产气荚膜梭状芽孢杆菌检验.ppt

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1、第十节第十节 产气荚膜梭菌检验产气荚膜梭菌检验食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验产气荚膜梭菌检验产气荚膜梭菌检验产气荚膜梭菌检验Microbiological examination of food hygieneMicrobiological examination of food hygiene Examination of Clostridium Examination of Clostridium perfringensperfringens魏氏梭菌魏氏梭菌目录1 1、概述、概述2 2、生物学特性、生物学特性（菌体形态学特征

2、、（菌体形态学特征、 培养特性和抵抗力）培养特性和抵抗力）3 3、毒素与分型、毒素与分型4 4、培养基和试剂、培养基和试剂5 5、检验程序、检验程序6 6、说明、说明 09/uuoeoeoeuoeuuu.html 1 1、概述、概述 产气荚膜梭状芽孢杆菌产气荚膜梭状芽孢杆菌 又称又称魏魏/ /卫氏梭菌卫氏梭菌分布分布分布分布：自然界广泛存在自然界广泛存在( (创伤感染）。创伤感染）。易污染食品易污染食品易污染食品易污染食品：动物性食品原料：动物性食品原料 食食品品加加热热后后未未及及时时冷冷却却，所所含含耐耐高高温温而而残残余余的的产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌芽芽孢孢会会迅迅速速发发芽芽，大大量量

3、繁繁殖殖，菌菌数数可可达达数数1010万万/ /g g，食食用用前前又又未未加加热热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。 食食品品中中产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌检检验验的的主主要要目目标标是是检检验验食食品品被被该该菌菌污污染染的的程程度度，其其重重点点项项目目是是活菌数测定活菌数测定及及证实试验证实试验。2 2、生物学特性、生物学特性1)1)1)1)形态与染色形态与染色形态与染色形态与染色 G+(G+(陈陈旧旧培培养养物物阴阴性性菌菌）无无鞭鞭毛毛可可形形成成荚荚膜膜和和芽芽胞的大杆菌胞的大杆菌大小：大小：为为(1(12)2)mm X(2 X(210)10)m

4、m 。芽孢芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基 内生长时可形成荚膜。内生长时可形成荚膜。Clostridium perfringenswww.biol.vt.edu/ research/micimm/index.phphttp:/oregonstate.edu/research/Images/SarkerSlide.jpghttp:/ Diagnostik/Erreger/c_keim.htm2)2

5、)培养特性培养特性* *不严格的厌氧不严格的厌氧* *普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。 * *适宜生长温度为适宜生长温度为37473747。* *生长和繁殖速度极快生长和繁殖速度极快，在适宜条件下，在适宜条件下8 8min/min/代代。* *在在4545高温下可进行快速分离纯培养，每培养高温下可进行快速分离纯培养，每培养3434h h 传种传种1 1次，较易分离纯化次，较易分离纯化。 Clostridium Perfringens Toxindtirp.dtra.mil/./ agents/AgentsBW_toxins

6、.asp肝片肉汤肝片肉汤肝片肉汤肝片肉汤培养：培养： 大量产气，培养大量产气，培养5h-6h5h-6h变浑浊；变浑浊；牛奶培养基牛奶培养基牛奶培养基牛奶培养基中生长：中生长： 能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固 产生大量气体，冲散酪蛋白，产生大量气体，冲散酪蛋白， 使其成海绵状。使其成海绵状。庖肉培养基庖肉培养基庖肉培养基庖肉培养基中培养：中培养： 产生大量气体，肉渣或肉块产生大量气体，肉渣或肉块 略带粉红，但不消化。略带粉红，但不消化。普通琼脂平板普通琼脂平板普通琼脂平板普通琼脂平板上培养：上培养： 1515h h 2424h h形成形成S S型菌落，型菌落， 在营

7、养不足或琼脂浓度在营养不足或琼脂浓度 高的平板上可形成锯齿状带高的平板上可形成锯齿状带 放射条纹的放射条纹的R R型菌落。型菌落。 www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.htmlat 45C， Clostridium perfringens is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation 。鲜血琼脂平板生长鲜血琼脂平板生长： 菌落周围出现菌落周围出现双层溶血环双层溶血环，内层溶血完全，外，内层溶血完全，外 层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄层溶血不完全，

8、好似靶状，菌落本身略带灰黄 色至浅灰褐色，与色至浅灰褐色，与空气接触空气接触3030minmin后后，有时可能，有时可能 逐渐变为灰逐渐变为灰绿色绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特、甚至鲜绿色，这是本菌的特 征之一。征之一。 Clostridium perfringens bacteria on a blood agar plate Courtesy Glenn Songer, The University . of Arizona College of Agriculture and Life Sciences. ： www.genomenewsnetwork.org/ articles/01_

9、02/Clos. Clostridium perfringens shows double-zone hemolysis on blood agar. Note the small area of beta hemolysis (complete lysis of red blood cells) surrounded by a larger zone of alpha hemolysis (partial hemolysis). The plate is sitting on a black lab bench www.cat.cc.md.us/./ labmanua/lab16/blood

10、cp.htmlClostridium perfringens Growing on Blood Agar www.genomenewsnetwork.org/ articles/01_02/Clos.www.cat.cc.md.us/./ labmanua/lab16/bloodcp.html 菌落周围出现乳光浑菌落周围出现乳光浑浊带浊带，此反应能被本菌的，此反应能被本菌的抗毒素抑制。抗毒素抑制。 * *由于发酵乳糖，菌落由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变周围的培养基颜色发生变化化 * *本菌不消化牛奶，不本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层

11、不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。（肉毒梭菌可形成）。www.sat.affrc.go.jp/./ Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养：乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养：3) 3) 生化特性生化特性 *发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气， *液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物亚硫酸盐还原为硫化物， 在含亚硫酸盐及铁盐 的琼脂中形成黑色菌落 * *发酵牛奶中发酵牛奶中的乳糖的乳糖，使牛奶，使牛奶凝固，同时大量凝固，同时大量产气，凝块碎裂，产气，凝块碎裂，即所谓即所谓暴风暴风雨式发酵雨式发酵”，这，这是本菌的重要生是本菌的重要生化特征之一，

12、也化特征之一，也是是鉴别的主要指鉴别的主要指标。标。www.woodsend.org/ aaa/micro.html 4 4）抵抗力）抵抗力 A A型型与与C C型型菌菌株株的的芽芽胞胞：耐耐热热性性强强，煮煮沸沸1 13 3h h， 繁殖型菌体不耐热。繁殖型菌体不耐热。www.pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html3、毒素、酶与分型 毒素：毒素：产气荚膜梭菌能产生产气荚膜梭菌能产生外毒素外毒素和和肠毒素肠毒素。 外毒素：外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，致死毒素、坏死毒素和溶血毒素， 毒性不强不耐热。毒性不强不耐热。 肠毒素肠毒素：不耐热，：不耐热

13、，6060经经1010minmin即可破坏不即可破坏不 耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶 等蛋白分解酶比较稳定。等蛋白分解酶比较稳定。 酶酶 ：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等 这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒等。变扩散和全身中毒等。分型：分型： 根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C ，D，E 和和F六个型。六个型。 A型：型：最常见，引起气性坏疽和食物中最常见，引起气性坏疽和食物中 毒；毒； A型型最早由最早由Wel

14、ch andNuttal(1892)分离，分离， 所以叫卫氏所以叫卫氏/魏氏梭菌魏氏梭菌 C型型：可引起肠炎。：可引起肠炎。 *对人致病的主要是对人致病的主要是A、C和和F型型 *引起食物中毒的主要是引起食物中毒的主要是A型型 4 4、培养基和试剂、培养基和试剂4.1 4.1 庖肉培养基庖肉培养基 产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化 4.2 4.2 亚硫酸盐亚硫酸盐- -多粘菌素多粘菌素- -磺胺嘧啶琼脂磺胺嘧啶琼脂（SPSSPS） - - 能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及 铁盐铁盐( (含有柠檬

15、酸铁胺含有柠檬酸铁胺) )的琼脂中形成的琼脂中形成黑色菌落黑色菌落；前面前面 分离培养和计数用分离培养和计数用 （SPS）4.3 液体硫乙醇酸盐培养基（液体硫乙醇酸盐培养基（FT） 大量培养该菌用大量培养该菌用4.4 动力动力硝酸盐培养基硝酸盐培养基 -无鞭毛，不运动无鞭毛，不运动； 还原硝酸盐为亚硝酸盐还原硝酸盐为亚硝酸盐 4.5 4.5 含铁牛奶培养基含铁牛奶培养基 -发酵发酵牛奶中的牛奶中的乳糖乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎 裂，裂， 即所谓即所谓暴风雨式发酵暴风雨式发酵”/”/“暴烈发酵暴烈发酵”，这是，这是本菌的本菌的 重要生化特征之一，也是

16、鉴别的主要指标。观察重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2 2h h， 5h 5h不发酵为阴性不发酵为阴性Iron Milk Medium. It is a medium used in Most Probable Number analysis of Clostridium perfringens. When placed at 45C, CP is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation (seen in the right tube). The coagulation of milk

17、 fat forms a plug thereby restricting oxygen (which is necessary for this strict anaerobe). Stormy fermenation usually occurs within 6 to 8 hourswww.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html4.6 4.6 卵黄琼脂培养基卵黄琼脂培养基 检查检查卵磷脂酶卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳阳性，接种点（每个平板接性，接种点（每个平板接 种种1010点以上）的底部及其周围形成乳白色的浑浊带。点以上）的底部及其周围形

18、成乳白色的浑浊带。4.7 0.14.7 0.1 蛋白胨水稀释剂；蛋白胨水稀释剂；4.8 4.8 硝酸盐还原试剂硝酸盐还原试剂: :甲萘胺液和对氨基苯磺酸液甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；4.9 4.9 革兰氏染色液。革兰氏染色液。www.pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html肉毒梭菌肉毒梭菌对比对比5 5、检验程序、检验程序 计数计数30300个个菌落的稀释倍数菌落的稀释倍数活菌计数培养活菌计数培养检验程序检验程序续续36，1824h36，24h 46,25h 爆发酵爆发酵无无6 6、说明、说明 1 1活菌计数培养活菌计数培养 ：1 1：1010稀释的样品用蛋

19、白胨水依次稀释的样品用蛋白胨水依次 稀释至稀释至1010-2-21010-6-6倍，取倍，取1 1mlml放入放入2 2个平板，分别加个平板，分别加 15 15ml SPSml SPS琼脂，于琼脂，于3636培养培养2424h h，选取长有选取长有3030030300 个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。 www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html2 2、证实试验、证实试验 (1)(1)纯培养：纯培养：由平板上任取由平板上任取1010个黑色菌落，分别接种个黑色菌落，分别接种 FT FT培养基，于培养基，于(361)(361

20、)培养培养18182424h h，大量繁殖。，大量繁殖。 (2)(2)菌体形态和染色检验菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏：用培养液涂片，革兰氏 染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性 粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于 菌体中央或近端。菌体中央或近端。(3)(3)检查动力和硝酸盐还原实验：检查动力和硝酸盐还原实验： 用用接接种种环环( (针针) )穿穿刺刺接接种种动动力力硝硝酸酸盐盐培培养养基基，于于(36 1)(36 1)培养培养2424h.h. -判断有无动力判断有无动力-产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌无无动力动力； -滴滴

21、加加硝硝酸酸盐盐还还原原试试剂剂“甲甲萘萘胺胺液液和和对对氨氨基基苯苯磺磺酸酸液液”各各0.5 0.5 mlml，观观察察硝硝酸酸盐盐是是否否被被还还原原-产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌，能能将将硝硝酸酸盐盐还还原原为为亚亚硝硝酸酸盐盐。 （红色红色） (4)牛乳乳糖发酵产气牛乳乳糖发酵产气“暴发酵暴发酵”试验：试验： 取生长旺盛的取生长旺盛的FT培养培养液液1ml接种于含铁牛乳培接种于含铁牛乳培养基，在养基，在46水浴中培养水浴中培养2h后观察有无后观察有无“暴发酵暴发酵”现象。现象。5h内不发酵者为阴内不发酵者为阴性。性。 产气荚膜梭菌发酵产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并乳糖，产酸凝固酪蛋

22、白并大大 量产气，呈量产气，呈“暴风雨式暴风雨式发酵发酵”现象，但培养基不现象，但培养基不变黑。变黑。(5)(5)卵磷脂酶检查试验：卵磷脂酶检查试验：用接种环取用接种环取FTFT培养液点种于卵黄培养液点种于卵黄 琼脂平板琼脂平板( (每块平板每块平板 至少可接种至少可接种1010点点) )，于厌氧，于厌氧 培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵 磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及 周围乳白色的混浊带。周围乳白色的混浊带。3 3、菌数计算、菌数计算 根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计算根据黑色菌落

23、的计数和证实试验的结果，计算1 1 g(mlg(ml) )食品检样的含菌数。食品检样的含菌数。 例如：例如：10104 4稀释液的平板长有黑色菌落稀释液的平板长有黑色菌落100100个，而供做个，而供做证实试验的证实试验的1010个菌落中有个菌落中有7 7个被确证为产气荚膜梭菌，则个被确证为产气荚膜梭菌，则1 1g(mLg(mL) )食品检样所含产气荚膜梭菌数为食品检样所含产气荚膜梭菌数为计算：计算：www.msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html复习题1、食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标就食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标就验食品被该菌污染的程度，因此，其检验验食品被该菌污染的程度，因此，其检验的重点项目是的重点项目是活菌活菌数数测定测定及及证实试验。证实试验。能能引起奶中乳糖引起奶中乳糖暴发酵暴发酵。2 2、对、对产气荚膜梭菌的检验程序进行说明。产气荚膜梭菌的检验程序进行说明。