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1、蛋白质理化性质 1. 蛋白质蛋白质第一节第一节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质第二节第二节 蛋白质的测定蛋白质的测定ProteinsProteins are not just polypeptides-They are polypeptides of defined sequence.Each protein has a defined order of amino acid residues.As with nucleic acids, this sequence is referred to as the PRIMARY STRUCTURE of the protein.Primary
2、StructureProteinsarelongpolypeptides.Proteinsequencescanvaryamongspeciesandstillperformthesamefunction.Proteinsevolve,andtheyevolvebychangesintheiraminoacidsequences.Conservativechanges,e.g.DforENonconservativechanges,e.g.DforAThe Genetic Code Everyone should at least be familiar with how to read th
3、e following table and convert a gene sequence to a protein sequence.threenucleotidescodeforoneaminoacidinaprotein(43=64),sothereisroomforredundancyinthegenetic codemRNAcodonwritten5to3 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质（一）蛋白质的相对分子量（一）蛋白质的相对分子量蛋白质是生命大分子物质，其分子量很大，从蛋白质是生命大分子物质，其分子量很大，从一一万到几百万万到几百万或更大。利用测小分子法不可能。或更大。利用测小
4、分子法不可能。一、一、 由化学组成测定由化学组成测定最低最低分子量分子量 如血红蛋白：如血红蛋白：55.84（Fe)（100/0.34）(含量）含量）4（个数）（个数）67000二、物化法测定蛋白质分子量：二、物化法测定蛋白质分子量：测扩散系数、渗透压、光散射、测扩散系数、渗透压、光散射、沉降超离心、凝沉降超离心、凝胶过滤、胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s=v2x v=沉降速度（dx/dt）=离
5、心机转子角速度（弧度/s） x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）原理：原理： 颗粒：颗粒：沉降扩散沉降扩散，大颗粒沉降快，小颗，大颗粒沉降快，小颗 粒慢，粒慢， 分离，检测。分离，检测。蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系M=RTsD（1V）R气体常数（8.314107ergsmol-1度-1）T绝对温度D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（20，gml-1） s沉降系数 由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的的氨基氨基和游离的和
6、游离的羧基羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具，因此蛋白质与氨基酸一样具有有两性解离两性解离的性质，因而也具有特定的的性质，因而也具有特定的等电点等电点。？等电？等电 点点两性解离比氨基酸复杂：可解离的侧链两性解离比氨基酸复杂：可解离的侧链R基；基； 对结合蛋白质，辅基部分含可解离基团。对结合蛋白质，辅基部分含可解离基团。（二）蛋白质的两性电离及等电点（二）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点溶液中带负电荷，在等电点pHpH时为两性离子。时为两性离子。l胶体定义胶体定义：质点分散系统：质点分散系统 l蛋蛋
7、白白质质分分子子的的颗颗粒粒直直径径已已达达1 1100nm100nm，处处于于胶胶体体颗颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 l稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素： 蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的水水化化膜膜（分分子子表表面面极极性性R R基基而而结合的一层水分子）结合的一层水分子）表面电荷（同样表面电荷（同样pHpH下，电荷相排斥）下，电荷相排斥）蛋白质不会聚集沉淀蛋白质不会聚集沉淀（三）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：
8、1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。+（四）蛋白质的沉淀反应（四）蛋白质的沉淀反应1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂3.加重金属盐l稳定是暂时有条件的稳定是暂时有条件的 。l在在某某些些物物理理或或化化学学因因素素的的作作用用下下，蛋蛋白白质质严严格格的的空空间间结结构构被被破破坏坏（不不包包括括肽肽键键的的断断裂裂），从从而而引引起起蛋蛋白白质质若若干干理理化化性性质质和和生生物物学学性性质质的的改改变变，称称为为
9、蛋白质的变性蛋白质的变性。（五）蛋白质的变性（五）蛋白质的变性和凝固和凝固和凝固和凝固天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的失，称为蛋白质的变性变性。 变性蛋白质变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易分子形状改变，肽链松散
10、，反应基团增加，易被酶消化。被酶消化。 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀沉淀。 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。 加加热热使使蛋蛋白白质质变变性性并并凝凝聚聚成成块块状状称称为为凝凝固固。( (变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固凝固。)因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。 沉淀和凝固沉淀和凝固l引起蛋白质变性的因素有：引起蛋白质变性的因素有： 物物理理因因素素：高高温温
11、、高高压压、紫紫外外线线、电电离离辐辐射、超声波等；射、超声波等； 化化学学因因素素：强强酸酸、强强碱碱、有有机机溶溶剂剂、重重金金属盐等。属盐等。 物物理理性性质质：溶溶解解度度下下降降，沉沉降降率率升升高高，粘粘度升高，光吸收度增加等；度升高，光吸收度增加等； 化化学学性性质质：官官能能团团反反应应性性增增加加，易易被被蛋蛋白白酶水解。酶水解。 生生物物学学性性质质：原原有有生生物物学学活活性性丧丧失失，抗抗原原性改变。性改变。 l 蛋白质变性的可逆性：蛋白质变性的可逆性：蛋蛋白白质质在在体体外外变变性性后后，绝绝大大多多数数情情况况下下是是不能复性的；不能复性的； 如如变变性性程程度度浅
12、浅，蛋蛋白白质质分分子子的的构构象象未未被被严严重重破破坏坏；或或者者蛋蛋白白质质具具有有特特殊殊的的分分子子结结构构，并并经特殊处理则可以复性。经特殊处理则可以复性。核糖核酸酶的核糖核酸酶的变性与复性变性与复性（六）紫外吸收性质（六）紫外吸收性质l可可采采用用紫紫外外分分分分光光度度法法测测定定蛋蛋白白质质的的含含量。量。l原理原理l组组成成天天然然蛋蛋白白质质分分子子的的2020种种氨氨基基酸酸，色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸对对紫紫外外光光有有光光吸吸收收。其吸收峰在其吸收峰在280nm280nm左右。左右。l各种蛋白质中这几种氨基酸含量差别小。各种蛋白质中这几种氨基酸含
13、量差别小。 ？含量特别，核酸干扰：？含量特别，核酸干扰：280/260nm吸收差法吸收差法（八）成盐反应（八）成盐反应RCHCOOH+HClNH2RCHCOOHNH2HCl（九）酰基化和烃基化反应（九）酰基化和烃基化反应RCHCOOH+RXNH2R=酰基或烃基RCHCOOH+HXNHRX=卤素（Cl、F）反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及 HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应
14、(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸（七）蛋白质的颜色反应（七）蛋白质的颜色反应OHN（十）成酯反应（十）成酯反应RCHCOOH+C2H5OHNH2RCHCOOC2H5NH2HCl气当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。（十一）酰氯化反应十一）酰氯化反应YNHCRHCOOH+PCl5酰化氨基酸YNHCRHCOCl酰化氨基酰
15、氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽合成肽的工作上常用。（十二）成酰胺反应（十二）成酰胺反应H2NCHRCOOC2H5+HNH2体外无水H2NCHRCONH2+C2H5OH氨基酸酰胺有机体内：Asp（Glu）+NH4+Asn（Gln）Asn（Gln）合成酶ATP（十三）脱羧反应（十三）脱羧反应H2NCHRCOOH脱羧酶CO2+RCH2NH2胺（十四）迭氮反应（十四）迭氮反应H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOH酰化氨基酸YHN-CHR-COOCH3酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OH）YHNCHRCONHNH2酰化氨基酸的肼衍生物HNO2YHNCHRCON3+
16、2H2O酰化氨基酸迭氮 蛋白质的分析测定蛋白质的分析测定目的目的 蛋白质含量蛋白质含量 蛋白质纯度蛋白质纯度 分子分子量量 方法方法 凯氏定氮法凯氏定氮法 电泳电泳 电泳电泳 双缩脲法双缩脲法 质谱质谱 凝胶色谱凝胶色谱 Folin-phenol 法法 色谱色谱 质谱质谱 UV 吸收法吸收法 Coomassie blue法法 原理原理：消化氮：消化氮-无机无机氮氮测氮测氮计算蛋计算蛋白含量白含量操作操作：蛋白质：蛋白质 + H2SO4 （消化）（消化）- NH4 + 加上加上 OH - , 蒸馏蒸馏出出 NH3 收集到非挥发收集到非挥发性的标准酸中性的标准酸中 , 然后返然后返滴定滴定 凯氏定
17、氮法凯氏定氮法(1883)优点优点: l对所有蛋白质的测量对所有蛋白质的测量都是一致的都是一致的 (几乎全部几乎全部)l消化样品不要可溶消化样品不要可溶缺点缺点: l装置需要大量的样品装置需要大量的样品. l耗时耗时, 繁琐繁琐.l不是检测蛋白质不是检测蛋白质 而是而是检测检测 N (核酸和硫酸铵盐是严重的核酸和硫酸铵盐是严重的污染物污染物). 由于缺乏专一性需要由于缺乏专一性需要校正。校正。 (假定蛋白质含假定蛋白质含 16% 的氮的氮, 没没有其它有其它 NH4 + 的主要来源物存的主要来源物存在在)双缩脲法（双缩脲法（1935）原理原理: 两个或者以上的肽键两个或者以上的肽键 (双缩脲是
18、一种两个尿素分子双缩脲是一种两个尿素分子共用一个氮原子形成的化合物共用一个氮原子形成的化合物 与二价铜离子形成与二价铜离子形成紫红色络合物紫红色络合物) 操作操作：肽肽 + Cu 2+ (碱性条件下碱性条件下) 肽肽* *Cu + - 红色红色. 在在 A540 /560nm测量测量 。绘制标准曲线，计算。绘制标准曲线，计算。颜色反应原理实例颜色反应原理实例双缩脲反应是两分子尿素经加热放出一分子双缩脲反应是两分子尿素经加热放出一分子NH3而得到的产物。而得到的产物。凡含有两个或以上肽键结构的化合物都具有此反应。凡含有两个或以上肽键结构的化合物都具有此反应。优点优点: l简便，快速简便，快速 l
19、专一专一l不受蛋白质不受蛋白质 特异性特异性影响影响 缺点缺点: l灵敏度较低灵敏度较低 l必须绘制标准曲必须绘制标准曲线线 l所需样品量大所需样品量大 (0.21.7mg/ml)Folin-phenol 法法 (Lowry,1951) 原理原理: l肽肽* *Cu + -在碱性条件下在碱性条件下 被被磷钨酸磷钨酸/磷钼酸磷钼酸催化催化氧化氧化- 变成蓝色（变成蓝色（钨蓝和钼蓝钨蓝和钼蓝），蓝色的深浅与），蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。蛋白质的含量成正比。操作：操作：l配试剂，加蛋白质反应；配试剂，加蛋白质反应；l 测测(A650, A660 nm, 灵敏度随灵敏度随 改变改变) l检测浓度
20、检测浓度10-40 g 1 mL （25-250 g 1 mL ）优点优点: l- 很灵敏很灵敏 （比双缩脲法高（比双缩脲法高100倍）倍）l- 耗费时间适度耗费时间适度缺点缺点: l- 需要两步恒温需要两步恒温 l- 被一些普通的添加剂干扰被一些普通的添加剂干扰 (Tris, 硫醇类硫醇类) l- 要做标准曲线要做标准曲线 UV 吸收法吸收法A280 or OD 280原理：原理：l蛋蛋白白质质分分子子的的2020种种氨氨基基酸酸，色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸对对紫紫外外光光有有光光吸吸收收。其其吸吸收收峰峰在在280nm280nm左右。左右。l各种蛋白质中这几种氨基酸含量差别小。各种蛋白质中这几种氨基酸含量差别小。 UV 吸收法吸收法l核酸干扰核酸干扰, 核酸的最大吸收波长核酸的最大吸收波长 max 260nm测量测量 A280和和A260蛋白质浓度蛋白质浓度 (mg/ml)=1.45A280-0.74A260 优点优点: l简便，快速简便，快速 l低浓度盐无干扰低浓度盐无干扰l样品可回收样品可回收缺点缺点: l灵敏度较低灵敏度较低 lA280有一定误差有一定误差
