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1、实验实验11植物的组织培养植物的组织培养实验目的实验目的 1 1、进行菊花的组织培养、进行菊花的组织培养 2 2、尝试植物激素的应用、尝试植物激素的应用MSMS培养基配制方法培养基配制方法你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物培养基的配方相比，培养基的配方相比，MSMS培养基的配方有哪些明培养基的配方有哪些明显的不同？显的不同？ 微量元素和大量元素提供植物细胞生活所微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐必需的无机盐；蔗糖提供蔗糖提供碳源碳源，同时能够，同时能够维持细胞的渗透压维持细胞的渗透压；甘氨酸、维；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物
2、细胞在正常代谢途径生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的受到一定影响后所产生的特殊营养需求特殊营养需求。 微生物培养基以微生物培养基以有机营养为主有机营养为主。与微生物的培养不同，。与微生物的培养不同，MSMS培养基则需提供培养基则需提供大量无机营养大量无机营养，无机盐混合物包括植物，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。生长必须的大量元素和微量元素两大类。 (1) (1) 取取1000ml1000ml烧烧杯杯一一只只，加加大大量量元元素素1010倍倍母母液液100ml100ml，微微量量元元素素100100倍倍母母液液10ml10ml，铁铁
3、盐盐100100倍倍母母液液10ml,10ml,有有机机物物质质100100倍倍母母液液10ml10ml。此此外外, ,根根据据培培养养材材料料和和实实验验目目的的还还要要附附加加一一定定量量的的生生长长素素, ,细细胞胞分分裂裂素素及及蔗蔗糖糖 等等 , ,然然 后后 加加 水水 至至 1000ml,1000ml,待待 蔗蔗 糖糖 充充 分分 溶溶 解解 后后 用用1mol/L 1mol/L 的的NaOHNaOH或或HClHCl调调酸酸碱碱度度为为pH5.8,pH5.8,最最后后加加入入琼脂粉琼脂粉6.5g,6.5g,如用琼脂条如用琼脂条, ,则要加则要加8g8g。2.2.培养基配制与分装：
4、培养基配制与分装： (2)(2)将将盛盛有有培培养养基基的的烧烧杯杯在在电电磁磁炉炉上上，煮煮至至琼琼脂脂完完全全融化，补加蒸馏水至融化，补加蒸馏水至1000ml1000ml。 将将配配制制好好的的培培养养基基分分装装到到培培养养用用三三角角瓶瓶中中，每每只只100ml100ml三角瓶约装三角瓶约装40ml40ml培养基。培养基。 分分装装时时要要避避免免把把培培养养基基倒倒在在瓶瓶口口上上，否否则则培培养养时时容容易易引起杂菌污染。引起杂菌污染。 （1 1）把把装装好好的的培培养养基基的的三三角角瓶瓶放放入入高高压灭菌锅中，盖好锅盖。压灭菌锅中，盖好锅盖。 （2 2）设设置置灭灭菌菌温温度度
5、参参数数为为121121，20min20min，开始灭菌。，开始灭菌。 3 3、灭菌、灭菌无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键 （二）外植体（离体组织）消毒（二）外植体（离体组织）消毒注意：注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。 1 1、7070酒精中浸泡酒精中浸泡10min10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗2
6、 2、5%5%次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗3 3、用另一、用另一5%5%次氯酸钠溶液浸泡次氯酸钠溶液浸泡5min5min，无菌水冲洗，无菌水冲洗4 4、超净台中用无菌水多次冲洗、超净台中用无菌水多次冲洗（三）切段后接种（三）切段后接种 1 1、先先用用肥肥皂皂洗洗手手，穿穿上上工工作作服服，戴戴上上口口罩罩和和工工作帽。作帽。 2 2、放放入入培培养养瓶瓶和和灭灭菌菌后后的的接接种种用用具具( (镊镊子子、解解剖剖刀刀、接接种种针针) )，把把镊镊子子、解解剖剖刀刀、接接种种针针插插入入内内盛盛70%70%酒酒精精的的广广口口瓶瓶中。中。 3 3、在在酒酒精精灯
7、灯火火焰焰旁旁，打打开开三三角角瓶瓶，把把花花茎茎用用无无菌菌解解剖剖刀刀切切成成几几段段，每每段段至至少少有有一张叶片一张叶片 4 4、切切段段插插入入培培养养基基，诱诱导愈伤组织，盖上封口膜。导愈伤组织，盖上封口膜。 5 5、愈愈伤伤组组织织插插入入生生芽芽培培养基，盖上封口膜。养基，盖上封口膜。 6 6、用用记记号号笔笔在在瓶瓶壁壁上上写写明明培培养养材材料料、培培养养基基代代号号、 接种日期接种日期。注意事项注意事项 全全部部接接种种操操作作都都是是在在无无菌菌条条件件下下进进行行的的，所所以以要特别认真仔细，以防杂菌污染。要特别认真仔细，以防杂菌污染。（四）培养（四）培养接种后的锥形
8、瓶最好放在无菌箱中培养。培接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒，温度控制在养期间应定期消毒，温度控制在55，并且每日照光并且每日照光4.54.5小时小时 。观察记录生长情况，。观察记录生长情况，并照相存档。并照相存档。 2 2-3 3周后将生长健壮的周后将生长健壮的丛状苗丛状苗在无菌条件下在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养培养（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培 生根后，将苗移生根后，将苗移至消毒的草炭土或蛭至消毒的草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑石中，用玻璃罩或塑料布保持料布保持80%80%以上湿以上湿度，度，2
9、 2- -3 3天后打开玻天后打开玻璃罩低湿度锻炼璃罩低湿度锻炼转移至土中培养转移至土中培养（定植）（定植）三、结果分析与评价三、结果分析与评价 （一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析接种接种3 34 d4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。分析接种操作是否符合无菌要求。 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记观察实验结果，看看是
10、否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。组织进一步分化成根和芽的比例和时间。（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。养基，然后做不同配方的比较。（四）生根苗的
11、移栽是否合格（四）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技术的生根苗移栽技术的关键关键是既要充分清洗根系表面是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为质量分数为5%5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12 h12 h。掀开塑料薄膜后掀开塑料薄膜后24 h24 h才能移栽。新移栽的组培苗要才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。学生可以在课
12、后统计自己移栽的成活率，看看移栽学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。是否合格。四、本课题知识小结四、本课题知识小结 菊菊花花的的组组织织培培养养原理：细胞的全能性原理：细胞的全能性条件条件基础基础概念概念植物组织培养植物组织培养的基本过程：的基本过程：环境因素环境因素（温度、（温度、PH、光照）、光照）外植体的选择外植体的选择营养因素营养因素植株植株根、芽根、芽愈伤愈伤组织组织外植体外植体影响植物组织影响植物组织培养的因素培养的因素植物激素配比植物激素配比实验过程：实验过程：移栽移栽栽培栽培培养培养接种接种外植体外植体消毒消毒制备制备MS培培养基养基五、练习五、练习 植物组织
13、培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长一些细菌、真菌等的生长。而培养。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。进行严格的无菌操作。外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好
14、，容易诱导脱分化和再分化。和再分化。在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？嫩枝？3 3、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度同的生长素和细胞分裂素浓度4 4、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么？什么？5 5、如果在自然界
15、取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措施保证样本不被污染？施保证样本不被污染？任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度和细胞分裂素浓度，必须要套索使用如何合成激素和何种激，必须要套索使用如何合成激素和何种激素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也可以自己探索可以自己探索植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶，这样，天，这样，天然激素在植物体内作用和然激
16、素在植物体内作用和存在的时间就较短存在的时间就较短，而，而人工合成人工合成的激素在植物中没有相应使之分解的酶的激素在植物中没有相应使之分解的酶，所以作用和存在，所以作用和存在时间长，作用效果也更明显。时间长，作用效果也更明显。（1 1）操作环境洁净（）操作环境洁净（2 2）植物样本洁净（）植物样本洁净（3 3）操作过程无菌）操作过程无菌因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外，和
17、操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率操作敏捷迅速，也可以降低污染率6 6右图为植物体细胞杂交过程示意图。右图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：据图回答：（1 1）步骤）步骤是是 ，最，最常用的方法是常用的方法是 。（2 2）步骤）步骤一般常用的化学试剂是一般常用的化学试剂是 ，目的是，目的是 。 (3)(3)在利用杂种细胞培育成为杂种植在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的技术手段是株的过程中，运用的技术手段是 ，其中步骤，其中步骤相当于相当于 ，步骤，步骤相当于相当于 。 （4 4）植物体细胞杂交的目的是获得新）植物体细胞杂交的目的是获
18、得新的杂种植株。使的杂种植株。使 能能够在新的植物体上有所表现，其根本原够在新的植物体上有所表现，其根本原因是因是。去掉细胞壁，分离原生质体去掉细胞壁，分离原生质体酶解法酶解法聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）诱导植物原生质体融合诱导植物原生质体融合植物组织培养植物组织培养脱分化脱分化再分化再分化远缘杂交亲本的遗传特征远缘杂交亲本的遗传特征杂种植株获得双亲的遗传物质杂种植株获得双亲的遗传物质 （5 5）若远源杂交亲本）若远源杂交亲本A A和和B B都是二倍体，则都是二倍体，则杂种植株为杂种植株为倍体。倍体。（6 6）从理论上讲，杂种植株的育性）从理论上讲，杂种植株的育性。若运用传统有性杂交方法
19、能否实现？若运用传统有性杂交方法能否实现？。并说明现由并说明现由 。因此，这项研究对于培养作物新品种方面的重因此，这项研究对于培养作物新品种方面的重大意义在于大意义在于。 （7 7）利用植物体细胞杂交的方法培育作物新）利用植物体细胞杂交的方法培育作物新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔的遗传规律？为什么？的遗传规律？为什么？。 四四可育可育不能不能因为不同种生物之间存在生殖隔离因为不同种生物之间存在生殖隔离克服远缘杂交不亲和的障碍，大大克服远缘杂交不亲和的障碍，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围扩展了可用于杂交的亲本组合范围不遵循。因为在生物进行有性生殖的过程中，才遵循不遵循。因为在生物进行有性生殖的过程中，才遵循孟德尔的遗传规律，而植物体细胞杂交育种的过程不属于有性生殖孟德尔的遗传规律，而植物体细胞杂交育种的过程不属于有性生殖
