最新四沉淀技术ppt课件

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1、四沉淀技术四沉淀技术生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (沉淀沉淀/ /超过滤超过滤/ /萃取萃取) )纯化纯化( (层析、离子交换、吸附层析、离子交换、吸附) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤) )浓缩浓缩( (超滤超滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性盐析盐析 P51P51概念：概念：概念：概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）在高浓度的

2、中性盐存在下，蛋白质（酶）在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。生沉淀的过程。生沉淀的过程。生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在早在18591859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。和分级

3、中使用，得到了比较满意的结果。 盐析法机理盐析法机理 P51P51（1 1）破破坏坏水水化化膜膜，分分子子间间易易碰碰撞撞聚聚集集， 将将大大量量盐盐加加到到蛋蛋白白质质溶溶液液中中，高高浓浓度度的的盐盐离离子子有有很很强强的的水水化化力力，于于是是蛋蛋白白质质分分子子周周围围的的水水化化膜膜层层减减弱弱乃乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2 2）破破坏坏水水化化膜膜，暴暴露露出出憎憎水水区区域域，由由于于憎憎水水区区域域间间作作用用使使蛋蛋白白质质聚聚集集而而沉沉淀淀，憎憎水水区区域域越越多多，越易沉淀。越易沉淀。（3 3）中中和和电电荷荷，减减

4、少少静静电电斥斥力力， 中中性性盐盐加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液后后，蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷大大量量被被中中和和，静静电电斥斥力力降降低低，导导致致蛋蛋白白溶溶解解度度降降低低，使使蛋蛋白白质质分分子子之间聚集而沉淀。之间聚集而沉淀。盐析过程盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：下两种情况：（1 1）“盐溶盐溶”现象现象(salt-in)(salt-in)低盐浓度下，增低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。（2 2）“盐析盐析”现象现象(salt-out)(salt-o

5、ut)高盐浓度下，高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降降 。l盐析作用要强盐析作用要强l盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的l来源丰富、经济来源丰富、经济盐析用盐的选择盐析用盐的选择 P52盐析用盐的选择盐析用盐的选择 P52P52在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱弱

6、阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1） 价廉价廉 ；u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以

7、盐析出来；出来；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。 缺点：缺点：（1）水解变酸；）水解变酸；（2）高）高pH释氨，腐蚀；释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。）残留产品有影响。盐析操作盐析操作( (加盐方式）加盐方式）P53P53硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅

8、拌，使其完全溶解和防止局部浓应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵

9、浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。晶。 S=- S=-s sS S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L; g/L; I I离子强度，离子强度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子离子 i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；ZiZi所带电荷所带电荷常数，图中常数，图中截距截距KsKs盐析常数，图中直线盐析常数，图中直线斜率斜率CohnCohn经验式经验式 P52P52蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系 和和Ks的物理意义：的物理意义：代表截距，即当离子强度为零，也就是代表截距，即当离

10、子强度为零，也就是纯水中纯水中的假想溶解度的对数的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、。与蛋白质种类、温度、pHpH值值有关，与盐无关有关，与盐无关KsKs盐析常数，代表图中直线的盐析常数，代表图中直线的斜率斜率从一些实验结果表明，从一些实验结果表明，KsKs与温度和与温度和pHpH无关，但和蛋白无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，硫酸铵作为沉淀剂时，KsKs值对不同的蛋白质来说，值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过其变化不会超过1 1倍。倍。用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫

11、第一类叫KsKs分段盐析法，分段盐析法，在一定在一定PHPH和温度下通和温度下通过改变离子强度实现，（固定过改变离子强度实现，（固定pH, pH, 温度，温度，改变改变盐浓度盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液第二种叫第二种叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下通在一定离子强度下通过改变过改变PHPH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改改变变pHpH及温度及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，

12、用于后期进一变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。步分离纯化和结晶。u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。解度越低。u在进行分离的时候，一般从低离子强度在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。到高离子强度顺次进行。u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。出来。u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白

13、质分子不对称性所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。越大，也越易沉淀。影响盐析的因素影响盐析的因素盐析的影响因素：盐析的影响因素：pHpH值值u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。解度最小。u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液PHPH值调到目的蛋白值调到目的蛋白的等电点处。的等电点处。u注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况浓度下所测的结果是不同的，

14、需根据实际情况调整溶液调整溶液PHPH值，以达到最好的盐析效果。值，以达到最好的盐析效果。盐析影响因素：温度的影响盐析影响因素：温度的影响u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。增加而增加。u但在高浓度下，蛋白质、酶和但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。升而下降。u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4进行。进行。

15、u随温度升高减小，热促失水随温度升高减小，热促失水膜膜uKsKs不随温度而变不随温度而变盐析的影响因素：蛋白质浓度盐析的影响因素：蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。有关。Z高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。作用比较少，但回收率会降低。

16、因此需要在两者之间进行适当选择。因此需要在两者之间进行适当选择。Z分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。Z一般认为一般认为2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。盐析注意事项盐析注意事项(选择适宜饱和度选择适宜饱和度(采用分步盐析采用分步盐析(盐析的成败决定于溶液的盐析的成败决定于溶液的pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pH pH 用用磷酸

17、缓冲液磷酸缓冲液(在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。高，导致酶失活。(盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。段时间。(为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。(盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析盐析后的蛋白质最好

18、尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤较慢，一般可用超滤盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵的使用：硫酸铵的使用：硫酸铵中常含有少量的硫酸铵中常含有少量的重金属离子重金属离子，对蛋白质，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用巯基有敏感作用，使用前用H H2 2S S处理处理高浓度的硫酸铵溶液一般呈高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性酸性（PH=5.0PH=5.0左右）左右），使用前需要用氨水调节至所需，使用前需要用氨水调节至所需PHPH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大铵加入后体积变大盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全盐析后一般放置半小

19、时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液过滤多用于高浓度硫酸铵溶液离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。盐析法特点：盐析法特点：1.1.成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。2.2.操作简单、安全。操作简单、安全。3.3.不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。4.4.分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。等电点沉淀法等

20、电点沉淀法isoelectric point precipitation等电点沉淀法等电点沉淀法在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为形成沉淀的操作称为等等电点沉淀电点沉淀不同的两性电解质具有不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为不同的等电点，以此为基础可进行分离。基础可进行分离。生产胰岛素时，在粗提生产胰岛素时，在粗提液中先调液中先调PH8.0去除碱性去除碱性蛋白质，再调蛋白质，再调PH3.0去除去除酸性蛋白质。

21、酸性蛋白质。pH=pI图图16-10表示大豆蛋白的溶解度随表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。的变化情况。等电点沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法注意事项等电点沉淀法注意事项F本法适用于本法适用于憎水性憎水性较强的蛋白质，例如酪较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。F但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调在低离子强度的溶液中，调 pHpH在等电点并在等电点并不产生沉淀。不产生沉淀。F等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，

22、等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用通常与其他沉淀方法结合使用通常与其他沉淀方法结合使用通常与其他沉淀方法结合使用: : : :F在调节等电点时，如果采用盐在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使蛋白变性。为了使pHpH缓慢变动，也可用乙缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。F中中性性盐盐浓浓度度增增大大时时，等等电电点点向向偏偏酸酸方方向向移移动，同时最低溶解度会有所增大。动，同时最低溶解度会有所增大。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法org

23、anicsoventprecipitation概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。出。出。出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。使用的沉淀方法之一。优点优点：1）分辨

24、能力比盐析法高，即蛋白阿质）分辨能力比盐析法高，即蛋白阿质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点缺点:1）对具有生物活性的大分子容易引起变）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，性失活，2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3）成本）成本高高总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。盐析法普遍。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理*A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D

25、水）水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化

26、层，使蛋白质沉淀。质沉淀。*C 相反力：相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层合形成疏水层有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜常用的有机溶剂沉析剂常用的有机溶剂沉析剂选择依据：选择依据：水溶性要好水溶性要好介电常数要小介电常数要小致变性作用要小（甲醇）致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中容易获取容易获取沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂的

27、沉淀剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广不广1、温度、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止

28、溶液局部升温。溶液局部升温。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。一般温度越低，沉淀越完全。因此，所用的有机溶剂须预先因此，所用的有机溶剂须预先冷却冷却到到-10-20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行个操作过程应在低温下进行 。有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素2、pH值值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。3、样品浓度：样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓

29、会增加共沉作用耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初。一般认为蛋白质的初浓度以浓度以0.52为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以12较合适。较合适。4、中性盐浓度中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。5、某些金属离子某些金属离子：一些金属离子如：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物某些成阴离子状态的蛋白质形成

30、复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。并降低溶剂用量。有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素非离子型聚合物非离子型聚合物用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。度，有选择性的沉淀蛋白质。机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。的水化膜。常用非离子性聚合物为常用非离子性聚合物为Polyethyleneglycol(PEG)： 是一种水溶性的高分子聚合物，分子

31、量是一种水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000以以上的上的 PEG可以用来沉淀蛋白质。可以用来沉淀蛋白质。优点：优点：1.室温室温 2.颗粒大，易于收集颗粒大，易于收集 3.提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 4.PEG难去除，幸而难去除，幸而 PEG通常一般不影响下一步通常一般不影响下一步的分离。的分离。机理：架桥与静电机理：架桥与静电离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。合成的离子聚合物：合成的离子聚合物：聚丙烯酸（聚丙烯酸（pH 2.8 90%pH 2.8 90%蛋白沉淀）蛋白沉淀）聚苯乙烯

32、季胺盐（聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% pH 10.4, 95% 蛋白沉淀）蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺聚电解质沉淀聚电解质沉淀成盐类复合物沉淀成盐类复合物沉淀此类沉析剂有以下三种：此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基团结合团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条

33、件，有时还需加入一定的稳定剂。较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。） 金属离子沉淀金属离子沉淀金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。白的特异相互作用的研究中得到的。Zn2+用于沉

34、淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。檬酸。硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，MgSO4用以去除用以去除DNA和其他核酸；和其他核酸； 成盐类复合物沉淀金属离子沉淀蛋白质金属离子沉淀蛋白质一般可分三类：一般可分三类：能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、 Fe2+、 o2+、 Ni2+、 u2+、 Zn2+、 Cd2+;能与羧酸结合而

35、不与含氮化合物结合的一些金属离子，能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：如：Ca2+、 Ba2+、 Mg2+、 Pb2+;能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g2+、Ag2+、 Pb2+。实际应用时，金属离子的浓度常为实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂金属螯合剂。2有机盐法有机盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。碱性功能团形成复

36、合物而沉淀析出。 但此法常发生不但此法常发生不可逆的沉淀反应可逆的沉淀反应3无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐，可通以若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成硫化物而使金属变成硫化物而除去；除去；若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。除去。成盐类复合物沉淀亲和沉淀亲和沉淀aff

37、inityprecipitationu亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。理与通常的沉淀方法有很大的不同。u它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术u所以所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。解

38、度的大小。亲亲 和和 沉沉 淀淀 亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。单一产品的有效方法。初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀；载体上的亲合配位体络和形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。解出来。16.9选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法：选择性变性沉淀法：选择一定的

39、条件使溶液中选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。目的物分开。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。方法可分为：方法可分为：1）利用表面活性剂）利用表面活性剂(三氯乙酸三氯乙酸)或或有机溶剂引起变性；有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；加热破坏某些组分，而保存另一些组分；

40、3）酸碱变性。酸碱变性。选择性分离核酸选择性分离核酸l l酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等l l目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。则存在于水溶液中。则存在于水溶液中。则存在于水溶液中。u在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛醇，振荡一辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿段时间、使蛋白质在氯仿- -水的界面上形成沉淀而被除

41、水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。去，核酸仍然留在水溶液中。u在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚- -水溶水溶液提取核酸，在液提取核酸，在DNADNA、RNARNA在水溶液中，而蛋白质在苯在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；酚层中形成沉淀而被除去；u在在DNADNA、RNARNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNADNA，而而RNARNA留在溶液中。留在溶液中。各种沉淀方法应用范围各种沉淀方法应用范围盐析法：盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机

42、溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。合使用。非离子多聚体沉淀法：非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。小分子物质的沉淀。选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用：多用于除去某些不耐热的和在一定于除去某些不耐热的和在一定pHpH值下易变性的值下易变性的杂蛋白。杂蛋白。yourtopicgoeshereYOUR SUBTOPICS GO HERE结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！54