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1、电泳分析法金叶金叶1 1807-18091807-1809年，俄国物理学家年，俄国物理学家F.F.ReussF.F.Reuss首次发首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。电泳的发展电泳的发展 19071907年，年，Field Field 和和TeagueTeague研究出填充有琼脂糖研究出填充有琼脂糖凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。*2 1937年，蒂塞利乌斯年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典，瑞
2、典)将蛋白质将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和液分离出白蛋白和、球蛋白；发现样品的迁球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其移速度和方向由其电荷和淌度电荷和淌度决定。决定。 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。年，获诺贝尔化学奖。*3 1959年，年，Raymond和和Weintraub利用人工合成的凝利用人工合成的凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶作为支
3、持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的分辨率。极大地提高了区带电泳的分辨率。*4一、一、定义及原理1 1、电泳：、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。的现象。2 2、原理、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，根据电泳技术就是利用在电场作用下，根据待分离样品中各种分子带待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。 3
4、 3、应用：电泳技术除了用于小分子物质、应用：电泳技术除了用于小分子物质 ( (无机盐、氨基酸、核苷酸、无机盐、氨基酸、核苷酸、脂类脂类) )的分离分析外，最主要用于生物大分子的分离分析外，最主要用于生物大分子 ( (蛋白质、核酸、酶蛋白质、核酸、酶) ) 的研究。的研究。以生物大分子为例阐明电荷来源以生物大分子为例阐明电荷来源R COOHNH3+R COO-NH3+R COO-NH2+ OH- + H+ OH- + H+ pHpIpH=pIpH2时，管壁的硅醇基（时，管壁的硅醇基（SiOH）离解成）离解成硅醇基阴离子（硅醇基阴离子（SiO），使管壁带负电荷，溶），使管壁带负电荷，溶液液带正电
5、荷带正电荷，在管壁和溶液之间形成双电层。，在管壁和溶液之间形成双电层。Zeta电位电位54 由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，由于溶液中的阳离子实际上是溶剂化的，在外在外电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，电场的作用下，溶剂化的阳离子向负极移动，将将引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管引起柱中的溶液整体向负极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。电泳中的电渗现象。2。电渗流（。电渗流（electroosmotic flow，EOF） 电渗现象中整体电渗现象中整体移动着的液体叫移动着的液体叫电渗流。电渗流。553. 电渗流的大小和方向电渗流的大小和方向电渗流的大小用电渗流的大小用电渗流
6、速度电渗流速度vos表示，其大小表示，其大小决定于电渗淌度决定于电渗淌度os和电场强度和电场强度E。即。即 、分别是电泳介质的介电常数和粘度分别是电泳介质的介电常数和粘度, 毛细管壁的毛细管壁的Zeta电位，它近似等于电位，它近似等于扩散层与紧扩散层与紧密层界面上的电位密层界面上的电位。该。该界面内净电荷数（正电荷界面内净电荷数（正电荷数）越多、扩数）越多、扩散层越厚，散层越厚，Zeta电位越大电位越大.56 Lef毛细管有效长度；毛细管有效长度； tos电渗流标记物电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。（中性物质）的迁移时间。电渗流的速度是电泳速度的电渗流的速度是电泳速度的57倍。倍。 一般情
7、况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，一般情况下，石英毛细管内壁表面带负电荷，则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将则电渗流带正电荷，向负极移动。但如果将毛细毛细管内壁改性，管内壁改性，比如在在内壁表面涂渍或键合一层比如在在内壁表面涂渍或键合一层阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电阳离子表面活性剂，将使壁表面带正电荷，则电渗流带负电荷，向正极移动。渗流带负电荷，向正极移动。VOS可通过实验测定可通过实验测定57 在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞在外电场驱动下产生的电渗流为平流，即塞式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅式流形。液体流动速度除在管壁附近因摩擦力迅速减小到零以外，其余部
8、分几乎处处相等。这一速减小到零以外，其余部分几乎处处相等。这一点和点和HPLC中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。中靠泵驱动的流动相的流形完全不同。4.电渗流的流形电渗流的流形58 HPLC流动相的流形为抛物线形的层流，在流动相的流形为抛物线形的层流，在管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度管壁处的速度为零，管中心的速度是平均速度的的2倍，倍，引起的谱峰展宽较大。引起的谱峰展宽较大。电渗流呈平流，电渗流呈平流，引起的谱峰展宽很小，引起的谱峰展宽很小，是毛细管是毛细管电泳能获得较电泳能获得较HPLC更高分离效率的重要原因。更高分离效率的重要原因。4. 电渗流的作用电渗流的作用 电渗流通常流向负极
9、，电渗流速度约等于一般电渗流通常流向负极，电渗流速度约等于一般离子电泳速度的离子电泳速度的57倍。所以，各种电性物质在倍。所以，各种电性物质在毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为毛细管中的迁移速度为两种速度的矢量和，称为表观电泳速度，用表观电泳速度，用vap表示。表示。5960 当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电当把试样从阳极端注入到毛细管内时，不同电性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端性的粒子将按不同的速度向负极迁移，从负极端先后流出毛细管。出峰次序是：先后流出毛细管。出峰次序是： 阳离子阳离子中性分子中性分子阴离子阴离子中性分子与电渗流速度相同，不能互相分离。中性分子与电
10、渗流速度相同，不能互相分离。v=E=(电渗流电渗流ep)E61+ =电渗流电渗流 + +ep 阳离子运动方向与电渗流一致；阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流电渗流 - -ep 阴离子运动方向与电渗流相反；阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；电渗流具有像电渗流具有像HPLC中泵一样的作用，推动离中泵一样的作用，推动离子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，子前进，加上不同离子电泳速度和方向的差异，完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。完成阳离子、阴离子和中性离子的分离。改变电渗流的大小和方向，可以改变分离效率改变电
11、渗流的大小和方向，可以改变分离效率和选择性。这是和选择性。这是HPCE中优化分离的重要因素。中优化分离的重要因素。电渗流在电渗流在HPCE HPCE 的分离中起着极其重要的作用：的分离中起着极其重要的作用：电渗流的微小变化影响分离结果的重现性电渗流的微小变化影响分离结果的重现性（迁（迁移时间和峰面积）移时间和峰面积） 。电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制电渗流的恒定。电渗流的恒定。62三、三、HPCEHPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度电渗流速度和电场强度成正比，当毛
12、细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面酸度影响毛细管的表面Si-OH基的电离，特别是基的电离，特别是在在pH47范围内，影响范围内，影响更显著，此时溶液更显著，此时溶液pH值值与与EOF成近线性关系成近线性关系 633. 3. 电解质溶液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁电荷密度增加，管壁zetazeta电势增大，电渗流增大，电势增大，电渗流增大，pH=
13、7pH=7，达到最大；，达到最大； pH3pH3，完全被氢离子中和，表面，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保分析时，采用缓冲溶液来保持持pHpH稳定。稳定。（2 2）缓冲液阴离子的影响）缓冲液阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 64缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。粘度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲缓冲溶液浓度
14、增加，离子强度增加，电渗流下降溶液浓度增加，离子强度增加，电渗流下降。（3）缓冲液浓度（离子强度）的影响）缓冲液浓度（离子强度）的影响65664. 4. 温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，毛细管内温度的升高，使溶液的粘度下降，电渗流增大。电渗流增大。 温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；的热量； HPCEHPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。浓度及电场强度成正比。 温度每变化温度每变化1 1度，将引起背景电解质溶液粘
15、度度，将引起背景电解质溶液粘度变化变化2%2%3%3%；675. 5. 添加剂的影响添加剂的影响（1 1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K K2 2SOSO4 4，溶液离子溶液离子强度增大，电渗流减小强度增大，电渗流减小。（2 2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向 某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴某些阳离子表面活性剂使电渗流减小，某些阴离子表面活性剂，如离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS），可以），可以使壁表面负电荷增加，电渗流增大使壁表面负电荷增加，电渗流增大（3 3）加入有机溶剂如甲醇
16、、乙腈，使溶液的粘度减）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使溶液的粘度减小，电渗流增大。小，电渗流增大。68第三节第三节 毛细管电泳仪毛细管电泳仪 毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪 简单。简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器等。前三个部件均易实现测器等。前三个部件均易实现, 困难之处在于检困难之处在于检测器。测器。6970HPCE仪器流程与主要部件 process and main assembly 电压：电压：0 03030kVkV； 分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器；紫外
17、或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：1010-19-191010-21-21 mol/Lmol/L）2024/8/11.高压电源（1 1）0 03030 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2. 2. 毛细管柱毛细管柱 （1 1）材料：石英）材料：石英 （2 2）规格：内径）规格：内径20207575m m，外径外径35035040040
18、0m m；长度长度=1电泳电泳, ,阴离子在负极最后流出。阴离子在负极最后流出。CZE是最基本、应用最广的分离模式是最基本、应用最广的分离模式7576774.24.2、胶束电动毛细管色谱（、胶束电动毛细管色谱（MECCMECC或或MEKCMEKC） 胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液中加入浓胶束电动毛细管色谱是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分度高于胶束临界浓度的表面活性剂，胶束相在分离中起到了离中起到了准固定相的作用，是电泳技术与色谱准固定相的作用，是电泳技术与色谱技术的结合。技术的结合。 把离子型表面活性剂把离子型表面活性剂 (如十二烷基硫酸钠如十二烷基硫酸钠)加到加
19、到缓冲液中缓冲液中, 当其浓度超过临界浓度后就形成有一当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电, 但电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度但电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度, 故胶束故胶束将慢速向负极移动。将慢速向负极移动。（一）分离原理（一）分离原理 7879 中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液中性粒子按其疏水性不同，在缓冲溶液（流动相）和胶束（流动相）和胶束（准固定相）准固定相）之间分配。之间分配。疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的疏水性强、亲水性弱的粒子分配到胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性多，分配到
20、缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分强、疏水性弱的溶质分配到胶束中的少，分配到缓冲溶液中的多。配到缓冲溶液中的多。当溶质进入胶束时，当溶质进入胶束时，以胶束的速度慢速迁移；溶质进入缓冲溶液以胶束的速度慢速迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度快速前移。时，以电渗的速度快速前移。分配系数越大分配系数越大的粒子，在柱中迁移速度慢，从而使疏水性的粒子，在柱中迁移速度慢，从而使疏水性稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。稍有差别的中性物质在电泳中得以分离。80 MECC的突出优点是除能分离离子化合物外，的突出优点是除能分离离子化合物外，还能分离不带电荷的中性化合物。还能分离
21、不带电荷的中性化合物。（二）分离条件的选择（二）分离条件的选择 胶束准固定相对胶束准固定相对MECC分离过程起着重要作用。分离过程起着重要作用。 准固定相为各类表面活性剂，对其要求是：准固定相为各类表面活性剂，对其要求是： 胶束的粘度小；胶束的粘度小；水溶性好水溶性好形成的胶束必须均匀、透明，不吸收形成的胶束必须均匀、透明，不吸收UV光光 临界胶束浓度临界胶束浓度CMC不宜太高不宜太高胶束具有足够的稳定性胶束具有足够的稳定性81类 型型表面活性表面活性剂CMC（10-3mol/L） 阴离子表面活性阴离子表面活性剂十二十二烷基硫酸基硫酸钠（SDS）8.1十四十四烷基硫酸基硫酸钠（STS）2.1N
22、-月桂月桂酰-N-甲基牛磺酸甲基牛磺酸钠（LMT）8.7聚氧乙聚氧乙烯醚基十二基十二烷基硫酸基硫酸钠2.8两性离子表面活性两性离子表面活性剂N-十二十二酰基基-L-氨酸氨酸钠（SDVal）5.7 阳离子表面活性阳离子表面活性剂十二十二烷基三甲基基三甲基氯化化铵（DTAC）16十二十二烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（DTAB）15十四十四烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（TTAB）3.5十六十六烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（CTAB）0.92一些常用的表面活性剂及其临界浓度一些常用的表面活性剂及其临界浓度 8283 MECC的突出优点是除能分离离子化合物外，的突出优点是除能分离离子化合物外，还能分离不
23、带电荷的中性化合物。还能分离不带电荷的中性化合物。（二）分离条件的选择（二）分离条件的选择 胶束准固定相对胶束准固定相对MECC分离过程起着重要作用。分离过程起着重要作用。 准固定相为各类表面活性剂，对其要求是：准固定相为各类表面活性剂，对其要求是： 胶束的粘度小；胶束的粘度小；水溶性好水溶性好形成的胶束必须均匀、透明，不吸收形成的胶束必须均匀、透明，不吸收UV光光 临界胶束浓度临界胶束浓度CMC不宜太高不宜太高胶束具有足够的稳定性胶束具有足够的稳定性84类 型型表面活性表面活性剂CMC（10-3mol/L） 阴离子表面活性阴离子表面活性剂十二十二烷基硫酸基硫酸钠（SDS）8.1十四十四烷基硫
24、酸基硫酸钠（STS）2.1N-月桂月桂酰-N-甲基牛磺酸甲基牛磺酸钠（LMT）8.7聚氧乙聚氧乙烯醚基十二基十二烷基硫酸基硫酸钠2.8两性离子表面活性两性离子表面活性剂N-十二十二酰基基-L-氨酸氨酸钠（SDVal）5.7 阳离子表面活性阳离子表面活性剂十二十二烷基三甲基基三甲基氯化化铵（DTAC）16十二十二烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（DTAB）15十四十四烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（TTAB）3.5十六十六烷基三甲基溴化基三甲基溴化铵（CTAB）0.92一些常用的表面活性剂及其临界浓度一些常用的表面活性剂及其临界浓度 85864.34.3、毛细管凝胶电泳（、毛细管凝胶电泳（CGECGE
25、） 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。分离效率高。 蛋白质、蛋白质、DNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，能获得良好分离，DAN排序的重要手段。排序的重要手段。 特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术无胶筛分技术：
26、采用低粘度的线性聚合物溶液代：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。87酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离88 1. 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68 8V V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH
27、梯度；梯度； 3. 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，在有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；中性，淌度为零；4.4、毛细管等电聚焦capillary isoelectric focusing，CIEF2024/8/1 4. 4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点下迁移，分别到达满足其等电点pHpH的位置时，呈电中性，停的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5. 5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液； 6. 6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7. 7. 电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。2024/8/1
