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1、现代色谱现代色谱- -质谱联用技术及其质谱联用技术及其在中药分析中的应用在中药分析中的应用2 22液质联用系统液质联用系统质量过滤器质量过滤器3API 电离源电离源LC/MS- Waters Alliance ZMD 系统系统 4Agilent 1100 Series LC/MSD5Varian 1200L LC/MS & LC/MS/MSProStar Binary 210Solvent DeliverySystemProStar 430AutoSamplerModule1200LLC/MS61200L LC/MS/MS AnalyzerSprayChamberDiverterCapilla
2、ry Plug& Hexapole Ion GuideQ1Q2Q2CurvedCurved185 mm185 mmPathPathQ3Multiplier+/- 5kV postaccelerationDual StageTurbo7？LC与与MS联用面临的问题？联用面临的问题？ 将常规将常规LC每分钟约每分钟约1ml或数或数ml流速的液体流动流速的液体流动相引入要求高真空操作的相引入要求高真空操作的MS仪，引起流速不协调仪，引起流速不协调; 经典离子化方法的高温高电压不适合经典离子化方法的高温高电压不适合LC分析分析的热不稳定性或难挥发性样品的离子化的热不稳定性或难挥发性样品的离子化; LC
3、分析常用的难挥发性缓冲盐系统易污染分析常用的难挥发性缓冲盐系统易污染MS仪仪8LC/MS联用的接口技术联用的接口技术*直接液体导入接口直接液体导入接口(Direct Liquid Introduction)*传送带技术传送带技术(Moving Belt Interface)流出物滴落在传送带上，红外线加热去溶剂流出物滴落在传送带上，红外线加热去溶剂缺点：离子化效率低；记忆效应缺点：离子化效率低；记忆效应*热喷雾热喷雾(Thermospray)流动相经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速流动相经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出形成雾滴，离子蒸发；流速喷出形成雾滴，离子蒸发；流速1ml
4、/min，水相多，水相多缺点：缺点：MW200-1000u；热分解；热分解9LC/MS：ESI 结构图结构图10Finnigan ESI11Agilent ESI12AB ESI13Waters ESI14Varian ESISprayChamberCapillary Plug& Hexapole Ion Guide SampleSprayAssembly15ElectrosprayIonization, desolvation, excess droplet removalN2GasHeaterN2 drying gasVacuum RestrictionDrying gas promote
5、s rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inletIonsDropletsDropletsDroplets16Electrospray Mechanism+DesolvationNeedleCharged DropletAnalyteIonization17LC-MS ionization18LC-MS ionization+Hot Drying Gas+solventsolventsolventsolvent19LC-MS ionization20LC-MS ionizationLiquidNebuli
6、zingGasOptimum depends on liquid flowInner to outer needle position is critical to nebulization efficiency液滴分布状态液滴分布状态Large uncharged dropletsSmall highly charged dropletsIntermediate size dropletsSpray needleTaylor coneSpreading due to charge repulsion23ElectrosprayIonization, desolvation, excess d
7、roplet removalN2GasHeaterN2 drying gasVacuum RestrictionDrying gas promotes rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inletIonsDropletsDropletsDroplets进入四级杆质量分析器进入四级杆质量分析器3.5 mTorr0.8 TorrDroplets IonsQ1Droplet desolvation occurs before entrance to the capillary. Ion/Solvent clu
8、sters are dissociated by collisions before the skimmer cone and in the ion guide.IonsSmall Ions Ion Guide分析物离子化分析物离子化JAnalyte forms an ion in the mobile phaseJPositive Ion ESIJCation attachment: H+ + M (M+H)+ also Na+, K+, NH4+JNegative Ion ESIJProton loss: M (M-H)- + H+JAnion attachment: A- + M (M+
9、A)- 示例：稳定母离子的确认示例：稳定母离子的确认定量离子对：定量离子对： 多烯紫杉醇多烯紫杉醇m/z 830549.0（TNa+，图，图A） 紫杉醇紫杉醇 m/z 876 591.0（TNa+，图，图B） 不同甲酸浓度下多西他赛母离子的稳定性不同甲酸浓度下多西他赛母离子的稳定性与灵敏度考察与灵敏度考察1.加钠离子（加钠离子（m/z 830）2. 加钾离子（加钾离子（m/z 846 ）3. 加氢离子（加氢离子（m/z 808 ） 0 formic acid 0.05 formic acid 0.1 formic acid 0.2 formic acid 不同甲酸浓度下多西他赛子离子的稳定性不
10、同甲酸浓度下多西他赛子离子的稳定性与灵敏度考察与灵敏度考察0 formic acid 0.05 formic acid 0.1 formic acid 0.2 formic acid 1. 加钠离子（加钠离子（m/z 549）2. 加钾离子（加钾离子（m/z 565）3. 加氢离子（加氢离子（m/z 527） 29LC/MS：APCI 结构图结构图30APCI : Nebulization &VaporizationAPCI is a gas phase reactionAnalyte must be available as a stable, gas phase moleculeMatri
11、x components may or may not undergo non-destructive evaporationEvaporation driven by a very hot auxiliary gasliquidgasQuartzTubeQuartzTubeVortex flowof hot gasgas31Ionization in the APCI Chamber Corona NeedleCI reactions occur between the corona needle and the spray plateNebulizer and auxiliary gas
12、plus gas phase molecules of mobile phase, analyte and matrix flood into the APCI chamber32APCI 基本原理基本原理从从液液相相色色谱谱流流出出的的样样品品溶溶液液进进入入一一具具有有雾雾化化气气套套管管的的毛毛细细管管，经经氮氮气气流流雾雾化化，通通过过加加热热管管时时被被气气化化。在在加加热热管管端端进进行行电电晕晕尖尖端端放放电电溶溶剂剂分分子子被被电电离离，充充当当反反应应气气，与与样样品品气气态态分分子子碰碰撞撞，经经过过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子：复杂的反应过程，样品分子生成准分子
13、离子： R + e R+ + 2eRH+ + M MH+ + R33 ESI APCI对象对象 中等至强极性分子中等至强极性分子 非极性非极性/中等极性中等极性不适宜不适宜 极端非极性样品极端非极性样品 热稳定性差热稳定性差/非挥发性非挥发性流动相流动相 pH对离子化效率影响较大对离子化效率影响较大 缓冲盐浓度低缓冲盐浓度低 缓冲盐浓度可高些缓冲盐浓度可高些 有机相比例不能太低有机相比例不能太低 水相比例可高些水相比例可高些流速流速 低流速较好低流速较好 高流速比高流速比ESI好好 34LC LC/MS：*多数色谱柱与多数色谱柱与LC/MS匹配，离子交换柱除外匹配，离子交换柱除外*使用有机溶剂
14、比例较高的系统使用有机溶剂比例较高的系统*避避免免使使用用难难挥挥发发性性缓缓冲冲盐盐，可可用用醋醋酸酸铵铵、甲甲酸酸铵、三氟乙酸；铵、三氟乙酸；*使使用用挥挥发发性性离离子子对对试试剂剂：氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵（TBAH），七氟丁酸（），七氟丁酸（HFBA）*流流量量匹匹配配：兼兼顾顾色色谱谱分分离离效效果果和和ESI离离子子化化效效率率；用用1-2mm内内径径色色谱谱柱柱，300-500ul/min；柱后分流柱后分流Scan Modes Full Scan全扫描全扫描MS ModeQ1Q2Q3Full scan (Q1)Full scan (Q3)= scanned;= select
15、ed m/z;blank = complete transmissionScan Modes SIM选择离子监测选择离子监测MS ModeQ1Q2Q3Selected ion monitoring (SIM) (Q1)Selected ion monitoring (SIM) (Q3)= scanned;= selected m/z;blank = complete transmissionSelected Ion MonitoringScan Modes SRM选择反应监测选择反应监测MS ModeQ1Q2Q3Selected reaction monitoring (SRM)Selecte
16、d reaction monitoring (SRM)= scanned;= selected m/z;= CIDCollision induced dissociation Selected Reaction MonitoringScan Modes MRM多反应监测多反应监测MS ModeQ1Q2Q3Multiple reaction monitoring (MRM)Multiple reaction monitoring (MRM)= scanned;= selected m/z;= CIDMultiple Reaction MonitoringScan Modes Precursor
17、Scan母离子扫描母离子扫描MS ModeQ1Q2Q3Precursor Scan MS/MS= scanned;= selected m/z;= CIDScan Modes Product Scan子离子扫描子离子扫描MS ModeQ1Q2Q3 ProductScan MS/MS= scanned;= selected m/z;= CIDScan Modes Neutral Loss Scan中性丢失扫描中性丢失扫描MS ModeQ1Q2Q3Precursor Scan MS/MS= scanned;= scanned with offset;= CID多种扫描模式设定多种扫描模式设定All
18、 modes are time programmable, with numerous time segments available for each methodFull ScanSIMSRMMRMPrecursor ScanNeutral LossScan:250-500521ESI(-)523ESI(+)XIC 521XIC 523pProduct ScanProduct Scan:523100523361Neutral Loss Scan: 400550238388野鸢尾苷野鸢尾苷49LC/MS在中药研究中的应用在中药研究中的应用中药化学成分的快速筛选及成分分析中药化学成分的快速筛选
19、及成分分析质谱检测器可以给出大量的结构信息，结合同类质谱检测器可以给出大量的结构信息，结合同类已知结构化合物的裂解规律，或结合其它检测方已知结构化合物的裂解规律，或结合其它检测方法，即可对未知成分进行直接分析，因此在以生法，即可对未知成分进行直接分析，因此在以生物活性为指导的化学筛选中，可以对目标化合物物活性为指导的化学筛选中，可以对目标化合物进行靶分析进行靶分析中药质量控制中药质量控制-中药指纹图谱研究中药指纹图谱研究LC-MS联用技术的应用弥补了紫外检测的不足，联用技术的应用弥补了紫外检测的不足，还提供了大量的化学成分信息，可实现对各主要还提供了大量的化学成分信息，可实现对各主要流出组分的
20、定性，从而为药材及其制剂的鉴别及流出组分的定性，从而为药材及其制剂的鉴别及质量评价提供更加全面、可靠的依据质量评价提供更加全面、可靠的依据Identification of multiple components in Guanxinning injection using hydrophilic interaction liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and reverse phase liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometryRapid Commu
21、nications in Mass SpectrometryXiaofei Chen, Ziyang Lou, Hai Zhang, Guangguo Tan, Zhirui Liu , Wuhong Li, Zhenyu Zhu and Yifeng Chai*示例：应用亲水作用色谱示例：应用亲水作用色谱- -反相色谱互补策略联用反相色谱互补策略联用飞行时间质谱检测器鉴别冠心宁注射液的主要成分飞行时间质谱检测器鉴别冠心宁注射液的主要成分51研究背景研究背景2009年年7月，月，SFDA针对近年来中药注射剂频发针对近年来中药注射剂频发质量安全事故这一问题，下发了质量安全事故这一问题，下发了关于
22、开展中药关于开展中药注射剂安全性再评价工作的通知注射剂安全性再评价工作的通知，要求在全国，要求在全国范围内开展范围内开展中药注射剂安全性再评价工作中药注射剂安全性再评价工作，并提，并提出了如下要求：出了如下要求：全面开展生产及质量控制环节的风险排查，切全面开展生产及质量控制环节的风险排查，切实控制中药注射剂安全隐患实控制中药注射剂安全隐患因此，将注射液中因此，将注射液中绝大多数甚至全部成分绝大多数甚至全部成分搞清搞清楚是，并进行针对性的质量控制，是保证中药注楚是，并进行针对性的质量控制，是保证中药注射液安全稳定的基础射液安全稳定的基础。52研究背景研究背景冠心宁注射液：收冠心宁注射液：收载载于
23、于卫卫生部部生部部颁标颁标准（准（1998）由丹参和川芎两味由丹参和川芎两味传统传统中中药组药组成；成；临临床上主要用于冠心病、心床上主要用于冠心病、心绞绞痛、痛、脑脑栓塞等心、栓塞等心、脑脑血管疾病的血管疾病的治治疗疗；具有具有扩张扩张冠状冠状动动脉，促脉，促进进冠脉冠脉侧侧支循支循环环，加速缺血心肌的修复，加速缺血心肌的修复等作用；等作用；p注射液中主要成分为注射液中主要成分为酚酸类、苯酞类等酚酸类、苯酞类等水溶性成分，水溶性成分，这是通常认为的这是通常认为的起作用成分起作用成分53糖、氨基酸、有机酸糖、氨基酸、有机酸等成分同样也起到一定的作等成分同样也起到一定的作用，用，辅料辅料的含量也
24、应得到控制，但由于这些物质的含量也应得到控制，但由于这些物质极性均较强，很难在常规的极性均较强，很难在常规的C18柱上表征。柱上表征。54色谱条件：色谱条件：RPLC分离使用分离使用Agilent Zorbax SB-C18柱柱(100 mm 3.0 mm I.D., 3.5 m)，柱温，柱温30，流动相使用流动相使用0.4%乙酸水溶乙酸水溶液液(A)和乙腈和乙腈(B)，梯度洗脱，梯度洗脱0-19 min，2-23 % B；19-27 min，23-30 % B；27-35 min，30-90 % B；35-45 min，90%B。流速流速0.5mL/min，为了获得更好的电喷雾效率，为了获得
25、更好的电喷雾效率，柱后分流保持柱后分流保持0.2mL/min进入质谱分析，进样量为进入质谱分析，进样量为5L。HILIC分离使用分离使用SHISEIDO PC HILIC柱柱(150mm 2.0 mm I.D., 5 m)，柱温，柱温40，流动相使用流动相使用5mmoL/L醋酸醋酸铵水溶液（铵水溶液（A）和乙腈（）和乙腈（B），梯度洗脱），梯度洗脱0-10，90% B；10-20min，90-70% B；20-25min，70% B。流速流速0.2mL/min，直接进入质谱分析，进样量为，直接进入质谱分析，进样量为2L。55质谱质谱条件：条件：检测检测器器为为Agilent 6200 TOF/
26、MS装配装配ESI离子源。离子源。TOF/MS分析使用全分析使用全扫扫描模式，描模式，质质核比范核比范围围100-1100，负负离子模式。离子模式。ESI离子源条件如下：干燥气离子源条件如下：干燥气流速，流速，8 L/min；干燥气温度，；干燥气温度，350；雾雾化器化器压压力，力，35 psig；毛；毛细细管管压压力，力，4000V；碎片；碎片电压电压，130-325V动态调节动态调节；skimmer voltage, 60 V; octopole RF, 250 V。56化合物鉴别策略化合物鉴别策略化合物鉴别策略化合物鉴别策略样品处理1、与对照品比对保留时间、碎片信息与已知碎片骨架信息比对
27、LC-TOF/MS分析,获得色谱峰精确分子量2、在化合物数据库中搜索匹配化合物数据库建立对照品处理3、根据碎片信息推导可能的结构比对质谱标准数据库，尝试鉴别非目标化合物，个别购买对照品确证误差5 ppm，利用MH-、2MH- M2H+Na-等分子离子峰信息匹配最有可能的化学结构式通过查询注射液药材相关的植物化学和药理学相关文献获得，数据库包括化合物的化学式、精确分子量、名称、中文名、来源植物，CAS号，紫外信息，质谱信息，参考文献和注释。与文献数据对比，明确鉴别目标化合物目标化合物非目标化合物56C18柱TOFMS总离子流图HILIC柱TOFMS总离子流图34个化合物， 4组同分异构体17个化
28、合物， 1组同分异构体57非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证EIC:m/z=130.0609碎片电压130V128.0351的同位素分布离子12&1、异亮氨酸2、亮氨酸58C6H13NO2C12H22O11非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证2M-HM+HCOOM-HM-H2M-H-162Glucose -H蔗糖59非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证非目标化合物的鉴别和确证2M-2H+NaM-HM-H-NH2L-苯丙氨酸C9H11NO2
29、60示例：示例：LC-DAD-MS/MS分离鉴定中药莲子心中三种分离鉴定中药莲子心中三种生物碱生物碱p莲子心中主要有效成分双苄基异喹啉类生物碱的药莲子心中主要有效成分双苄基异喹啉类生物碱的药用价值日趋重视。其中，莲心碱（用价值日趋重视。其中，莲心碱（）、异莲心碱）、异莲心碱（）、甲基莲心碱（）、甲基莲心碱（）为莲子心中）为莲子心中双苄基异喹啉双苄基异喹啉类生物碱的主要成分类生物碱的主要成分J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761pDried and powdered embryo of the seed of N. nucifera
30、 GAERTN. (10 kg) was soaked in 1% HCl for 1 week. The filtrate was then precipitated with 10% aqua ammonia until the pH of the solution reached 8.5 and 593 g of crude extract were collected as brown precipitates.p The crude extract was extracted three times with chloroform, and then the organic phas
31、e was extracted two times with 3% NaOH. Finally, the extract solution was precipitated with diluted HCl and off-white precipitates were filtered and dried to obtain phenolic alkaloid sample (38.5 g). pThe primary stock solutions of crude extract (1 mg/ml) and phenolic alkaloid sample(1 mg/ml) were p
32、repared by dissolving appropriate amount of substance in methanol. Working solutions were obtained by diluting the stock solutions with distilled water and 10l acetic acid per ml solution was added. All the solutions were stored at 4 C.282nmHPLC图图J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761LC
33、-DAD-MS/MS分离鉴定中药莲子心中三种生物碱分离鉴定中药莲子心中三种生物碱1.莲心碱莲心碱2.异莲心碱异莲心碱3.甲基莲心碱甲基莲心碱制备液相制得化学对照品制备液相制得化学对照品采用采用ESI-MS/MS进行流动注射分析优化进行流动注射分析优化MRM条件条件母离子母离子m/zm/z 611 611碰撞能级图碰撞能级图 母离子母离子m/zm/z 625 625碰撞能级图碰撞能级图 m/z 192m/z 206 m/z 206 CID -24 eV J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761LC/MS/MS定量分析定量分析MRM参数
34、设定及色谱图参数设定及色谱图AlkaloidRT (min)CE (eV)Precursor ion (m/z)Product ions (m/z)Liensinine1.525-24611206Isoliensinine1.721-24611192Neferine1.975-24625206Tetrahydropalmatine2.143-20356192J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.76176中药代谢及药代动力学研究中药代谢及药代动力学研究利利用用LCMS技技术术，不不仅仅可可以以避避免免复复杂杂、繁繁琐琐、耗耗时时的的分分
35、离离纯纯化化代代谢谢物物样样品品的的工工作作，而而且且能能分分离离鉴鉴定定以以往往难难于于辨辨识识的的痕痕量量药药物物代代谢谢物物，从从而而迅迅速速、方方便便地地解决问题。解决问题。由由于于MS具具有有很很强强的的选选择择性性，可可以以利利用用LCMSMS及及多多反反应应监监测测等等技技术术，排排除除样样品品中中其其它它成成分分的的干干扰扰，提提高高分分析析的的专专一一性性及及改改善善信信噪噪比比，从从而而实实现现对对原原型型药物及其代谢产物的定性定量分析。药物及其代谢产物的定性定量分析。77中药代谢及药代动力学研究中药代谢及药代动力学研究中药药代动力学研究中药药代动力学研究研究给药后中药活性
36、成分的研究给药后中药活性成分的体内暴露情况和变化特征体内暴露情况和变化特征中药（中药成分）给药中药（中药成分）给药吸收吸收，进入体内，进入体内分布分布，发挥药效作用，发挥药效作用，代谢代谢排泄排泄中药有效性和安全性中药有效性和安全性中药品种技术改造及新药研究中药品种技术改造及新药研究中药临床的合理用药中药临床的合理用药多组分药代动力学多组分药代动力学复方药代动力学复方药代动力学成分多、结构相近、成分多、结构相近、浓度低、体内药物相互作用浓度低、体内药物相互作用78中药代谢研究中药代谢研究体内代谢研究体内代谢研究血浆、尿液、胆汁中的代谢产物血浆、尿液、胆汁中的代谢产物I相代谢产物、相代谢产物、II相代谢产物相代谢产物体外代谢研究体外代谢研究肝匀浆代谢肝匀浆代谢I相和相和II相代谢酶相代谢酶肝细胞代谢肝细胞代谢I相和相和II相代谢酶相代谢酶肝微粒体代谢肝微粒体代谢主要是主要是I相代谢酶相代谢酶代谢酶动力学研究代谢酶动力学研究确认代谢酶种类确认代谢酶种类计算酶动力学参数计算酶动力学参数观察药物对药观察药物对药酶的抑制或诱导效应酶的抑制或诱导效应代谢途径确认、代谢产物制备代谢途径确认、代谢产物制备
