制、通过中间补料控制pHpH。通过补加糖、玉米浆、氨通过补加糖、玉米浆、氨水以及通氨等来调节发酵过程的水以及通氨等来调节发酵过程的pHpH变化。变化。744.5.2.5 4.5.2.5 发酵过程中泡沫的影响和控制发酵过程中泡沫的影响和控制 微生物在深层培养过程中由于微生物在深层培养过程中由于通风和搅拌、通风和搅拌、代谢气体的逸出以及培养基中糖、蛋白质、代谢代谢气体的逸出以及培养基中糖、蛋白质、代谢物等稳定泡沫的活性物质物等稳定泡沫的活性物质存在，使发酵液中产生存在，使发酵液中产生大
75、量的泡沫。大量的泡沫。 泡沫产生的原因：泡沫产生的原因：1 1、强、强通风搅拌而造成的泡沫通风搅拌而造成的泡沫；2 2、培养基某些成分如蛋白胨、玉米浆等主要的、培养基某些成分如蛋白胨、玉米浆等主要的发泡发泡物质所产生。物质所产生。3 3、代谢产生的气体代谢产生的气体也能产生泡沫。也能产生泡沫。751 1、泡沫的影响、泡沫的影响 这些泡沫的存在可以这些泡沫的存在可以增加气液接触面积，增加增加气液接触面积，增加氧传递的速率。氧传递的速率。但也给发酵带来但也给发酵带来不利不利的影响。的影响。1 1）干扰通气；）干扰通气；2 2）妨碍菌体的生长和代谢；）妨碍菌体的生长和代谢；3 3）菌体得不到必要的溶
76、解氧，也影响二氧化碳的排）菌体得不到必要的溶解氧，也影响二氧化碳的排除；除；4 4）引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，增加了染）引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，增加了染菌的机会；菌的机会；5 5）泡沫传热差，造成灭菌不彻底；）泡沫传热差，造成灭菌不彻底；6 6）泡沫的表面张力会引起产生的酶失活。）泡沫的表面张力会引起产生的酶失活。762 2、泡沫的控制、泡沫的控制泡沫的控制，可以采用三种途径：泡沫的控制，可以采用三种途径： 调整培养基中的成分调整培养基中的成分( (如少加或缓加易起泡的原如少加或缓加易起泡的原材料材料) )或或改变某些物理化学参数改变某些物理化学参数( (如如pHpH值、温度
77、、值、温度、通气和搅拌通气和搅拌) )或者或者改变发酵工艺改变发酵工艺( (如采用分次投料如采用分次投料) )来控制来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。效果有一定的限度。77 采用采用机械消泡或消泡剂消泡机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已这两种方法来消除已形成的泡沫：形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭张力，使泡沫破灭；利用物理方法，；利用物理方法，使泡沫液膜的使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。 采用菌种选育的方法采用菌种选
78、育的方法，筛选不产生泡沫的菌种，筛选不产生泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素，如：杂交选育不产泡沫的来消除起泡的内在因素，如：杂交选育不产泡沫的土霉素生产菌株。土霉素生产菌株。 对于已形成的泡沫，工业上可以采用对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消机械消泡和化学消泡剂消泡泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡。或两者同时使用消泡。78化学消泡法化学消泡法1 1、消泡机理、消泡机理1 1）降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂。）降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂。2 2）降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。泡沫破裂。 当泡沫表层存在着由极性的表面活性物
79、质形当泡沫表层存在着由极性的表面活性物质形成的成的双电层双电层时，可以加入另一种具有时，可以加入另一种具有相反电荷相反电荷的的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空间，些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空间，降低液膜强度降低液膜强度，使泡沫破裂。，使泡沫破裂。 当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可以加当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜黏度。入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜黏度。79常用的一些消泡剂常用的一些消泡剂：v天然油脂天然油脂：常用豆油、玉米油、米糠油：
80、常用豆油、玉米油、米糠油 。v高碳醇、脂肪酸和酯类：高碳醇、脂肪酸和酯类：十八醇是常用的一种，十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。它可以单独或与载体一起使用。v v聚醚类；聚醚类；v硅酮类；硅酮类；主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，无色无色液体，不溶于水液体，不溶于水。纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，。纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散剂来提高消泡活性。常加分散剂来提高消泡活性。80 化学消泡最显著的缺点是化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解影响氧气的溶解，使其减少使其减少1/31/31/51/5，这对微生物供氧极为不利；，这对微生物供氧极为不利；机械消
81、泡能克服这一缺点，但机械消泡能克服这一缺点，但其应用效果不如化其应用效果不如化学消泡迅速可靠学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起稳定泡，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。沫的因素。 机械消泡是依靠物理学原理，机械消泡是依靠物理学原理，即通过机械力即通过机械力引起强烈振动或压力变化，使泡沫破裂。引起强烈振动或压力变化，使泡沫破裂。v优点：优点：不需外加物质；节省原材料；减少污染机不需外加物质；节省原材料；减少污染机会。会。v缺点：缺点：不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因。不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因。 物理消泡法物理消泡法814.6 4.6 发酵过程中的检验发酵过程中的检验 发酵生产中必
82、须建立一套检验常规，检验的具发酵生产中必须建立一套检验常规，检验的具体项目随不同发酵产品而有所不同，经常检验的项体项目随不同发酵产品而有所不同，经常检验的项目有：目有：4.6.1 4.6.1 生物学检验生物学检验 一般是用显微镜观察菌体形态的变化以及无菌一般是用显微镜观察菌体形态的变化以及无菌检查。检查。1.1.菌体的观察和吸光度测定菌体的观察和吸光度测定 用显微镜检查用显微镜检查各个发酵阶段的菌体形态各个发酵阶段的菌体形态，同时，同时对菌体的生长情况进行吸光度测定。例如，枯草芽对菌体的生长情况进行吸光度测定。例如，枯草芽孢杆产生蛋白酶发酵过程中的孢杆产生蛋白酶发酵过程中的发酵初期，只有营养发
83、酵初期，只有营养体体，随后芽孢逐渐增多，到，随后芽孢逐渐增多，到发酵后期芽孢达细胞总发酵后期芽孢达细胞总82 数的数的9595以上以上，吸光度不再升高，糖也消耗完，应停，吸光度不再升高，糖也消耗完，应停止发酵。止发酵。2 2、无菌检查、无菌检查 为及时发现杂菌，以便采取有效的措施，对每次为及时发现杂菌，以便采取有效的措施，对每次无菌取样的发酵液必须进行无菌检查。无菌取样的发酵液必须进行无菌检查。4.6.2 4.6.2 生化检验生化检验1 1、残糖的测定、残糖的测定 发酵过程中糖量变化，可以衡量发酵是否正常。发酵过程中糖量变化，可以衡量发酵是否正常。糖消耗越快，说明生长越旺盛，但只有糖份下降，而
84、糖消耗越快，说明生长越旺盛，但只有糖份下降，而无发酵产物的增加，应该考虑是否有杂菌污染无发酵产物的增加，应该考虑是否有杂菌污染。残糖。残糖测定可作为分批发酵的终点的指标之一，一般认为测定可作为分批发酵的终点的指标之一，一般认为残残糖下降到糖下降到0.50.5以下以下则发酵是彻底的。则发酵是彻底的。83 糖测定方法有糖测定方法有物理法和化学法物理法和化学法。2 2、含氮量测定、含氮量测定 发酵过程中一般变化不大，一般不测，但某发酵过程中一般变化不大，一般不测，但某些产品如些产品如石油脱蜡石油脱蜡等发酵中氮源消耗是判断发酵等发酵中氮源消耗是判断发酵旺盛或衰败的一个主要标志之一，必须要测定。旺盛或衰
85、败的一个主要标志之一，必须要测定。3 3、发酵目的产物的测定、发酵目的产物的测定 如发酵目的物已不再上升，结合碳源已接近如发酵目的物已不再上升，结合碳源已接近耗尽，菌体衰老自溶，温度不在上升，就耗尽，菌体衰老自溶，温度不在上升，就可以停可以停止发酵止发酵。844.6.3 4.6.3 杂菌和噬菌体的污染、防治和挽救杂菌和噬菌体的污染、防治和挽救4.6.3.1 4.6.3.1 杂菌污染的检查杂菌污染的检查1 1、平板划线法、平板划线法2 2、液体培养基检查法、液体培养基检查法3 3、显微镜检查法、显微镜检查法4.6.3.2 4.6.3.2 噬菌体污染的检查噬菌体污染的检查 发酵过程中除容易遭杂菌污
86、染外，发酵过程中除容易遭杂菌污染外，还常被噬菌还常被噬菌体污染。体污染。如谷氨酸发酵过程中的种子或发酵罐污染如谷氨酸发酵过程中的种子或发酵罐污染噬菌体一般都在对数期。此时，噬菌体一般都在对数期。此时，发酵液泡沫增多，发酵液泡沫增多，pHpH升高，吸光度不增加，二氧化碳下降，耗糖慢或升高，吸光度不增加，二氧化碳下降，耗糖慢或停止。停止。显微镜下发现菌体数量显著减少，形态变粗显微镜下发现菌体数量显著减少，形态变粗85 染色不均匀，细胞壁不整齐，菌体逐渐裂解后出现染色不均匀，细胞壁不整齐，菌体逐渐裂解后出现碎片，碎片，发酵液发黏，完整菌体很少发酵液发黏，完整菌体很少，这时怀疑有噬，这时怀疑有噬菌体污
87、染。菌体污染。 检测方法：检测方法：a a、培养法：、培养法：发酵液样品离心后，取上清液，取发酵液样品离心后，取上清液，取0.1ml0.1ml置于无菌培养皿内，另取新鲜对数期内的生产菌液置于无菌培养皿内，另取新鲜对数期内的生产菌液0.2ml0.2ml于之接触，然后倒入固体培养基中培养后观于之接触，然后倒入固体培养基中培养后观察是否有噬菌体。察是否有噬菌体。b b、载玻片法、载玻片法：将被检查样品和菌液与含有：将被检查样品和菌液与含有0.80.8琼脂琼脂的培养基混合，涂于无菌载玻片上，凝固后，经数的培养基混合，涂于无菌载玻片上，凝固后，经数小时培养，在显微镜下放大观察噬菌体是否存在。小时培养，在
88、显微镜下放大观察噬菌体是否存在。864.6.3.3 4.6.3.3 杂菌污染和防治杂菌污染和防治1 1、造成杂菌污染的原因、造成杂菌污染的原因a a、设备结构不严密；、设备结构不严密；b b、空气过滤不彻底，带有杂菌；、空气过滤不彻底，带有杂菌；c c、种子不纯，带有杂菌；、种子不纯，带有杂菌； d d、原料灭菌不彻底；、原料灭菌不彻底；e e、环境不卫生、环境不卫生等。等。2 2、污染的防治、污染的防治a a、防止种子带入杂菌；、防止种子带入杂菌；87b b、培养基的彻底灭菌；、培养基的彻底灭菌；c c、防止空气系统染菌；、防止空气系统染菌；d d、注意环境卫生，建立卫生制度。、注意环境卫生
89、，建立卫生制度。4.6.3.4 4.6.3.4 噬菌体污染的防治噬菌体污染的防治 噬菌体污染的防治的主要是噬菌体污染的防治的主要是选育抗噬菌体的选育抗噬菌体的菌株。菌株。发酵过程中要注意以下事项：发酵过程中要注意以下事项：A A、严禁活菌体排放；、严禁活菌体排放；B B、建立经常性的环境卫生制度；、建立经常性的环境卫生制度；C C、把握种子关，严防噬菌体进入种子罐和发酵罐；、把握种子关，严防噬菌体进入种子罐和发酵罐；88D D、合理布置车间；、合理布置车间；E E、利用药物防治。、利用药物防治。4.6.3.5 4.6.3.5 杂菌和噬菌体污染后的挽救杂菌和噬菌体污染后的挽救 污染后的污染后的挽
90、救措施挽救措施主要根据污染的原因分析，主要根据污染的原因分析，尽可能避免污染扩大，节约原材料，争取得到产尽可能避免污染扩大，节约原材料，争取得到产品品。 种子扩大培养种子扩大培养过程中发现污染就应过程中发现污染就应放弃种子放弃种子；89 发酵早期发酵早期发现染菌时，可采用发现染菌时，可采用接入大量种子，接入大量种子，使生产菌占绝对优势使生产菌占绝对优势，抵制杂菌的繁殖；或立即，抵制杂菌的繁殖；或立即将发酵液灭菌重新接种；将发酵液灭菌重新接种； 发酵后期发酵后期染菌，而杂菌又不影响生产菌的正染菌，而杂菌又不影响生产菌的正常发酵，也不妨碍产品后处理，则让其共生长；常发酵，也不妨碍产品后处理，则让其
91、共生长；如果如果杂菌影响发酵的正常进行或产品的后处理，杂菌影响发酵的正常进行或产品的后处理，应提前放罐应提前放罐；还可以在发酵液中加入抑制杂菌的；还可以在发酵液中加入抑制杂菌的物质。物质。 90 发酵前期污染噬菌体发酵前期污染噬菌体应停止搅拌、小通风，应停止搅拌、小通风，立即培养抗性菌株，接入发酵罐，或更换生产菌立即培养抗性菌株，接入发酵罐，或更换生产菌种；在罐内种；在罐内用夹层加热至用夹层加热至70-8070-80，因噬菌体不耐，因噬菌体不耐热，加热可杀死发酵液内的噬菌体，冷却后，接热，加热可杀死发酵液内的噬菌体，冷却后，接入入2 2倍的原菌种，倍的原菌种，PHPH正常后再搅拌。正常后再搅拌
92、。 发酵初期发现感染噬菌体发酵初期发现感染噬菌体，可以利用噬菌体，可以利用噬菌体只能在生长阶段的细胞中繁殖的特点，将发酵正只能在生长阶段的细胞中繁殖的特点，将发酵正常并已培养到对数期的发酵液加入感染噬菌体的常并已培养到对数期的发酵液加入感染噬菌体的发酵液中，以等体积混合后再发酵。发酵液中，以等体积混合后再发酵。914.7 4.7 发酵培养方法发酵培养方法 微生物发酵过程可分为微生物发酵过程可分为分批发酵、连续发酵、分批发酵、连续发酵、补料分批发酵、混菌发酵、高密度发酵补料分批发酵、混菌发酵、高密度发酵及与产物及与产物回收结合的透析发酵、滤膜发酵等方法。回收结合的透析发酵、滤膜发酵等方法。 不同
93、的发酵技术各有其优缺点，了解生产菌不同的发酵技术各有其优缺点，了解生产菌在不同的发酵培养方法下细胞的生长、代谢和产在不同的发酵培养方法下细胞的生长、代谢和产物的变化规律，有助于发酵生产的有效控制。物的变化规律，有助于发酵生产的有效控制。924.7.1 4.7.1 分批发酵分批发酵 1.1.概念：概念：在一个密闭系统内投入在一个密闭系统内投入有限数量的营有限数量的营养物质养物质后，后，然后然后接入少量的微生物菌种接入少量的微生物菌种进行进行培养，在特定的条件下只完成一个生长周期培养，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。的微生物培养方法。2.2.特点：特点：（1 1）整个培养系统与外
94、界没有其它物质交换；）整个培养系统与外界没有其它物质交换；（2 2）整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法。方法。93特点特点 分批发酵过程一般可分为四个时期，即分批发酵过程一般可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期延迟期、对数期、稳定期和衰亡期；也可以；也可以分为六期：分为六期：延迟期、加速期、对数期、减速延迟期、加速期、对数期、减速期、静止期和衰亡期期、静止期和衰亡期。94停滞期停滞期vA A 现现象象：刚刚接接种种后后一一段段时时间间，细细胞胞数数目目和和菌菌量量不不变
95、变，曲线平行于横轴。曲线平行于横轴。v。vB.B.原原因因：由由于于细细胞胞进进入入新新环环境境, ,细细胞胞数数目目无无增增长长，甚甚至至有有所所下下降降有有一一个个适适应应过过程程，进进行行大大量量的的酶酶的的生生成成。v vC.C.细细胞胞特特点点: :细细胞胞的的新新陈陈代代谢谢非非常常旺旺盛盛，个个体体体体积积显著增大，但不分裂繁殖，为细胞分裂作准备。显著增大，但不分裂繁殖，为细胞分裂作准备。95D.D.此期长短：此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培与菌种遗传特性、菌龄、接种量、培养条件有关。养条件有关。E.E.意义：意义：在发酵工作中，缩短迟缓期的措施：在发酵工作中，缩短迟缓
96、期的措施：1 1）加大接种量（群体优势）加大接种量（群体优势-适应性增强）；适应性增强）；2 2）用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）；）用对数期的种子（此时细胞分裂旺盛）；3 3）调调整整培培养养基基的的成成分分，使使种种子子基基含含有有发发酵酵培培养养基基的的成分；成分；4 4）选用繁殖快的菌种。）选用繁殖快的菌种。96加速期加速期 在延滞期后对数期前，在延滞期后对数期前，细胞生长速率细胞生长速率逐渐加快逐渐加快，进入短的加速期。此菌已完全，进入短的加速期。此菌已完全适应周围的环境，由于有充足的营养，而适应周围的环境，由于有充足的营养，而且没有抑制生长的有害物质，且没有抑制生长的有害物质，菌
97、体开始大菌体开始大量繁殖，很快进入对数期量繁殖，很快进入对数期。97对数期1. 1. 现象：现象：又称指数期，生长迅速，细胞数目又称指数期，生长迅速，细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。系。2.2.细胞特点：细胞特点：此时此时细胞的大小、形态、染色细胞的大小、形态、染色性、生理特征等均趋于一致性、生理特征等均趋于一致，代谢活跃，代谢活跃，对外界环境因素的作用敏感。生长速率高，对外界环境因素的作用敏感。生长速率高，代时稳定。研究细菌的性状时应选用该期代时稳定。研究细菌的性状时应选用该期的细菌。的细菌。98减速期减速期 随着随着营养成分的减少、有害代
98、谢产物的营养成分的减少、有害代谢产物的积累积累，生长速度明显放慢生长速度明显放慢。虽然细胞总数。虽然细胞总数仍在增加，但是细胞的比生长速率开始下仍在增加，但是细胞的比生长速率开始下降，细胞在代谢与形态方面逐渐衰退，经降，细胞在代谢与形态方面逐渐衰退，经短时间的减速后进入静止期。短时间的减速后进入静止期。99静止期静止期A.A.现象：现象：活菌数目不增不减，生长速率趋于活菌数目不增不减，生长速率趋于0,0,曲线有一下降的趋势。曲线有一下降的趋势。B.B.细细胞胞特特点点: : 有有害害物物增增加加，死死亡亡数数增增加加，细细菌菌的的芽芽胞胞、外外毒毒素素和和抗抗生生素素等等代代谢谢产产物物在在此
99、此期期产产生生，细细胞胞内内开开始始贮贮藏藏物物质质。稳稳定定期期细胞数目及产物积累达到最高。细胞数目及产物积累达到最高。100衰退期衰退期A A 现现象象：细细胞胞死死亡亡速速率率 生生长长速速率率。一一般般总总菌数不变菌数不变, ,活菌数曲线下降。活菌数曲线下降。B B 特点：特点： 死死菌菌数数多多于于活活菌菌数数，菌菌体体变变形形，大大小小不一，细胞出现自溶不一，细胞出现自溶, ,生理代谢活动停滞。生理代谢活动停滞。 所所有有的的发发酵酵产产品品必必须须在在进进入入死死亡亡期期以以前结束发酵。前结束发酵。101分批培养的优缺点分批培养的优缺点优点优点: : 操作简单，周期短，染菌机会少
100、，生产过程操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。和产品质量容易掌握。缺点缺点: : 产率低。劳动强度大，而且每批发酵的结果产率低。劳动强度大，而且每批发酵的结果都不完全一样，对分离提纯造成了困难。都不完全一样，对分离提纯造成了困难。 但由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主但由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主要方式。要方式。1021. 1. 概念：概念： 微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态下生长的发酵方式。物细胞在近似
101、恒定状态下生长的发酵方式。2. 2. 特点：特点： 连续发酵可使发酵罐内的连续发酵可使发酵罐内的液量维持恒定液量维持恒定，微生，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效的物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效的延长分延长分批培养中的对数期批培养中的对数期。在恒定的状态下，微生物所处。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件如营养浓度、产物浓度、的环境条件如营养浓度、产物浓度、pHpH、微生物细、微生物细胞的浓度以及生长速率等可以始终维持不变胞的浓度以及生长速率等可以始终维持不变。4.7.2 连续发酵103 恒化连续恒化连续发酵发酵中中控制适当的流速，使细胞控制适当的流速，使细胞消耗的营养及时得到补充
102、消耗的营养及时得到补充，恒化器中的，恒化器中的营养组营养组成基本恒定成基本恒定，从而保持细胞的恒定生长速率。，从而保持细胞的恒定生长速率。 恒浊连续恒浊连续发酵发酵中，中，不断调节流入和流出的不断调节流入和流出的速度，速度，保持培养液中的保持培养液中的浊度基本不变浊度基本不变。连续发酵的类型连续发酵的类型据控制方法据控制方法恒化连续发酵恒化连续发酵 恒浊连续发酵恒浊连续发酵104 多个发酵罐串联起来，前一罐的出料作为下一多个发酵罐串联起来，前一罐的出料作为下一罐的进料；多级串联可以提高生产能力。罐的进料；多级串联可以提高生产能力。 多级连续培养特别适用于细胞生长和产物合成多级连续培养特别适用于
103、细胞生长和产物合成的最佳条件不同的情况。的最佳条件不同的情况。 例如用例如用葡萄糖葡萄糖- -乳糖培养基乳糖培养基培养生产培养生产 - -半乳糖苷半乳糖苷酶酶时，葡萄糖有利于菌体的生长，而酶的生产则受时，葡萄糖有利于菌体的生长，而酶的生产则受半乳糖的诱导，但葡萄糖又对半乳糖的利用产生阻半乳糖的诱导，但葡萄糖又对半乳糖的利用产生阻遏作用。根据这一特点，靠采用二级连续培养。第遏作用。根据这一特点，靠采用二级连续培养。第一级用葡萄糖作为碳源，以获得大量菌体，第二级一级用葡萄糖作为碳源，以获得大量菌体，第二级加入半乳糖，促进酶的生产。加入半乳糖，促进酶的生产。据级数据级数单级连续单级连续发酵发酵多级连
104、续多级连续发酵发酵105连续培养连续培养的优缺点的优缺点优点优点: :1 1）可以保持恒定的操作条件，有利于微生物的生长代）可以保持恒定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使谢，从而使产率和产品质量保持稳定产率和产品质量保持稳定；2 2）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量提高设备的利用率和单位时间产量；3 3）发酵中各参数趋于恒值，）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制便于自动控制；4 4）易于分期控制易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件；，可以在不同罐中控制不同的条件；5 5）大
105、规模的分批发酵，需要大型的后处理设备，而连）大规模的分批发酵，需要大型的后处理设备，而连续发酵中，一次收获只获得少量发酵液，下游所需续发酵中，一次收获只获得少量发酵液，下游所需的的设备规模也可相应减少设备规模也可相应减少。106缺点缺点: : a a、长期连续培养会、长期连续培养会引起菌种退化引起菌种退化，降低产量，降低产量，染菌机会增加。染菌机会增加。b b、黏性丝状菌黏性丝状菌容易附着在器壁上生长和在发容易附着在器壁上生长和在发酵液内结成团，给连续发酵操作带来困难。酵液内结成团，给连续发酵操作带来困难。1074.7.3 4.7.3 补料分批培养补料分批培养 介于分批培养和连续培养之间的操作
106、方法。介于分批培养和连续培养之间的操作方法。1.1.概念：概念：根据菌体生长和初始培养基的特点，根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段在分批培养的某些阶段适当补加培养基适当补加培养基，使菌，使菌体或其代谢产物的体或其代谢产物的生产时间延长生产时间延长。2.2.补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点 优点：优点： (1)(1)解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应。应。 (2) (2)延长次级代谢产物的生产时间。延长次级代谢产物的生产时间。108 (3) (3)可以达到高密度细胞培养；可以达到高密度细胞培养； (4) (4)稀释有毒代谢产物、降低污染和
107、避免遗稀释有毒代谢产物、降低污染和避免遗传不稳定性。传不稳定性。 缺点：缺点： (1) (1)由于没有物料取出，产物的积累最终导由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。致比生产速率的下降。 (2) (2)由于物料的加入增加了染菌机会。由于物料的加入增加了染菌机会。 1091 1）细胞的高密度培养）细胞的高密度培养v 一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底物浓度会抑制菌体的生长；过高的底物浓度会抑制菌体的生长；v 采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很高的
108、程度，反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很高的程度，如如大肠杆菌浓度可达大肠杆菌浓度可达145g/L145g/L。2 2）发生底物抑制的过程）发生底物抑制的过程 一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生长产生抑制。长产生抑制。补料分批培养应用补料分批培养应用110 以某些很容易被微生物利用的物质（如葡以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；胞某些酶的合成受到阻遏； 采用
109、补料的手段采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器将葡萄糖逐渐加入反应器中，使发酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免中，使发酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代谢物的积累，从而可以有效去阻遏。分解代谢物的积累，从而可以有效去阻遏。3 3）分解代谢物阻遏）分解代谢物阻遏1114 4）营养缺陷型菌株的培养）营养缺陷型菌株的培养 一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需；须补充其不能合成的物质供生产所需； 但这些物质过量存在时，可能产生反馈
110、抑制或阻但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。遏作用，影响产物的合成。 采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，有助于提高产物的生产。有助于提高产物的生产。112补料方式补料方式间歇添加营养物质后，其在发酵液中的浓间歇添加营养物质后，其在发酵液中的浓度即会上升，然后随着微生物的利用又下度即会上升，然后随着微生物的利用又下降；再次补入料液后，营养物质浓度再次降；再次补入料液后，营养物质浓度再次升高，然后再次下降，呈现较大的波动。升高，然后再次下降，呈现较大的波动。间歇添加法间歇添加法连续流加法连续流加法恒速流加恒速流加
111、(constant-flow rate)(constant-flow rate)指数流加指数流加 (exponential-flow (exponential-flow rate)rate) 恒速流加操作的恒速流加操作的补料速度是定值补料速度是定值，操，操作简便，设备简单；作简便，设备简单； 最常用；最常用； 发酵液体积呈线性增长发酵液体积呈线性增长；由于在指数；由于在指数生长期，微生物的底物消耗也呈指数增加，生长期，微生物的底物消耗也呈指数增加，恒速流加不能维持底物浓度不变，底物浓恒速流加不能维持底物浓度不变，底物浓度会随时间延长而逐渐降低。度会随时间延长而逐渐降低。1134.7.4 4.7
112、.4 混菌发酵混菌发酵 混菌发酵混菌发酵也称混菌培养，是指也称混菌培养，是指多种微生物混多种微生物混合在一起共同利用一种培养基进行的发酵合在一起共同利用一种培养基进行的发酵。 混菌发酵的混菌发酵的菌种和数量大都是未知菌种和数量大都是未知的，必须的，必须通过培养基组成和发酵条件控制才能顺利进行。通过培养基组成和发酵条件控制才能顺利进行。 混菌发酵可以利用混菌发酵可以利用多个菌种的不同代谢能力多个菌种的不同代谢能力的组合的组合，完成单个菌难以完成的复杂代谢作用，完成单个菌难以完成的复杂代谢作用，可代替某些重组工程菌来进行复杂的多种代谢反可代替某些重组工程菌来进行复杂的多种代谢反应，应，提高生产能力
113、。提高生产能力。1144.8 4.8 发酵设备发酵设备 发酵设备是发酵工厂中主要的设备，它必需发酵设备是发酵工厂中主要的设备，它必需具备适应具备适应微生物生命活动和形成产物的各种条件，微生物生命活动和形成产物的各种条件，促进微生物新陈代谢，使之能在低消耗下获得较促进微生物新陈代谢，使之能在低消耗下获得较高的产量高的产量。 由于由于微生物分厌氧和通风两大类微生物分厌氧和通风两大类，故供微生，故供微生物生存和代谢的生产设备也就各不相同。物生存和代谢的生产设备也就各不相同。 不论厌氧或通风发酵设备，不论厌氧或通风发酵设备，除了满足微生物除了满足微生物培养所必要的工艺要求外，还得考虑材质的要求培养所必要的工艺要求外，还得考虑材质的要求以及加工制造难易程度等因素。以及加工制造难易程度等因素。115
