氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定——纸层析法纸层析法 一、实验目的一、实验目的l掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分测样品的氨基酸成分 二、实验原理二、实验原理l纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析滤纸纤维纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相当有机相流经固定相时，物质在两相溶剂为流动相当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离间不断分配而得到分离 l溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上的移动速度用RfRf值表示：值表示： lRfRf= =原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/ /原点到溶剂前沿的距原点到溶剂前沿的距离离 l在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的RfRf值是常数值是常数RfRf值的大小值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关本实验利用纸层析法分离氨基层析温度等因素有关本实验利用纸层析法分离氨基酸。
酸 三、实验器材三、实验器材l（（1 1）大烧杯（）大烧杯（5000mL5000mL）：）：1 1只只/ /组组 l（（2 2）微量注射器（）微量注射器（100100 L L）：）：1 1只只/ / 组 l（（3 3）喷雾器：公用喷雾器：公用 l（（4 4）培养皿：）培养皿：1 1只只/ /组 l（（5 5）层析滤纸（长）层析滤纸（长22cm22cm、宽、宽14cm14cm的的新华一号滤纸）：新华一号滤纸）：1 1张张/ /组 l（（6 6）直尺、铅笔：自备直尺、铅笔：自备 l（（7 7）电吹风：）电吹风：1 1只只/ /组 l（（8 8）托盘、针、白线：）托盘、针、白线：1 1套套/ /组 l（（9 9）手套：）手套：1 1双双/ /组 l（（1010）塑料薄膜：公用塑料薄膜：公用 l（（1111）小烧杯：）小烧杯：50mL50mL，，1 1只只/ /组 四、实验试剂四、实验试剂l（（1 1）扩展剂：将）扩展剂：将4 4体积正丁醇和体积正丁醇和1 1体积冰醋酸体积冰醋酸放入分液漏斗中，与放入分液漏斗中，与5 5体积水混合，充分振荡，体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。
静置后分层，弃去下层水层 l（（2 2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%0.5%的已知氨基酸溶液的已知氨基酸溶液3 3种种（赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸），（赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸），0.5%0.5%的待测的待测氨基酸液氨基酸液1 1种 l（（3 3）显色剂：）显色剂：0.1%0.1%水合茚三酮正丁醇溶液水合茚三酮正丁醇溶液 实验试剂实验试剂 五、实验操作五、实验操作l检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内干燥箱内120℃120℃烘干 l（（1 1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL20mL展层展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡薄膜密封起来，平衡20min20min （（2）规划：带上手套，取宽约）规划：带上手套，取宽约14cm、高约、高约22cm的层析滤的层析滤纸一张。
在纸的下端距边缘纸一张在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线行于底边的直线A，在直线上，在直线上做做4个记号，记号之间间隔个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置这就是原点的位置另在距左边缘另在距左边缘1cm处画一条处画一条平行于左边缘的直线平行于左边缘的直线B，在，在B线上以线上以A、、B两线的交点为原两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）点标明刻度（以厘米为单位），参见左图参见左图 （（3 3）点样：用微量注射器分别取）点样：用微量注射器分别取10mL10mL左右的氨基酸样品左右的氨基酸样品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以免（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以免交叉污染），点在这四个位置上挤一滴点一次，同一交叉污染），点在这四个位置上挤一滴点一次，同一位置上需点位置上需点2 2～～3 3次，次，2 2～～3mL/3mL/次，每点完一点，立刻用次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过最大不超过3mm3mm每人须点每人须点4 4个样，其中个样，其中3 3个是已知样，个是已知样，1 1个是待测样品。
个是待测样品 （（4 4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧 边缘不能接触且要保持平行，参见图边缘不能接触且要保持平行，参见图3-33-3向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm1cm左右，左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在在下，扩展剂的液面在A A线下约线下约1cm1cm），罩上大烧），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封当扩展剂上升到杯，仍用塑料薄膜密封当扩展剂上升到A A线时线时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度，填入表高度，填入表3-13-1中当上升到中当上升到1515～～18cm18cm，取出，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干迅速用电吹风热风吹干 l（（5 5）显色：用喷雾器在通）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%0.1%茚三酮正丁醇溶液，茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见可显出各层析斑点，参见左图。
左图 l（（6 6）计算各种氨基酸的）计算各种氨基酸的RfRf值，并判断混合样品中都有值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表见表3-23-2 l（（7 7）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到画图，求出扩展剂上升到18cm18cm时所需要的时间时所需要的时间 l（（8 8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师实验报告当场交给老师l计算计算 RfRf= =原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/ /原点到溶剂前沿的距原点到溶剂前沿的距离离 记录与计算汇总记录与计算汇总 l扩展剂前沿上升速度扩展剂前沿上升速度 X（（min）） 0510152030406090…18Y（（cm）） 纸层析结果纸层析结果赖氨酸赖氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 缬氨酸缬氨酸 待测氨基酸待测氨基酸 原点到层析斑点原点到层析斑点中心的距离中心的距离 原点到溶剂前沿原点到溶剂前沿的距离的距离 RfRf 判断待测氨基酸判断待测氨基酸 。