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1、猪猪伪狂犬病防控探狂犬病防控探讨-临床床应用篇用篇/主任主任150662538122017年年8月月22日日个人介个人介绍1、预防兽医学博士，师从童光志所长、李一经院长和田志军研、预防兽医学博士，师从童光志所长、李一经院长和田志军研究员；究员；2、从事高致病性蓝耳病、从事高致病性蓝耳病HuN4-F112的研制及大量的临床试验工的研制及大量的临床试验工作；作；3、参加国家中长期项目（、参加国家中长期项目（2008-2020），猪瘟和），猪瘟和伪狂犬伪狂犬净化工净化工作；作；2011年所在年所在团队最早最早发现了猪了猪伪狂犬狂犬变异株，并开展疫苗的研异株，并开展疫苗的研制和制和伪狂犬疾病的防控工作
2、狂犬疾病的防控工作国际首次报道IF 7.327国内首次报道Virulent Pseudorabies virus (vPRV) （超强毒）Pseudorabies Virus Variant（变异株）p目前主要从事猪病的临床防控及实验室诊断工作擅长的领域：猪场的免疫程序评估及调整猪疫苗评估的动物实验设计病毒性疾病诊断及综合防控p每个猪场都面临伪狂犬感染的威胁p不同猪场和感染的不同阶段的表现p如何通过实验室确诊和防控伪狂犬p如何科学地发挥伪狂犬疫苗的作用p伪狂犬“五步法转阴”及注意事项主要内容主要内容一、每个猪一、每个猪场都面都面临伪狂犬感染的威狂犬感染的威胁伪狂犬病毒的特性：1、病毒对外界的抵
3、抗力强从发病猪排泄的病毒，37 10天，25 40天，15 120天仍存活；2、伪狂犬的中间宿主多，散毒方式多样猪最具耐受性，是自然界病毒唯一的贮存宿主。此外，牛、羊、马、狗、猫、鼠等都能被伪狂犬病毒感染并散毒体内可在多个脏器内繁殖，繁殖快。散毒途径多样，可通过唾液、精液等方式散毒自然感染的途径：经鼻感染和经口感染空气传播老鼠的传播苍蝇的传播虱子传播妊娠猪感染给胎儿的途径：交配时感染病毒的持续感染通过白血球传送病毒（病毒血症时间短，很难检测到）通过神经节传播，很难防控p病毒在初感染部位的鼻粘膜，咽喉头粘膜，扁桃繁殖，其次在其附近的淋巴结繁殖。p在上部呼吸道繁殖的病毒借助三叉神经，嗅觉神经，舌咽
4、神经到达中枢神经，引起脑炎。p增殖的病毒如果到达肺部，在肺部迅速繁殖，引起肺炎。少量的病毒即可感染少量的病毒即可感染大量排毒大量排毒潜伏感染潜伏感染隐性感染隐性感染3、病毒在猪体内的特征：、病毒在猪体内的特征：接种病毒量和感染成立（接种病毒量和感染成立（岛田，田，2006）接种量猪头数发热（日数）ELISA抗体价1.1 Log105-0.0082.1 Log104+（3）0.5264.1 Log104+（5.5）0.6946.1 Log104+（7.3）0.8188.1 Log103+（5.3）0.784伪狂犬病毒的最低感染狂犬病毒的最低感染剂量只有猪量只有猪蓝耳的耳的1/30注：任何疾病都有
5、感染的最小剂量，低于最小剂量后猪不会感染，更不会发病；仔猪感染后短仔猪感染后短时间内会呈百万倍地排毒内会呈百万倍地排毒PRV接种后病毒分离阳性率及病毒排泄量（岛田，2006）接毒后天数阳性率（%）12345678910NIA-2株鼻腔5/55/55/55/53/34/42/23/32/22/397口腔5/55/55/54/53/33/42/23/32/23/383直肠2/52/51/51/50/31/40/21/30/21/321膣/包皮1/53/52/53/50/31/40/21/30/21/332感染3-5天的口腔试子和鼻腔试子排毒量4.0-8.0Log10TCID50，感染8-17天的口
6、腔试子排毒量5.9-8.3Log10TCID50，感染18-25天的口腔试子排毒量6.0Log10TCID50，高峰时空气中的病毒量为5.3Log10TCID50按照极致按照极致计算，一算，一头猪感染后的猪感染后的3-5天的排毒量可以感染天的排毒量可以感染100万万头生猪生猪被感染猪不表现临床症状，病毒粒子本身检测不到，但感染猪终生带毒。病毒的遗传子潜伏在神经细胞内，当免疫低下时，遗传子再活性化引起在感染。被感染猪表被感染猪表现亚临床症状，床症状，这种种带毒猪可持毒猪可持续一年一年以上排毒。以上排毒。 潜伏感染猪和潜伏感染猪和隐性感染猪成性感染猪成为污染源染源侵入途径侵入途径1989年年1-3
7、月月1989年年4-6月月合计合计（%）肥育猪的引进肥育猪的引进1736539.8繁殖猪的引进繁殖猪的引进1041519.4猪的分群猪的分群639458.3地域内传播地域内传播777715428.4野生猪野生猪1891.7机械的传播机械的传播1010.2猪的死体猪的死体0440.7不明不明10112222341.1其他其他0220.4PRV的侵入途径的侵入途径-种猪引种猪引进和育肥猪散毒是已知的主和育肥猪散毒是已知的主要要传染源染源（美国农务省的调查结果）一点式一点式饲养散毒养散毒风险大大,伪狂犬阴性狂犬阴性场引引进后后备必必须经过检测确定确定为伪狂犬阴性狂犬阴性!综上所述，大多数猪上所述，大
8、多数猪场都存在都存在伪狂犬狂犬发病的病的风险；中；中小小规模猪模猪场的的风险尤尤为突出；突出；小小结伪狂犬病毒感染狂犬病毒感染剂量低，中量低，中间宿主多，猪感染后排毒量巨宿主多，猪感染后排毒量巨大，大，进入猪入猪场途径多，猪途径多，猪场内内传播快，公猪播快，公猪传播途径容易被忽播途径容易被忽视；变异株的流行异株的流行导致致发病率持病率持续上升上升p2011年以前，由于疫苗普遍接种（很多猪场仔猪只做一针的情况下）临床典型病例已较少；p配合鉴别诊断技术，很多猪场实现了伪狂犬转阴或者净化；变异株的流行异株的流行导致致发病率持病率持续上升上升p自2011年底自北向南猪场陆续出现伪狂犬；经过鉴定不同省份
9、分离的毒株都是高度同源的变异株；2011年底最年底最初初发生的省生的省份份至2015年伪狂犬变异株的分布PRV HeN1和S株 对小鼠的LD50测定PRV HeN1和SC株Vero细胞培养液的毒价测定分别为107.6 TCID50/0.1mL; 106.8TCID50/0.1mL。 将原液稀释为106.0、105.0、104.0、103.0、102.0、101.0TCID50/0.1mL； 30只5周龄BALB/c小鼠，随机分为6组，每组5只，皮下注射各稀释度病毒0.1mL； 逐日观察小鼠症状及死亡情况。 PRV- HeN1 株对小鼠的LD50经计算为10102.2.4TCID50/只。 PR
10、V-SC株 对小鼠的LD50经计算为10103.83.8TCID50 /只。变异株异株伪狂犬的致病力狂犬的致病力更更强，致死，致死剂量量为国家校国家校检毒株毒株SC株株的的1/30Tong , et al., Vet. Microbiol. 181 (2015) 236240 .变异株对仔猪的致死率更高组别组别绵羊数绵羊数疫苗株疫苗株攻击用毒株攻击用毒株发病数发病数死亡死亡数数保护保护数数保护保护率率A A4 4免疫免疫HeN1HeN12/42/42/42/42/42/450%50%B B3 3未免疫HeN1HeN13/33/33/33/30/30/30 0C C4 4免疫免疫S SC C0/
11、40/40/40/44/44/4100%100%D D3 3未免疫S SC C3/33/33/33/30/30/30 0注：1、实验设计、免疫剂量和攻毒剂量均参照Bartha K61疫苗质量标准；2、绵羊对伪狂犬感染是致死性的3、免疫是单针肌注免疫现有质量标准的疫苗对变异株现有质量标准的疫苗对变异株(HeN1)的攻毒保护的攻毒保护效果欠佳效果欠佳2014年年7月月-2015年的年的检测数据数据统计2016年检测数据统计数据年检测数据统计数据伪狂犬变异株的临床症状变化伪狂犬变异株的临床症状变化初次感染场特别是野毒抗体阴性场，损失惨重。初次感染场特别是野毒抗体阴性场，损失惨重。p母猪母猪以以流产、
12、死胎木乃伊胎为主；流产、死胎木乃伊胎为主；p仔猪出生后仔猪出生后3-5天神经症状，腹泻、呕吐，死亡率天神经症状，腹泻、呕吐，死亡率100%；p伪伪狂犬野毒抗体呈阴性猪场，迅速转阳，一个月内狂犬野毒抗体呈阴性猪场，迅速转阳，一个月内gE抗体阳率超过抗体阳率超过50%。感染后感染后1年产房逐渐年产房逐渐平稳平稳（但持续感染的影响在继续）（但持续感染的影响在继续）p神经症状比例减少，腹泻比例增高；神经症状比例减少，腹泻比例增高；p保育及育肥猪干咳及继发感染严重；保育及育肥猪干咳及继发感染严重；长期免疫抑制长期免疫抑制or传胸混感？传胸混感？可致死大量育肥中后期猪可致死大量育肥中后期猪母猪屡配不孕，返
13、情率高母猪屡配不孕，返情率高产房仔猪顽固持续性腹泻产房仔猪顽固持续性腹泻猪群精神抑郁具有攻击性猪群精神抑郁具有攻击性规模化模化场和中小和中小规模的猪模的猪场表表现的的问题不同不同规模化模化场具有具有较强的的处置能力与置能力与诊断能力断能力反复加反复加强免疫免疫u种猪种猪4次次/年，仔猪年，仔猪3次次/年年加大加大剂量免疫量免疫u种猪种猪3头份份/次，仔猪次，仔猪2头份份/次次p实际效果：效果：注射时应激大，多次注射，操作麻烦；可控制临床主要症状（如流产及仔猪神经症状等），但偶有干咳、腹泻等症状120-150日龄猪群转阳率高居不下。中小中小规模模场主要主要问题误诊为其他疾病其他疾病呼吸道症状和繁
14、殖障碍（母猪流呼吸道症状和繁殖障碍（母猪流产、返情）容易、返情）容易误认为是是蓝耳和耳和圆环伪狂犬引起的腹泻与狂犬引起的腹泻与PEDV症状相近，容易被症状相近，容易被经验所蒙蔽所蒙蔽检测中心二月份采集很多疑似中心二月份采集很多疑似PEDV的病料，最的病料，最终检测结果果为伪狂犬引起狂犬引起的腹泻的腹泻p近年来近年来伪狂犬狂犬发病率高，病率高，带毒率高，已成毒率高，已成为危害我国生猪养殖的最重大危害我国生猪养殖的最重大疫病之一；疫病之一；p伪狂犬病在呼吸道、消化道、繁殖障碍狂犬病在呼吸道、消化道、繁殖障碍类疾病中的病原疾病中的病原检出率出率较高，部高，部分症状与分症状与蓝耳和耳和PEDVPEDV
15、类似；似；伪伪狂犬变异株发病重要的特点：狂犬变异株发病重要的特点：p必然的几个阶段：流产必然的几个阶段：流产-木乃伊和神经症状木乃伊和神经症状-顽固性腹泻和育肥干咳顽固性腹泻和育肥干咳-长期长期感染散毒导致育肥期猪群的死亡；感染散毒导致育肥期猪群的死亡；p 感染后的猪场呈亚临床发病，主要问题是仔猪顽固性腹泻和保育及育肥感染后的猪场呈亚临床发病，主要问题是仔猪顽固性腹泻和保育及育肥猪干咳猪干咳。小结小结三、如何利用实验室检测防控伪狂犬p常用的常用的伪狂犬狂犬检测方法：方法：ELISA：gB抗体，抗体，gE抗体抗体中和抗体中和抗体检测病原病原检测：普通：普通PCR与与荧光定量光定量PCR病理切片病
16、理切片三、如何利用实验室检测防控伪狂犬p伪狂犬疫苗是少有的可通过抗体检测区分野毒和疫苗毒的疫苗p目前大多数伪狂犬疫苗是缺失gE基因的，因此疫苗免疫不会产生针对gE基因的抗体，因此可以通过鉴别诊断技术确定猪场的感染情况。p那么检出野毒抗体意味着什么？是不是猪群在发病或者仔猪感染？野毒抗体野毒抗体检测的的误区区p阳性猪阳性猪场检母猪的抗体母猪的抗体伪狂犬一旦感染狂犬一旦感染终生生带毒，野毒抗体持毒，野毒抗体持续为阳性母猪，不可能通阳性母猪，不可能通过免疫将免疫将野毒阳性的母猪野毒阳性的母猪转阴，更不能因阴，更不能因为母猪野毒抗体是阳性就判断猪母猪野毒抗体是阳性就判断猪场有有问题；p阳性阳性场90日
17、日龄之前的仔猪判断之前的仔猪判断为伪狂犬感染狂犬感染伪狂犬的母源抗体持狂犬的母源抗体持续期期长，母猪野毒抗体阳性仔猪必，母猪野毒抗体阳性仔猪必为阳性，但不能确阳性，但不能确诊为野毒感染；野毒感染；野毒抗体野毒抗体检测的的应用范用范围接种PRV HeN1后，第5天部分猪PRV gE抗体开始阳转，第7天全部阳转。猪猪场检测PRVPRV野毒是否正在流行野毒是否正在流行应以以检测后后备猪猪(14-18周周)gEgE抗体抗体为主，超主，超过15% %为正在流行。正在流行。阳性的母猪可阳性的母猪可产出阴性的后出阴性的后备，通，通过这一指一指标可可评价疫苗的保价疫苗的保护效果效果阳性场野毒抗体野毒抗体检测的
18、的应用范用范围p野毒阴性野毒阴性场可用于可用于监测新引新引进种猪：凡阳性必淘汰，剩余公猪可反复种猪：凡阳性必淘汰，剩余公猪可反复间隔隔2周周检测，均，均为阴性可阴性可用；用；仔猪按日仔猪按日龄采血，确定猪采血，确定猪场的感染的感染阶段，采取段，采取针对性措施；性措施；p普通普通PCR和和荧光定量光定量PCRp样品：扁桃体（持品：扁桃体（持续带毒），肺毒），肺脏（呼吸道症状），（呼吸道症状），脑组织（神（神经症症状），状），鼻腔鼻腔试子（育肥期子（育肥期检测），精液（如血清抗体），精液（如血清抗体gE阳性，必阳性，必检）p感染感染压力力评估估时用用荧光定量光定量PCRp误区：区：p伪狂犬的病毒血
19、症期极短，血清狂犬的病毒血症期极短，血清样本往往本往往检测不到病原；不到病原；p公猪精液的病原公猪精液的病原检测容易被忽容易被忽视p病原病原检测是是测序的基序的基础病原病原检测的的误区及区及应用范用范围四、四、伪狂犬疫苗的作用及正确狂犬疫苗的作用及正确应用用1 1、伪狂犬病疫苗可有效保护强毒的攻击而免于临床发病。2、弱毒疫苗的保护效果比灭活苗好且免疫持续期长3、伪狂犬活苗注射免疫会受到母源抗体的干扰，滴鼻免疫是有效的免疫途径（1）不受母源抗体干扰；（2）建立黏膜免疫阻止病原经过呼吸道传播途径；4、伪狂犬的母源抗体持续期特别长，在感染压力比较大的场，为尽早肌注免疫，建议在妊娠中后期母猪不要免疫伪
20、狂犬疫苗；5、伪狂犬是少有的几个可以做紧急免疫的疫苗，断奶后仔猪出现伪狂犬引起的干咳及腹泻症状或瘙痒症状，紧急注射伪狂犬可有效缩短病程和发病率；6、对育肥猪注射伪狂犬疫苗，特别是一点式猪场；五、五、伪狂犬狂犬“五步五步转阴阴”法法伪狂犬温和净化的关键点伪狂犬温和净化的关键点1 1、疫苗株要能有效、疫苗株要能有效压制散毒制散毒-不不扩大感染大感染压力力2 2、快速、快速产生主生主动保保护-通通过佐佐剂缩短空窗期短空窗期3 3、阳性母猪可、阳性母猪可产阴性后阴性后备-阴性后阴性后备补充充4 4、控制公猪精液、控制公猪精液传播播-预防再次感染母猪群防再次感染母猪群5 5、按照、按照产次自然淘汰次自然
21、淘汰-逐逐渐降低猪群的降低猪群的风险6 6、生物安全、生物安全灭鼠工作鼠工作-保保卫净化成果化成果7 7、配套的、配套的检测方法方法-评估猪估猪场感染感染压力力感染压力分析保证后备的阴性阳性母猪随产次自然淘汰定期抗体监测12345伪狂犬“五步转阴”步骤活跃度评估压制散毒后备净化期稳定自然淘汰期验收监测期公猪淘汰及疫苗压制（包括育肥）、生物安全野毒阳性数/样本数野毒阳性率后备母猪34/4379.07%一产母猪82/10478.85%二产母猪45/5877.58%三产母猪33/5164.71%四产母猪16/2661.54%五产母猪17/2568%六产母猪26/4755.30%七产母猪59/8767
22、.80%种公猪12/2646.15%母猪合计332/44173.02%合计344/46773.66%第一次种猪伪狂犬第一次种猪伪狂犬gE抗体检测情况抗体检测情况调整免疫程序后半年后检测数据猪的种类检验总数抗体阴性数抗体阳性数野毒阳性率后备母猪192 （累计）19200种公猪2516936% 一产母猪32718114644.65%二产母猪1883715180.32%三产母猪101208180.20%四产以上母猪82235971.96%合计91546943647.65%淘汰阳性种公猪后的淘汰阳性种公猪后的结果果野毒阳性数/样本数野毒阳性率与净化前同产次比较第一次配种母猪3/893.37%降75.7
23、%一产母猪10/1168.62%降70.23%二产母猪23/13217.4%降60.18%三产+四产母猪（净化前零产）167/26463.3%降0.33%五产母猪（净化前一产）54/8169.2%六产母猪（净化前二产）45/5976.3%七产母猪（净化前三产）18/2475.0%八产母猪（净化前四产）7/1163.6%后备母猪1/492.04%1年后净化结果野毒阳性数/样本数野毒阳性率与净化前同产次比较预留后备母猪0/1240种公猪1/244.17%降41.63%预留后备公猪1/119.09%生产后母猪324/68747.1%降22.74%种母猪327/82639.58%降33.44%净化后出
24、生种猪（二产以前及预留后备和后备母猪）37/5107.25%合计330/98433.5%降40.26%2年后净化结果野毒阳性数/样本数野毒阳性率后备母猪（累计）0/1760种公猪0/25020日龄育肥猪 1/601.67%60日龄育肥猪1/601.67%一产母猪0/1780二产母猪2/1531.31%三产母猪4/1293.1%四产母猪5/1353.7%四产以上27/8232.93%合计40/10083.97%加加强型疫苗技型疫苗技术核心：核心：快速起效，免疫空窗期短快速起效，免疫空窗期短安全有效，保安全有效，保护时间更久更久配套的配套的检测技技术： 评估感染估感染压力，了解感染力，了解感染阶段段 可可鉴别可可诊断，减少断，减少误判判错判判转阴和阴和净化成本：化成本：不干不干扰生生产秩序，不增加生秩序，不增加生产成本成本成本可控，成本可控，经济有效有效第二第二阶段即达到减少段即达到减少伪狂犬床危害，最狂犬床危害，最终达到达到转阴阴净化目的，降低化目的，降低远期期风险五步法五步法转阴的阴的优势汇报完毕谢谢大家
