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1、上海吉凯基因化学技术有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.上海吉凯基因化学技术有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.sanger测序-基因检测的金标准曹尚志曹尚志sanger测序原理Sanger测序的基本流程测序结果的分析 双脱氧末端终止法引物设计实验流程上机测序怎样分析结果问题峰图分析ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3-OH已被氧化，下一个dNTP的5-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同长度的新的DNA片段。5353一、Sanger测序原理双脱氧末端终止法一、S
2、anger测序原理双脱氧末端终止法二、Sanger测序的实验基本流程（以MTHFR(RS1801133)检测为例）1.根据rs号得到位点信息及目标序列2.引物设计3.测序PCR模板的制备4. 测序样品的制备5.上机测序 1.根据rs号得到位点信息及目标序列+2.1 primer primer 5.02.引物设计2.2 引物特异性检查 2.引物设计避免荧光标记避免荧光标记测序引物长度测序引物长度16-25bp，TM值值50-65为宜为宜,55最佳测序引物位置避免测序引物位置避免Poly（A.T）和高）和高GC结构结构测序引物位置距离位点最多测序引物位置距离位点最多600bp，至少，至少50bp不
3、能使用兼并引物测序不能使用兼并引物测序引物纯度（引物纯度（PAGE纯化方式）纯化方式）2.3 设计引物还需注意3.测序PCR模板的制备根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作液10umol/ul(4保存)，母液100umol/ul（-20保存）1.PCR扩增三步法：变性-退火-延伸2.退火温度：(Ftm+Rtm)/2-53.延伸时间：1kb=1min根据设计好的参数，设置使用PCR仪器扩增.3.1 PCR扩增扩增稀释引物稀释引物 设计方案设计方案pcr仪扩增仪扩增 依依赖赖于于PCR反反应应的的优优化程化程PCR产产物的物的质质量量 选择选择最佳的最佳的纯纯化方法化方法纯化的意义纯化的意义纯化的意
4、义纯化的意义纯化（试剂盒）纯化（试剂盒）纯化（试剂盒）纯化（试剂盒）方式选择方式选择方式选择方式选择1.柱纯化：用于特异柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在产物纯化或存在100bp的非特异产物的纯化的非特异产物的纯化 (如：引物二聚体如：引物二聚体)2.切胶回收：切胶回收：可用于任何可用于任何质质量的量的PCR产产物物纯纯化化切下条切下条带带，去除非特异，去除非特异PCR产产物和引物二聚体物和引物二聚体v3.2 PCR产产物物纯纯化化去除去除PCR反应液的反应液的残留残留1.残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序2.残留的残留的dNTP:以保持以保持d
5、NTPs / ddNTPs的最佳的最佳比例比例3.盐成分：避免抑制测序酶活性盐成分：避免抑制测序酶活性4.非特异非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域产物：避免扩增出同源性区域测序测序PCR 酒精/EDTA/NaAc法：去除残留的BigDye Terminator(染料峰) 测序产物脱盐 纯化好的测序产物比较稳定测序产物测序产物纯化纯化4.测序样品制备测序PCR（以回收PCR产物为模板）：96 1 min -(96 10 sec - 50 5 sec - 60 4 min) x 25循环-4 保温测序测序PCR与普通与普通PCR的区的区别别5. 上机测序pcr扩增仪器中扩增仪器中95变性变性4
6、min4min。.5.1 测序样品变性测序样品变性5.2 上机操作上机操作三、 测序结果分析怎样怎样怎样怎样看测序结果看测序结果看测序结果看测序结果怎样得到位点基因型怎样得到位点基因型怎样得到位点基因型怎样得到位点基因型常见峰图介绍常见峰图介绍常见峰图介绍常见峰图介绍保证测序结果的准确性保证测序结果的准确性峰图判断三要素：电泳图(Electropherogram)、峰图(Raw)、QV值峰图 电泳图/QV值1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）Raw：峰图Electropherogram：电泳图QV值QV值越高，读图越准确。QV值为蓝色，表示可信。QV值为黄色，表示不准确
7、，需要人工判读。QV值为红色，表示不可信QV值根据得到位点信息，将位点3保守序列（10个碱基左右），在软件中Chromas查找，前面即为突变基因型。PS:如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）正常及无信号、信号弱测序峰图样品内部结构影响及测序峰图测序仪器影响及测序峰图纯化因素影响及测序峰图引物质量影响及测序峰图3.常见峰图介绍及分析正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、QV值基本上为蓝色)Electropherogram：Raw：无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）Raw：Electropherogram：信号
8、弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）Raw：Electropherogram：正常及无信号测序峰图样品内部结构影响及测序峰图测序仪器影响及测序峰图纯化因素影响及测序峰图引物质量影响及测序峰图3.常见峰图介绍及分析poly（A、T）结构导致后双峰返回Electropherogram：Raw：测序信号中断（二级结构导致）返回Electropherogram：Raw：序列结构高GC导致信号衰减返回Electropherogram：Raw：正常及无信号测序峰图样品内部结构影响及测序峰图测序仪器影响及测序峰图纯化因素影响及测序峰图引物质量影响及测序峰图3.常见峰图介绍及分析峰图出现断层（可先重跑
9、看是否解决，需要换Buffer）Electropherogram（电泳图、QV正常）Raw：毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）Electropherogram（展开图正常）Raw：毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）Electropherogram：Raw：正常及无信号测序峰图样品内部结构影响及测序峰图测序仪器影响及测序峰图纯化因素影响及测序峰图引物质量影响及测序峰图3.常见峰图介绍及分析染料峰（纯化操作不规范或者ddntp过量）返回Electropherogram：Raw：正常及无信号测序峰图样品内部结构影响及测序峰图测序仪器影响及测序峰图纯化因素影响及测序峰图引物质量影响及测序峰图3.常见峰图介绍及分析引物降解或者不纯Electropherogram：Raw：上海吉凯基因化学技术有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.Thanks！上海吉凯基因化学技术有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.38 以以上上有有不不当当之之处处，请请大大家家给给与与批批评评指指正正，谢谢谢谢大大家家！
