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1、第二章第二章 柱色谱法和纸色谱法柱色谱法和纸色谱法 l第一节第一节 柱上色谱法柱上色谱法l柱上色谱可分为柱上色谱可分为: : 柱上吸附色谱法、柱上吸附色谱法、l 柱上离子交换色谱法、柱上离子交换色谱法、l 柱上分配色谱法、柱上分配色谱法、l 柱上凝胶色谱法。柱上凝胶色谱法。l。柱上色谱法是比较古老的（柱上色谱法是比较古老的（1903年，年，Tswett提出来）。由提出来）。由于此法分离效率低，速度慢，因之在五十年代以前为主要于此法分离效率低，速度慢，因之在五十年代以前为主要的分离技术，但五十年代后，由于其它色谱技术（薄层色的分离技术，但五十年代后，由于其它色谱技术（薄层色谱、气相色谱）的出现，
2、其应用受到很大限制。谱、气相色谱）的出现，其应用受到很大限制。但是由于此种方法所用但是由于此种方法所用设备和操作方法都比较简单设备和操作方法都比较简单，可处可处理大量样品理大量样品，在有机分析中，主要可用于有机样品的提纯在有机分析中，主要可用于有机样品的提纯（脱脂、脱色、脱胶、脱水），初步分离或制备纯样品等，（脱脂、脱色、脱胶、脱水），初步分离或制备纯样品等，因之该法仍然为人们所采用。因之该法仍然为人们所采用。此外，随着天然产物化学的发展，许多天然有机物的应用此外，随着天然产物化学的发展，许多天然有机物的应用价值日益提高，而这些化合物往往又难于合成，因之从天价值日益提高，而这些化合物往往又难于
3、合成，因之从天然界提取就成了唯一来源，这就必须采用制备型柱色谱技然界提取就成了唯一来源，这就必须采用制备型柱色谱技术。故柱色谱也是植物化学工作的主要技术之一。术。故柱色谱也是植物化学工作的主要技术之一。l1柱上吸附色谱法柱上吸附色谱法l原理：原理：l按照各组分在吸附剂上的吸附能力大小来分离的。按照各组分在吸附剂上的吸附能力大小来分离的。l吸附剂的选择（凭经验决定吸附剂的选择（凭经验决定 ）：）：l一种合适的吸附剂应该具备这样一些条件：一种合适的吸附剂应该具备这样一些条件：l（1 1）它能够可逆地吸附待层析的物质；）它能够可逆地吸附待层析的物质；l（2 2）它不会引起被吸附物质的化学变化；）它不
4、会引起被吸附物质的化学变化；l（3 3）它的粒度大小应该能使显层剂以合适的速率流过；）它的粒度大小应该能使显层剂以合适的速率流过；l（4 4）吸附剂最好是白色的或浅色的，以便于对色层带进行观察；）吸附剂最好是白色的或浅色的，以便于对色层带进行观察；l（5 5）颗粒具有一定的机械强度，操作时不易破碎；）颗粒具有一定的机械强度，操作时不易破碎；l（6 6）不能与待分离物质及流动相产生化学反应，也不应相互溶解。）不能与待分离物质及流动相产生化学反应，也不应相互溶解。l一般弱极性溶质宜选用强极性吸附剂，而强极性溶质宜用弱极性吸附剂。一般弱极性溶质宜选用强极性吸附剂，而强极性溶质宜用弱极性吸附剂。l最常
5、用的吸附剂：最常用的吸附剂：氧化铝和硅胶。氧化铝和硅胶。它们能符合上述要它们能符合上述要求，并且经过不同处理可以随意得到不同的活度。例如，氧求，并且经过不同处理可以随意得到不同的活度。例如，氧化铝可以在不同温度烘干达到各种不同的活度。化铝可以在不同温度烘干达到各种不同的活度。l必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法并不一定最合适，因必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法并不一定最合适，因为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗脱下来。为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗脱下来。l其他较常用的吸附剂有：其他较常用的吸附剂有：l氧化镁（用于吸附烃、醇、酮、醚及硝基物等），碳酸钙氧化镁（用于吸附烃、
6、醇、酮、醚及硝基物等），碳酸钙（用于吸附叶绿素）（用于吸附叶绿素）l硫酸钙（用于吸附花色苷、维生素硫酸钙（用于吸附花色苷、维生素K1），氧化钙、氧化钛、），氧化钙、氧化钛、碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠（应用于吸附叶绿素），滑石碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠（应用于吸附叶绿素），滑石粉（用于吸附有机酸、酚类、粉（用于吸附有机酸、酚类、2,4-二硝基苯腙），硅藻土、二硝基苯腙），硅藻土、蔗糖（用于吸附叶绿素）及淀粉等蔗糖（用于吸附叶绿素）及淀粉等。l许多吸附剂遇水即失去活性，这时只能用无水溶剂。许多吸附剂遇水即失去活性，这时只能用无水溶剂。 l实验技术实验技术l吸附剂的粒度及用量：吸附剂的粒度及用量：一
7、般在一般在80300目间变动。粒目间变动。粒度细，分离效果好，但速度太慢。吸附剂的用量，度细，分离效果好，但速度太慢。吸附剂的用量，一般为样品的一般为样品的3050倍，有时达倍，有时达100100倍。倍。l色谱柱：色谱柱：很简单，只需要一支适当长度、适当口径的玻璃管，很简单，只需要一支适当长度、适当口径的玻璃管，管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可。柱长与管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可。柱长与内径之比在内径之比在10 1 4 4 1间较好。间较好。l装柱方法有两种：装柱方法有两种：干法装柱干法装柱，将吸附剂由柱口装入，将吸附剂由柱口装入，边装边轻敲打，以使吸附剂装填密实均
8、匀。吸附剂装完边装边轻敲打，以使吸附剂装填密实均匀。吸附剂装完后，把淋洗剂沿管壁轻轻加入，使之浸润吸附剂，淋洗后，把淋洗剂沿管壁轻轻加入，使之浸润吸附剂，淋洗剂加入后发现柱内有气泡时，可敲打柱体或施加适当压剂加入后发现柱内有气泡时，可敲打柱体或施加适当压力以压缩气泡，使气泡随淋洗剂一起排出。力以压缩气泡，使气泡随淋洗剂一起排出。湿法装柱湿法装柱，有两种操作方法：方法有两种操作方法：方法：先将柱体下端活塞拧死，向：先将柱体下端活塞拧死，向柱内加入一定高度之淋洗剂，然后将吸附剂自上端慢慢柱内加入一定高度之淋洗剂，然后将吸附剂自上端慢慢加入，淋洗剂的液面一定要高出吸附剂层。吸附剂加完加入，淋洗剂的液
9、面一定要高出吸附剂层。吸附剂加完后，打开活塞，放出淋洗剂，直至吸附剂层不在沉降为后，打开活塞，放出淋洗剂，直至吸附剂层不在沉降为止。方法止。方法：将吸附剂用淋洗剂调成糊状，慢慢倒入柱：将吸附剂用淋洗剂调成糊状，慢慢倒入柱中，在保证淋洗剂液面略高于吸附层条件下，让淋洗剂中，在保证淋洗剂液面略高于吸附层条件下，让淋洗剂自柱中慢慢流出，直至吸附剂沉降不在变动为止。不论自柱中慢慢流出，直至吸附剂沉降不在变动为止。不论何种方法装柱，要求装好之柱体密实均匀，无气泡，在何种方法装柱，要求装好之柱体密实均匀，无气泡，在淋洗过程中无裂纹出现，一般湿法装柱比干法好。淋洗过程中无裂纹出现，一般湿法装柱比干法好。l被
10、被分分离离样样品品的的准准备备：柱柱色色谱谱所所用用样样品品溶溶液液一一般般配配成成较较浓浓的的溶溶液液，最最好好为为饱饱和和液液，这这样样样样品品加加到到柱柱顶顶集集中中，分分离离效效果果好好，配配制制样样品品所所用用的的溶溶剂剂极极性性要要小小，以以利利于于样样品品立立即即被被吸吸附附剂剂吸吸附附。如如果果样样品品在在低低级级性性的的溶溶剂剂中中溶溶解解度度很很低低，最最好好将将样样品品用用一合适的溶剂溶解，再与吸附剂相拌，低温烘干待上样一合适的溶剂溶解，再与吸附剂相拌，低温烘干待上样。l上上样样：样样品品溶溶液液配配好好后后可可开开始始加加样样，方方法法为为当当柱柱内内淋淋洗洗剂剂流流至
11、至液液面面与与吸吸附附剂剂面面相相平平时时，将将样样品品溶溶液液沿沿管管壁壁加加入入柱柱内内，注注意意不不要要让让样样品品溶溶液液自自由由落落下下而而打打乱乱柱柱顶顶吸吸附附剂剂层层。当当样样品品液液面面和和吸吸附附剂剂面面相相平平时时，用用样样品品溶溶剂剂数数滴滴沿沿管管壁壁加加入入，以以洗洗净净管管壁壁上上的的样样品品液液，当当液液面面与与吸吸附附剂剂面面再再次次相相平平时时，加加入入显显层层剂剂进进行行显显层层。如如果果是是和和吸吸附附剂剂相相拌拌的的样样品品，将将柱柱内内淋淋洗洗剂剂不不要要流流至至与与吸吸附附剂剂面面相相平平，要要保保持持一一定定的的淋淋洗洗剂剂高高度度，将将样样品品
12、粉粉末末缓缓缓缓地地加加入入，并并轻轻轻轻敲敲击击柱柱子子使使气气泡泡充充分分地地排排除除，加加完完样样品品后后，让让淋淋洗洗剂剂流流至至与与吸吸附附剂剂表表面面相相平平，用用样样品品溶溶剂剂数数滴滴沿沿管管壁壁加加入入，以以洗洗净净管管壁壁上上的的样样品品液液，当当液液面面与与吸吸附附剂剂面面再再次相平时，加入显层剂进行显层。次相平时，加入显层剂进行显层。 显层显层: 使样品各组分在柱内进行分离的过程叫显层，使样品各组分在柱内进行分离的过程叫显层，此此过过程中所用的溶程中所用的溶剂剂叫叫显层剂显层剂。l显层剂的选择显层剂的选择 :一般来说，显层剂的极性比样品极性小些。一般来说，显层剂的极性比
13、样品极性小些。常用的显层剂有石油醚，二硫化碳，苯，四氯化碳，氯仿常用的显层剂有石油醚，二硫化碳，苯，四氯化碳，氯仿（代表弱极性显层剂），乙醚，异丙醚（中等显层剂），（代表弱极性显层剂），乙醚，异丙醚（中等显层剂），低分子量的醇、酮（强显层剂）等，一般可用单一种，也低分子量的醇、酮（强显层剂）等，一般可用单一种，也可用混合剂，一般先试之，最后确定出合适之显层剂来。可用混合剂，一般先试之，最后确定出合适之显层剂来。l显层方法：显层方法：待柱上样品液面与吸附剂面相平后，加入显层待柱上样品液面与吸附剂面相平后，加入显层剂，并始终保持显层剂面高出吸附剂面，待第一个组分估剂，并始终保持显层剂面高出吸附剂面
14、，待第一个组分估计由柱下端开始流出时，停止加显色剂，显层结束。计由柱下端开始流出时，停止加显色剂，显层结束。l注意：注意： 有机物自吸附剂上被洗提出来的先后次序一般是：有机物自吸附剂上被洗提出来的先后次序一般是：饱和烃，烯烃，双烯烃，芳烃，醚，酯，酮，醇，二元醇饱和烃，烯烃，双烯烃，芳烃，醚，酯，酮，醇，二元醇及羧酸。及羧酸。l色层的分离方法：色层的分离方法：l（1 1）推出法：将吸附剂自吸附管中推出，用小刀将各色）推出法：将吸附剂自吸附管中推出，用小刀将各色层带切开，分别用适当溶剂提取，滤去吸附剂，将滤液浓缩层带切开，分别用适当溶剂提取，滤去吸附剂，将滤液浓缩就可以得到各组分。当用这种办法分
15、离时，吸附柱玻璃管不就可以得到各组分。当用这种办法分离时，吸附柱玻璃管不能用下口紧缩的，而必须是两头都开的。能用下口紧缩的，而必须是两头都开的。l（2 2）洗提法：待显层后，用一种极性较强、吸附力较大）洗提法：待显层后，用一种极性较强、吸附力较大的溶剂将各组分依次顶替下来，用几个接收器分别接收流出的溶剂将各组分依次顶替下来，用几个接收器分别接收流出的各个组分。这一步骤常称为的各个组分。这一步骤常称为“洗提洗提”。洗提用的溶剂称为。洗提用的溶剂称为洗提剂。将各分洗提液分别浓缩即得到各组分。洗提剂。将各分洗提液分别浓缩即得到各组分。l无色物质层析时找出色层带的方法：无色物质层析时找出色层带的方法：
16、l将将吸吸附附柱柱系系统统地地切切断断，将将各各段段逐逐一一用用溶溶液液洗洗提提，鉴鉴定定各各洗洗提液中的物质。提液中的物质。l连连续续地地洗洗提提吸吸附附柱柱，分分别别用用接接收收器器接接收收一一定定量量的的洗洗提提液液，然后鉴定各洗提液中的物质。然后鉴定各洗提液中的物质。l层析完毕后，用显色剂显色。（常用的显色剂下表）。层析完毕后，用显色剂显色。（常用的显色剂下表）。l用用紫紫外外光光照照射射，使使能能发发荧荧光光的的物物质质发发生生荧荧光光。对对于于不不发发荧荧光光的的无无色色物物质质，可可以以用用发发荧荧光光的的吸吸附附剂剂。就就是是在在普普通通吸吸附附剂剂中中加加入入某某种种能能在在
17、在在紫紫外外光光照照射射下下发发荧荧光光的的无无机机物物（如如硫硫酸酸锌锌）或或有有机机染染料料。该该荧荧光光染染料料不不致致降降低低吸吸附附剂剂的的活活性性，且且在在给给定定的的吸吸附附条条件件下下又又不不会会被被洗洗提提出出来来为为宜宜。这这时时在在柱柱上上形形成成的的色色层层带带相相应应地地改改变变了了吸吸附附剂剂原原来来的的荧荧光光的的强强度度，借借这这种种改改变变可可以以了了解解色色层层带带的的位位置置。常常用用的的荧荧光光染染料料如如桑桑色色素素（morin）用用于于三三氧氧化化铝铝柱柱，小小檗檗碱碱（berberine）用用于于硅硅胶胶柱柱，二二苯苯基基荧荧光光吲吲啶啶磺磺酸酸（
18、diphenylfluorin-dine sulfone sulfonic acid）及桑色素用于氧化镁或氢氧化钙柱。及桑色素用于氧化镁或氢氧化钙柱。l制备有色衍生物，然后进行色谱分析。制备有色衍生物，然后进行色谱分析。 l柱上层析常用的各种显色剂柱上层析常用的各种显色剂* l化合物化合物 显色剂显色剂 l烯烯 烃烃 先用先用3mg藏红溶于藏红溶于25 mL水的溶液处理，然后用水的溶液处理，然后用0.1mol/LKI溶液（加有溶液（加有45滴）处理，藏滴）处理，藏l 红的原来颜色被漂白，但当含有不饱和烃、砜、二芳基胺或三芳基胺存在时，色层带上红的原来颜色被漂白，但当含有不饱和烃、砜、二芳基胺或
19、三芳基胺存在时，色层带上l 红色重新出现。红色重新出现。 l醇类醇类 四个碳原子以上的醇可先用每升含四个碳原子以上的醇可先用每升含200至至300mg钒酸铵溶液处理，再用钒酸铵溶液处理，再用8-羟基喹啉溶于羟基喹啉溶于l 6%的乙酸所成的的乙酸所成的2.5%的溶液处理。色层带在暗绿色背景上显橙棕色。的溶液处理。色层带在暗绿色背景上显橙棕色。l酚类酚类 1香草醛溶于浓硫酸所成香草醛溶于浓硫酸所成1%的溶液，色层带显淡红至红色。的溶液，色层带显淡红至红色。l 2重氮盐溶液，色层带显黄至红色。重氮盐溶液，色层带显黄至红色。醛与酮类醛与酮类 用用2,4-二硝基苯肼饱和的二硝基苯肼饱和的2mol/L溶液
20、，色层带显黄色，醛用希夫试剂处理，显紫红色。溶液，色层带显黄色，醛用希夫试剂处理，显紫红色。 胺胺 1四氯对醌在四氯对醌在1,4-二氧六环中的饱和溶液是对脂肪胺的最好显色剂，在橙色背景上色层二氧六环中的饱和溶液是对脂肪胺的最好显色剂，在橙色背景上色层 带显绿色。带显绿色。 21%氟硼酸对硝基亚氮盐水溶液是检出芳胺色层带的很有效显色剂。色层带呈橙至红氟硼酸对硝基亚氮盐水溶液是检出芳胺色层带的很有效显色剂。色层带呈橙至红 色，酚类也有同样反应。色，酚类也有同样反应。 硫醇硫醇 于于7.5gNaOH7.5gNaOH在在40mL40mL水内所形成的溶液中加入水内所形成的溶液中加入1.25gPbO1.2
21、5gPbO作为显色剂，如有黄色的色层带出现，作为显色剂，如有黄色的色层带出现， 表示有硫醇存在，这时如再用硫在苯中的饱和溶液处理，色层带即转变为灰色至黑色。表示有硫醇存在，这时如再用硫在苯中的饱和溶液处理，色层带即转变为灰色至黑色。 硫醚硫醚 以以0.5gKI0.5gKI溶于溶于25mL25mL水中，再加入两滴水中，再加入两滴2M2M氯化金溶液，作显色剂，硫醚色层带在粉红色背景氯化金溶液，作显色剂，硫醚色层带在粉红色背景 上显棕至黑色，胺有同样反应，但胺的吸附力强，留在柱的上端，因此得与硫醚区别。上显棕至黑色，胺有同样反应，但胺的吸附力强，留在柱的上端，因此得与硫醚区别。 芳环芳环 将将10m
22、L10mL浓硫酸与浓硫酸与0.2mL37%0.2mL37%的甲醛溶液混合作显色剂，单环芳烃显红的色带。一般说来，双环或多环芳的甲醛溶液混合作显色剂，单环芳烃显红的色带。一般说来，双环或多环芳 烃显绿色或蓝绿色色层带，此种溶液必须当天配制。烃显绿色或蓝绿色色层带，此种溶液必须当天配制。 * *本表所列各显色剂是在以苯作为显层剂，以硅胶作为吸附剂的情况下使用的，本表中各试剂的百分本表所列各显色剂是在以苯作为显层剂，以硅胶作为吸附剂的情况下使用的，本表中各试剂的百分浓度，均指重量百分比。浓度，均指重量百分比。l2柱上离子交换色谱法柱上离子交换色谱法 l1）离子交换树脂）离子交换树脂 l柱上离子交换色
23、谱主要用来除去样品中微量电介质杂质。其装柱上离子交换色谱主要用来除去样品中微量电介质杂质。其装置与柱上吸附色谱相同。固定相为离子交换树脂。置与柱上吸附色谱相同。固定相为离子交换树脂。l离子交换树脂的种类很多，但可分为两大类型：阴离子交换树离子交换树脂的种类很多，但可分为两大类型：阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。均为高分子化合物。脂和阳离子交换树脂。均为高分子化合物。 阳离子交换树脂一般为阳离子交换树脂一般为Na型（高分子钠盐）。使用前要用稀型（高分子钠盐）。使用前要用稀盐酸浸泡处理为盐酸浸泡处理为H型，然后进行交换，以磺化交联聚苯乙烯型，然后进行交换，以磺化交联聚苯乙烯为例，再生和交换原理如下
24、表示：为例，再生和交换原理如下表示：此外还有交联丙烯酸盐或磷酸盐等阳离子交换树脂。此外还有交联丙烯酸盐或磷酸盐等阳离子交换树脂。 阴离子交换树脂一般为高分子的氯化季铵盐化合物，称阴离子交换树脂一般为高分子的氯化季铵盐化合物，称Cl型，型，使用前要用稀碱处理为使用前要用稀碱处理为OH型，然后交换，以交联聚苯乙烯氯型，然后交换，以交联聚苯乙烯氯化季铵盐为例，其再生和交换如下：化季铵盐为例，其再生和交换如下： 此外，其它类型阴离子交换树脂还有交联丙烯酸仲铵型、叔铵此外，其它类型阴离子交换树脂还有交联丙烯酸仲铵型、叔铵型或季铵型。型或季铵型。 2） 装柱：取一支装柱：取一支400mm10mm滴定管，下
25、端放少许玻璃滴定管，下端放少许玻璃棉，关闭活塞，将处理好的树脂倒入至棉，关闭活塞，将处理好的树脂倒入至150200mm高度即高度即可。可。 由于每种树脂都有一定的交换能力，一般每毫克干树脂由于每种树脂都有一定的交换能力，一般每毫克干树脂约可交换约可交换19mmol离子，但一般操作中，只需交换二分之离子，但一般操作中，只需交换二分之一最大量即可。据此就可算出树脂的用量及柱体的大小。一最大量即可。据此就可算出树脂的用量及柱体的大小。3）交换：将待测样品液由装好的柱上部倒入，由）交换：将待测样品液由装好的柱上部倒入，由柱下部放出，或由下部加入而由上部排出。但流速柱下部放出，或由下部加入而由上部排出。
26、但流速应以待处理溶液在柱内有一定停留时间为准。应以待处理溶液在柱内有一定停留时间为准。4）洗提：样品液处理完后，用另一种电解质通入）洗提：样品液处理完后，用另一种电解质通入柱内，将已交换于柱上的离子用新的离子顶替出来，柱内，将已交换于柱上的离子用新的离子顶替出来，从而达到分离或提取目的。从而达到分离或提取目的。5）再生：再生是树脂恢复为）再生：再生是树脂恢复为H型或型或OH型的操作，型的操作，此步可与洗提为同步，也可不同步，不同步时，即此步可与洗提为同步，也可不同步，不同步时，即用酸或碱浸泡树脂即可。用酸或碱浸泡树脂即可。l6）举例：）举例：lA 糖中除酸（葡萄糖中除去柠檬酸）糖中除酸（葡萄糖
27、中除去柠檬酸）l向向阴阴离离子子交交换换柱柱中中通通入入糖糖液液，则则柠柠檬檬酸酸负负离离子子被被交交换换于于树树脂脂上上，排排出出糖糖液液，则则达达到到分分离离目目的的。树树脂脂用用碳碳酸酸铵铵液液洗洗提提，则则得得柠柠檬檬酸酸铵铵溶溶液液。然然后树脂再用后树脂再用NaOH液再生。液再生。B 除去羰基化合物除去羰基化合物异丙醇中除去少量丙酮。异丙醇中除去少量丙酮。向阴离子交换柱中加入亚硫酸氢钠液，则亚硫酸氢根负离向阴离子交换柱中加入亚硫酸氢钠液，则亚硫酸氢根负离子交换于树脂上，用水洗至无碱性，然后通入异丙醇丙酮子交换于树脂上，用水洗至无碱性，然后通入异丙醇丙酮样品，则丙酮与交换于柱上之亚硫酸
28、氢根负离子加成而留样品，则丙酮与交换于柱上之亚硫酸氢根负离子加成而留于树脂上，而余下之异丙醇则流出，从而达到分离目的。于树脂上，而余下之异丙醇则流出，从而达到分离目的。然后向柱中再通入稀然后向柱中再通入稀NaCl液，则氯离子顶替出亚硫酸氢钠液，则氯离子顶替出亚硫酸氢钠和丙酮，完成洗涤任务，最后树脂再于碱液中再生。和丙酮，完成洗涤任务，最后树脂再于碱液中再生。离子交换色谱交换物质量很小，只适于半微量样品离子交换色谱交换物质量很小，只适于半微量样品中微量杂质的除去。另外一般要求样品为水溶液时中微量杂质的除去。另外一般要求样品为水溶液时才好交换，而且交换下来的洗提液都很稀，组分回才好交换，而且交换下
29、来的洗提液都很稀，组分回收困难，故对于样品已处于很稀溶液时而且再无更收困难，故对于样品已处于很稀溶液时而且再无更好分离方法时才用此法。好分离方法时才用此法。除了上述吸附柱色谱和离子交换柱色谱外，除了上述吸附柱色谱和离子交换柱色谱外，还有凝胶柱色谱和分配柱色谱。还有凝胶柱色谱和分配柱色谱。 纸上色谱法是分配色谱法中较常用的。纸上色谱法是分配色谱法中较常用的。l最简单操作之一是取一条滤纸，悬挂在一个支架上，使它的最简单操作之一是取一条滤纸，悬挂在一个支架上，使它的底端浸入一盛有溶剂的浅皿中。在纸下端刚好高出液面部分底端浸入一盛有溶剂的浅皿中。在纸下端刚好高出液面部分用毛细管滴上一滴试液。将支架置于
30、密闭容器内，使纸周围用毛细管滴上一滴试液。将支架置于密闭容器内，使纸周围为溶剂蒸汽所饱和，静置数小时，在这期间，溶剂由于纸上为溶剂蒸汽所饱和，静置数小时，在这期间，溶剂由于纸上毛细管作用而沿滤纸上升。当溶剂前沿升到快近纸条上端时，毛细管作用而沿滤纸上升。当溶剂前沿升到快近纸条上端时，取下滤纸使之干燥。如果试液中的化合物是有颜色的，则纸取下滤纸使之干燥。如果试液中的化合物是有颜色的，则纸上会显出各组分斑点。较常见的情况是，层析的化合物是无上会显出各组分斑点。较常见的情况是，层析的化合物是无色的，那么，待纸干燥后，于纸上喷以显色剂而使化合物斑色的，那么，待纸干燥后，于纸上喷以显色剂而使化合物斑点显
31、色。上法为点显色。上法为上行纸上色谱法。上行纸上色谱法。第二节第二节 纸上色谱法纸上色谱法同理也有下行纸上色谱法。上行法一般需时间较多，同理也有下行纸上色谱法。上行法一般需时间较多，但溶质在两相中的分配较易达到平衡。所以产生的斑但溶质在两相中的分配较易达到平衡。所以产生的斑点面积紧凑园整。组分易于分开。下行法快，省时间，点面积紧凑园整。组分易于分开。下行法快，省时间，对易分离化合物最好采用下行法。此外也可采用双向对易分离化合物最好采用下行法。此外也可采用双向纸上色谱法。纸上色谱法。纸上色谱法的纸上色谱法的Rf值，通常要受到下列因素的影响：值，通常要受到下列因素的影响：（1）纸的质量；（）纸的质
32、量；（2）温度；（）温度；（3）化合物取量；）化合物取量；（4）溶剂；（）溶剂；（5）试样原点与溶剂液面之间的距离。）试样原点与溶剂液面之间的距离。l利利用用纸纸上上色色谱谱法法的的Rf值值作作为为鉴鉴定定有有机机化化合合物物的的凭凭据据时时，最最好好用用已已知知标标准准样样品品在在相相同同实实验验条条件件下下，平平行行对对照照层层析析。如如果果两两者者Rf值相同，方可断定是同一物质。值相同，方可断定是同一物质。l为了使纸上色谱法得到正确结果，必须注意下列事项：为了使纸上色谱法得到正确结果，必须注意下列事项：l不不要要用用手手指指直直接接接接触触层层析析部部分分的的滤滤纸纸，以以防防手手上上油
33、油渍渍染染污污滤滤纸。纸。l滤纸必须剪平整。滤纸必须剪平整。l滤滤纸纸周周围围必必须须被被溶溶剂剂蒸蒸气气所所饱饱和和。否否则则就就有有可可能能当当显显层层剂剂达达到到纸纸上上某某一一处处时时，它它的的蒸蒸发发速速度度大大于于毛毛细细管管吸吸引引速速度度，致致使使已已经经分分开开的的各各组组分分重重新新在在这这里里聚聚集集。随随溶溶剂剂蒸蒸气气压压的的大大小小不不同同和和层层析析缸缸的的大大小小不不同同，使使容容器器中中充充满满溶溶剂剂饱饱和和蒸蒸气气的的时时间间可可以以由由几分钟至数小时。几分钟至数小时。l 所用有机溶剂一般需要事先用水饱和，以便当它在纸面所用有机溶剂一般需要事先用水饱和，以
34、便当它在纸面上移动时，有足够水分供给滤纸吸附。不过溶剂中水分不上移动时，有足够水分供给滤纸吸附。不过溶剂中水分不能太多，否则层析时，得不到良好分离。一般含水量不超能太多，否则层析时，得不到良好分离。一般含水量不超过过1020%（重量百分比）。（重量百分比）。此外使用蒸气压太低的溶剂有时不太合适。因为它们很难此外使用蒸气压太低的溶剂有时不太合适。因为它们很难干燥除去，以致影响显色反应。使用蒸气压太高的溶剂要干燥除去，以致影响显色反应。使用蒸气压太高的溶剂要注意它们对温度的变化很敏感。容易在纸上蒸发逸去，以注意它们对温度的变化很敏感。容易在纸上蒸发逸去，以致当温度控制不严时，往往引起液相的不规则变
35、化。致当温度控制不严时，往往引起液相的不规则变化。进行纸上色谱时，往往采用混合溶剂。下表中列举了一些进行纸上色谱时，往往采用混合溶剂。下表中列举了一些有机化合物进行纸上色谱分析法所常用的溶剂和显色剂。有机化合物进行纸上色谱分析法所常用的溶剂和显色剂。l某些有机化合物纸上层析所常用的溶剂和显色剂某些有机化合物纸上层析所常用的溶剂和显色剂化合物化合物 溶剂系统溶剂系统 斑点显色剂斑点显色剂有机酸有机酸 甲酸与下列溶剂混合：乙醇、丙醇甲酸与下列溶剂混合：乙醇、丙醇-2， 溴甲酚绿或溴酚蓝在乙醇中的溶液。溴甲酚绿或溴酚蓝在乙醇中的溶液。 正丁醇及其它醇或酮正丁醇及其它醇或酮酸的酰肼酸的酰肼 丙酮饱和的
36、丙酮饱和的pH11.6的缓冲液的缓冲液 化合物本身有色化合物本身有色羟基及羰基酸羟基及羰基酸 甲苯甲苯- -乙酸，正丁醇乙酸，正丁醇- -丙酸丙酸 氨及氨及nessler试剂，邻苯二胺及紫外光。试剂，邻苯二胺及紫外光。羰基酸及一切羰基酸及一切 正丁醇正丁醇 KOHKOH溶液（溶液（10%10%） 羰基酸化合物羰基酸化合物的的2,4-2,4-二硝基二硝基苯腙苯腙有机酸的羟肟有机酸的羟肟 苯酚苯酚- -异丁酸异丁酸 三氯化铁三氯化铁 酸衍生物酸衍生物氨基酸氨基酸 苯酚、苯酚苯酚、苯酚- -氨，三甲吡啶，氨，三甲吡啶，2,4-2,4-二甲二甲 水合三酮氢茚（水合三酮氢茚（0.10.10.2%0.2%
37、乙醇溶液）。乙醇溶液）。 吡啶，吡啶，2-2-甲基吡啶，叔丁醇，正丁醇。甲基吡啶，叔丁醇，正丁醇。含硫氨基酸含硫氨基酸 叔丁醇叔丁醇 铂碘酸钾水溶液铂碘酸钾水溶液氨基酸的氨基酸的2,4-2,4-二二 正丁醇正丁醇- -乙酸，三甲吡啶苯酚乙酸，三甲吡啶苯酚 化合物本身有色化合物本身有色 硝基氟苯衍生物硝基氟苯衍生物 醇的醇的2,4-2,4-二硝基二硝基 甲醇甲醇- -丙酮，甲醇丙酮，甲醇- -乙烷，丙醇乙烷，丙醇-2-2，吡啶，吡啶 5%KOH5%KOH溶液溶液 苯甲酸脂苯甲酸脂 胺胺 正丁醇正丁醇-乙酸乙酸 水合三酮氢茚，碘溶液水合三酮氢茚，碘溶液羰基化合物的羰基化合物的 乙醚乙醚- -乙烷，
38、丙酮乙烷，丙酮- -乙烷乙烷 KOHKOH（10%10%） 2,4-2,4-二硝基苯腙二硝基苯腙 酚衍生物，甲基酚衍生物，甲基 正丁醇正丁醇-氨氨 对硝基苯重氮氟硼酸盐对硝基苯重氮氟硼酸盐 苯酚苯酚苯偶氮苯磺酸盐苯偶氮苯磺酸盐 异丁醇异丁醇-Na-Na2 2COCO3 3水溶液水溶液 化合物有色化合物有色糖糖 正丁醇正丁醇- -乙酸；乙酸乙酯乙酸；乙酸乙酯- -吡啶吡啶- -水；水； 对氨基二甲苯胺（锡盐），硝酸盐溶液，对氨基二甲苯胺（锡盐），硝酸盐溶液，3,5-3,5-二二 正丁醇正丁醇- -三甲吡啶三甲吡啶 硝基水杨酸溶液，对氨基马脲酸乙醇溶液（硝基水杨酸溶液，对氨基马脲酸乙醇溶液（0.3
39、%0.3%）。）。 l此外还可用圆形滤纸作纸上色谱分析，此外还可用圆形滤纸作纸上色谱分析，为了利用纸上色谱法原理分离较大量的为了利用纸上色谱法原理分离较大量的物质，也可将滤纸填装入玻璃管中，如物质，也可将滤纸填装入玻璃管中，如柱色谱法那样，进行柱上分配色谱分离。柱色谱法那样，进行柱上分配色谱分离。l近年来，更有用化学处理的滤纸（如乙近年来，更有用化学处理的滤纸（如乙酰化滤纸）或离子交换树脂处理过的滤酰化滤纸）或离子交换树脂处理过的滤纸进行色谱分析，以提高分离效果，纸纸进行色谱分析，以提高分离效果，纸上电泳是纸上色谱法的另一发展方向。上电泳是纸上色谱法的另一发展方向。 习题习题1利利用用离离子子交交换换柱柱色色谱谱原原理理进进行行下下列列分分离离或除去杂质。或除去杂质。 A 糖中除酸（葡萄糖中除去柠檬酸）糖中除酸（葡萄糖中除去柠檬酸） B 除除去去羰羰基基化化合合物物异异丙丙醇醇中中除除去去少少量量丙酮。丙酮。2纸上色谱法的原理是什么？纸上色谱法的原理是什么？
