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1、1n5端加帽端加帽(cap)和和3端多聚腺苷酸化端多聚腺苷酸化(polyA)的调控意义的调控意义nmRNA的选择剪接的选择剪接(alternative splicing)对对基因表达的调控基因表达的调控nmRNA 运输的控制运输的控制转录后水平的调控转录后水平的调控P2562（一）（一）“戴帽安尾（穿靴）戴帽安尾（穿靴）”（核内）（核内）5加帽和加帽和多聚腺苷酸化及其调控意义多聚腺苷酸化及其调控意义 1.mRNA caping5加上加上 GpppmNP帽子，帽子，tailing 加上加上AA（50200bp）尾巴。）尾巴。 意义（意义（1）保护作用）保护作用保护保护mRNA免受核酸酶降解，免受
2、核酸酶降解， （2）标识作用）标识作用为翻译提供识别位点（为翻译提供识别位点（CBP）。）。 2.rRNA 不易被降解的机理可能是因为其组成核糖不易被降解的机理可能是因为其组成核糖体是在核内组装的。体是在核内组装的。 3.tRNA 合成后形成特殊的空间结构（三叶草，倒合成后形成特殊的空间结构（三叶草，倒L），可能抵抗降解，半寿期长。），可能抵抗降解，半寿期长。34hnRNA内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性 5GTAG 35（二）（二）mRNA的选择剪接对基因表达的调控作用的选择剪接对基因表达的调控作用 1. mRNA的选择剪接有多种方式的选择剪接
3、有多种方式选择剪接方式选择剪接方式要要 点点（1）外显子选择）外显子选择Option exon或称外显子跳跃（或称外显子跳跃（exon skipping）全全部保留或至少删除部保留或至少删除1个或几个外显子。个或几个外显子。（2）内含子选择）内含子选择Option intron 内含子全部删除保留内含子全部删除保留1个（近来也有个（近来也有内含子表达的报道）。内含子表达的报道）。（3）互斥外显子）互斥外显子Mutually exclusiveexon 2个外显互斥个外显互斥在同在同1个成个成熟熟mRNA只出现只出现1个。个。（4）内部剪接位点）内部剪接位点Internal splice sit
4、e 通过剪接供点或受点选择决定通过剪接供点或受点选择决定选择或剪切。选择或剪切。m7Gpppm7GpppintronexonexonAAAAAAP259672. 可变剪接的调控机制可变剪接的调控机制 SR蛋白家族的调控蛋白家族的调控n剪接体的形成与多种蛋白质和剪接体的形成与多种蛋白质和RNA复合体复合体密切相密切相关。在可变剪接上保守的关。在可变剪接上保守的SR磷蛋白家族因子磷蛋白家族因子的参的参与起重要作用。与起重要作用。nSR蛋白家族以不同的质的组成与量的差异蛋白家族以不同的质的组成与量的差异选择特选择特定的定的mRNA前体剪接位点前体剪接位点，不同的，不同的SR家族蛋白对家族蛋白对适当的
5、适当的mRNA前体可以诱导出不同选择的剪接方前体可以诱导出不同选择的剪接方式，在选择剪接上起决定作用。式，在选择剪接上起决定作用。8 RNP的调节的调节nhnRNP-A1在不同组织中的含量变化很大，不在不同组织中的含量变化很大，不参与组成性剪接。在选择参与组成性剪接。在选择5和和3剪接点时具有剪接点时具有可变剪接活性，成为参与可变剪接的调节因子，可变剪接活性，成为参与可变剪接的调节因子，在体内与在体内与SR蛋白共同调节蛋白共同调节组织特异性组织特异性的剪接。的剪接。nU5hnRNP在酵母中参与在酵母中参与5剪接点突变的可变剪剪接点突变的可变剪接。接。9 外显子限定模型外显子限定模型n真核细胞真
6、核细胞mRNA前体中内含子远远大于外显子，前体中内含子远远大于外显子，5与与3剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确地剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确地组合在剪接体中。组合在剪接体中。n有证据表明，在前速激肽原有证据表明，在前速激肽原mRNA前体的可变前体的可变剪接中，剪接中，外显子下游的外显子下游的5剪接位点剪接位点可影响其可影响其上上游内含子游内含子3的剪接的剪接。10选择剪接对基因表达的调控作用（实例）选择剪接对基因表达的调控作用（实例）（1）Bax基因转录产物的选择剪接基因转录产物的选择剪接 Bax基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子，基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子，（Bax/Bcl2调亡
7、调亡） Bax编码产生的编码产生的Pr.有几种（有几种（、等），结构略有等），结构略有差异，差异的产生来自差异，差异的产生来自mRNA的选择性剪接。的选择性剪接。 Bax 保留全部（保留全部（6个）外显子个）外显子共共192个密码子个密码子译出译出192AA多肽多肽 Bax 保留全部外显子和第保留全部外显子和第5个内含子（含终止码）个内含子（含终止码） 共共218个密码子。个密码子。 Bax 保留保留1、3、4、5、6外显子，删除第外显子，删除第2个外个外显子显子译出译出151AA多肽。多肽。13（三）（三） RNA编辑编辑nRNA编辑（编辑（RNA editing）是在）是在RNA分子上出分
8、子上出现的一种现的一种修饰现象修饰现象。主要指。主要指mRNA在转录后因在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换，改变了插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。的多种蛋白质。nRNA编辑似乎是编辑似乎是中心法则的例外中心法则的例外。编辑扩大了。编辑扩大了遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施。遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施。P260141. 核苷酸的替换核苷酸的替换 U替换替换n最典型的例子是载脂蛋白最典型的例子是载脂蛋白B的的RNA编辑。编辑。U替换替换使使Apo-B 100 CAA编码
9、的谷氨酰胺编码的谷氨酰胺突变为突变为UAA的终止密码子，产生编码的终止密码子，产生编码Apo-B48的的mRNA。在蛋白质水平上只保留了。在蛋白质水平上只保留了Apo-B100分子分子N端脂蛋白装配结构域，缺端脂蛋白装配结构域，缺少了少了C端低密度脂蛋白受体结合区。端低密度脂蛋白受体结合区。1516 AI替换替换n在在珠蛋白、珠蛋白、c-Myc、成纤维细胞生长因、成纤维细胞生长因子基因中都有因子基因中都有因AI替换使互补链的替换使互补链的U被被RNA酶酶A水解的现象。水解的现象。172. 可读框的改变可读框的改变n可读框的改变主要是核苷酸的可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺插入或缺失。失。nG
10、或或C的插入则往往是因为模板上连续几的插入则往往是因为模板上连续几个个C（或（或G）之后，互补链因一种）之后，互补链因一种滑动力滑动力而被添加到而被添加到RNA中。中。1819203. 向导向导RNAn向导向导RNA（gRNA）是一种线粒体内转录）是一种线粒体内转录的短的短RNA（约（约5570核苷酸），能以正核苷酸），能以正常碱基配对或常碱基配对或GU配对的方式，选择其配对的方式，选择其5末端末端“锚区锚区”在在mRNA上的互补序列，上的互补序列，为随后插入或缺失为随后插入或缺失U提供模板。提供模板。212223（四）（四）mRNA运输的调控运输的调控mRNA运输是受控制的。运输是受控制的。
11、1.3H-udR显示约显示约20%mRNA 胞浆，核内胞浆，核内RNA约在约在1小时内降解成小时内降解成小片段小片段2.核孔核孔9nm，但可运输，但可运输9nm颗粒颗粒（如核糖体（如核糖体15nm，在核内组装在核内组装 入胞作用）入胞作用） 用用20nm金颗粒（金颗粒（gold sphere）包装小包装小RNA（如（如tRNA或或5sRNA） 注射到蛙卵（注射到蛙卵（frogoocyte） 可迅速过核孔到可迅速过核孔到胞浆。但注射入浆胞浆。但注射入浆则不能入核则不能入核说明说明mRNA主动运输入胞，但机制不清楚。主动运输入胞，但机制不清楚。 P26124n翻译起始的调控翻译起始的调控未受精卵：
12、隐蔽未受精卵：隐蔽mRNA(masked mRNA)；受精：；受精：招募因子招募因子(recruitment factor)，激活隐蔽，激活隐蔽mRNA阻遏蛋白的调控：阻遏蛋白的调控：铁结合调节蛋白铁结合调节蛋白(regulatory iron-binding protein)翻译起始因子的调控：翻译起始因子的调控：eIF-2，血红素对珠蛋白，血红素对珠蛋白合成的调节合成的调节5AUG对翻译的调控作用：减少正常对翻译的调控作用：减少正常AUG启动启动翻译的作用，使翻译维持在较低水平翻译的作用，使翻译维持在较低水平mRNA5 端非编码区长度对翻译的影响端非编码区长度对翻译的影响翻译水平的调控翻译
13、水平的调控25翻译水平的调控翻译水平的调控n原核生物原核生物mRNAmRNA的半衰期很短，在翻译水平的半衰期很短，在翻译水平上的调控对于基因表达的影响也很小。上的调控对于基因表达的影响也很小。mRNAmRNA的二级结构控制着翻译的起始，核糖的二级结构控制着翻译的起始，核糖体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制作用。作用。n真核生物真核生物mRNAmRNA的半衰期比原核生物长的多，的半衰期比原核生物长的多，因此翻译过程受调控的机会也较多。因此翻译过程受调控的机会也较多。26n翻译水平的调控是真核生物基因表达多翻译水平的调控是真核生物基因表达多级调控的重要环节之一
14、。真核生物翻译级调控的重要环节之一。真核生物翻译水平调控最普遍的机制是起始因子的磷水平调控最普遍的机制是起始因子的磷酸化。酸化。n蛋白质合成装置各元件装配活力的改变蛋白质合成装置各元件装配活力的改变是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素。是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素。翻译的速度和细胞生长的速度是密切协翻译的速度和细胞生长的速度是密切协调的。调的。27一、翻译因子磷酸化调控n蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生物合成的激活或抑制作用密切相关。物合成的激活或抑制作用密切相关。n1 1 eIF-4FeIF-4F通过亚单位的可逆磷酸化对蛋白质通过亚单位的可
15、逆磷酸化对蛋白质生物合成进行调控。生物合成进行调控。 eIF-4E(eIF-4E() )和和eIF-eIF-4G(4G(/P220)/P220)亚基亚基的磷酸化对蛋白质的生物合的磷酸化对蛋白质的生物合成有激活作用。成有激活作用。28292 2其他因子磷酸化对翻译的激活作用其他因子磷酸化对翻译的激活作用neIF-4BeIF-4B在促有丝分裂剂作用下，随在促有丝分裂剂作用下，随eIF-4FeIF-4F和核和核糖体蛋白糖体蛋白S6S6一起，在细胞内被磷酸化，激活起一起，在细胞内被磷酸化，激活起始因子始因子eIF-4AeIF-4A和和eIf-4BeIf-4B的活性。的活性。3 3eIF-2eIF-2的
16、磷酸化对翻译的抑制作用的磷酸化对翻译的抑制作用neIF-2eIF-2亚基的亚基的磷酸化会导致磷酸化会导致eIF-2eIF-2与与eIF-2BeIF-2B紧紧密结合，直接影响了密结合，直接影响了eIF-2eIF-2的再利用，引起翻的再利用，引起翻译起始作用受阻，从而抑制蛋白质的生物合成。译起始作用受阻，从而抑制蛋白质的生物合成。30阻遏阻遏Pr.的调控作用的调控作用 进入胞浆并非所有的进入胞浆并非所有的mRNA分子分子立即与核糖体立即与核糖体结合结合翻译成翻译成Pr. 一些特定的翻译抑制一些特定的翻译抑制Pr. 可结合到可结合到mRNA5,抑制抑制翻译。如：翻译。如： 铁铁Pr.（ferriti
17、n）mRNA5端非编码区约端非编码区约30个核甘个核甘酸序列称为铁反应元件（酸序列称为铁反应元件（iron-response element） 可折叠成可折叠成1个茎环（发夹结构）个茎环（发夹结构） 可结合可结合1个铁结合个铁结合调节蛋白（调节蛋白（regulatoryiron-binding pro）。）。3133（1）有铁）有铁不抑制，快译运输工具。不抑制，快译运输工具。（2）无铁结合可运）无铁结合可运铁结合铁结合Pr.结合结合mRNA 抑制翻译。抑制翻译。铁结合调节蛋白铁结合调节蛋白32Met40S60S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、 eIF-6 elF-3ATPADP+Pie
18、lF4E, elF4G, elF4A, elF4B，PABMetMet-tRNAiMetelF-2GTP真核生物肽链真核生物肽链合成起始过程合成起始过程60S60S40SMetGDP+Pi各种各种elF释放释放elF-5MetMet80S 起始起始复合物复合物333435翻译起始因子翻译起始因子(eIF2)的调控的调控36(2)(2)翻译起始因子调节蛋白质合成的速度翻译起始因子调节蛋白质合成的速度无活无活性的性的elF-2elF-2 elF-2elF-2有活性的有活性的elF-2elF-2P P P PP375-AuG对翻译的调控作用对翻译的调控作用（1）按）按Pr.生物合成模型，生物合成模型
19、，90%真核真核mRNA符合第符合第1AUG规律规律译出正常译出正常Pr.（2）5AUG可以减少正常可以减少正常AUG翻译起始作用翻译起始作用使翻使翻译维持在较低水平。译维持在较低水平。原癌基因中是控制原癌基因表达原癌基因中是控制原癌基因表达的重要因素的重要因素缺失缺失导致某些原癌基因翻译激活。导致某些原癌基因翻译激活。5-AUG(1个或数个个或数个)第第1-AUG非编码区非非编码区非正常开放阅正常开放阅读框读框编码区正常编码区正常开放阅读框开放阅读框53 mRNA38nmRNA稳定性调节稳定性调节3端非编码区结构影响其稳定性：端非编码区结构影响其稳定性：3端富含端富含A和和U的结构，引起的结
20、构，引起mRNA 不稳定不稳定蚕蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蚕蚕蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蚕丝蛋白，丝蛋白，mRNA半衰期达半衰期达100小时，其他仅小时，其他仅2.5小时小时翻译水平的调控翻译水平的调控39mRNA 降解的机制降解的机制40小分子小分子RNA（lin-4）对翻译水平影响）对翻译水平影响Lin-14核核Pr.调控生长发育的时间选择调控生长发育的时间选择 Lin-4产生产生2个小分子个小分子RNA：1个长度个长度22个核苷酸，另个核苷酸，另1个在个在3端延长至端延长至40个核苷酸个核苷酸Lin-4RNA结合结合Lin14mRNA3UTR中的特异顺序中的特异顺序去掉这
21、种顺序去掉这种顺序mRNA就不会被抑制翻译。就不会被抑制翻译。n小分子小分子RNA对翻译水平的影响对翻译水平的影响41n新生肽链的水解新生肽链的水解：酶解：酶解肽链肽链N端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）与去稳定氨基酸）与去稳定氨基酸n肽链中氨基酸的共价修饰肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化、酰：磷酸化、甲基化、酰基化基化n通过信号肽通过信号肽(signal peptide)分拣、运输、定位分拣、运输、定位翻译后水平的调控翻译后水平的调控42蛋白质合成后的靶向输送（蛋白质合成后的靶向输送（ prot
22、ein targeting）n 蛋白质合成后的去向蛋白质合成后的去向留在胞浆留在胞浆进入核、线粒体或其它细胞器进入核、线粒体或其它细胞器 分泌至体液，输送至靶器官分泌至体液，输送至靶器官n靶向输送靶向输送-蛋白质合成后，定向地到达其蛋白质合成后，定向地到达其执行功能的目标地点执行功能的目标地点43n分泌性蛋白质分泌性蛋白质(secretory proteins)穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质n信号肽信号肽(signal peptide)N-端的一段疏水氨基酸端的一段疏水氨基酸 1040个氨基酸个氨基酸 把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合，然
23、后把把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合，然后把合成的蛋白质送出胞外合成的蛋白质送出胞外N-N 端碱性端碱性 疏水核心区疏水核心区 加工区加工区-C 碱性氨基酸碱性氨基酸 极性和小极性和小侧链氨基酸侧链氨基酸分泌蛋白分泌蛋白45信号肽信号肽识别颗识别颗粒粒信号肽信号肽(signal peptide)46外膜外膜转运转运体体内膜内膜转运转运体体线粒体蛋白的靶向输送线粒体蛋白的靶向输送47细胞核蛋白的靶向输送细胞核蛋白的靶向输送48分子生物学分子生物学 Molecular Biology核酸的分子杂交核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationDepartment of bio
24、chemistry and molecular biology49 碱基 核苷 核苷酸RNA 腺嘌呤（腺嘌呤（A） 腺苷腺苷 腺苷酸腺苷酸(AMP) 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G） 鸟苷鸟苷 鸟苷酸鸟苷酸(GMP) 胞嘧啶（胞嘧啶（C） 胞苷胞苷 胞苷酸胞苷酸(CMP) 尿嘧啶（尿嘧啶（U） 尿苷尿苷 尿苷酸尿苷酸(UMP)DNA 腺嘌呤（腺嘌呤（A） 脱氧腺苷脱氧腺苷 脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸(dAMP) 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G） 脱氧鸟苷脱氧鸟苷 脱氧鸟苷酸脱氧鸟苷酸(dGMP) 胞嘧啶（胞嘧啶（C） 脱氧胞苷脱氧胞苷 脱氧胞苷酸脱氧胞苷酸(dCMP) 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T） 脱氧胸苷脱氧胸苷 脱氧胸苷酸
25、脱氧胸苷酸(dTMP)DNA和和RNA的碱基的碱基核苷和相应的核苷酸核苷和相应的核苷酸50核苷酸之间连接核苷酸之间连接51 D DN NA A双双螺螺旋旋结结构构52Base pairing occurs in duplex DNA and also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA). 53Content of Table一、一、核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理二、二、核酸探针的制备核酸探针的制备三、三、核酸探针的标记核酸探针的标记四、四、核酸分子杂交技术核酸分子杂交
26、技术五、五、DNA芯片技术芯片技术54一、核酸分子杂交技术的一、核酸分子杂交技术的原理原理 有有互补特定核苷酸序列的单链互补特定核苷酸序列的单链DNA或或RNA混在混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（如把一段已知基因（DNA或或RNA）的核酸序列）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作以标记，当作探针（探针（probe), 与变性后的单链基因组与变性后的单链基因组DNA或或RNA等进行杂交。等进行杂交。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等用合
27、适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把技术）把标记物标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。的拷贝数及表达丰度等。 555657nDNADNA变性变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。n凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 58n溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降
28、。n溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。n 增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 59n复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为 退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。 60 应应 用
29、：用：1）检测特定生物有机体之间是否存在）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。 61影响杂交的影响杂交的因素因素n核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度n温度温度n离子强度离子强度n杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺n核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性n非特异性杂交反应非特异性杂交反应62 1、核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增
30、加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度，浓度 过高影响杂交效率过高影响杂交效率632、温度温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低 2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺杂交，加甲酰胺 降低降低Tm值值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm 值低值低5 643、离子强度离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，）高浓度的盐使碱基错
31、配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度的盐浓度 654、甲酰胺甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在用水溶液在6
32、8杂交杂交 665、核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度同顺序的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 676、非特异性杂交反应非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特
33、异性DNA和高分子化合物。如鲑精和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉溶液或脱脂奶粉68常用于预杂交的封闭物常用于预杂交的封闭物n变性的非特异性变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子常用鲑鱼精子DNA或小牛或小牛胸腺胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背
34、影清晰。性结合，使背影清晰。n高分子化合物：高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋白。非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋白。Home69二、核酸探针的制备二、核酸探针的制备探针探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的一段带有检测标记的与目的基因或目的基因或目的DNA特异互补的已知特异互补的已知核苷酸序列。核苷酸序列。70理想的探针理想的探针1.要加以标记、带有示踪物要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴，便于杂交后检测和鉴定杂交分子。定杂交分子。2.应是单链应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。，若为双链用
35、前需要先行变性为单链。3.具有高度特异性具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样，只与靶核酸序列杂交，不与样本中存在的其它核酸杂交。本中存在的其它核酸杂交。4.探针探针长度一般是十几个碱基不等长度一般是十几个碱基不等，小片段探针较，小片段探针较大片段探针杂交速率快。大片段探针杂交速率快。5.作为探针的核苷酸序列要作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列选取基因编码序列，避，避免用内含子及其它非编码序列。免用内含子及其它非编码序列。6.标记的探针应具有标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全。便、安全。71(一）探针的一）探针的分类分类据制备方法及核酸性质不同
36、，可分为：据制备方法及核酸性质不同，可分为： 基因组基因组DNA探针探针（genomic probe） cDNA探针探针（cDNA probe） RNA探针（探针（RNA probe） 寡核苷酸探针寡核苷酸探针（oligonucleotide probe)据探针标记物的类型不同：据探针标记物的类型不同：同位素标记的探针同位素标记的探针非同位素标记的探针非同位素标记的探针721、 Genomic probe从基因组文库中筛选和纯化获得的一从基因组文库中筛选和纯化获得的一个特定基因（或基因片段）的克隆片段。个特定基因（或基因片段）的克隆片段。多为某一基因的全部或部分序列（含有多为某一基因的全部或部
37、分序列（含有内含子序列），或某一非编码序列，或内含子序列），或某一非编码序列，或某一外显子序列。某一外显子序列。73这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。殖，取之不尽，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对探针不易降解（相对RNA而言），一般而言），一般能有效抑制能有效抑制DNA酶活性。酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标标记法等，能用于同位素和非同位素标记。记法等，能用于同位素和非同位素标记。 特点：特点：74
38、 cDNA（complementary DNA）是指互补）是指互补于于mRNA的的DNA分子。分子。 这种这种DNA探针不含有内含子序列。因此探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。尤其适用于基因表达的检测。2、 cDNA probe75 采用基因克隆或体外转录的方法获采用基因克隆或体外转录的方法获得。有些病毒的基因组是得。有些病毒的基因组是RNA，分离后，分离后经适当标记可制成经适当标记可制成RNA探针探针。3、 RNA probe76RNA探针探针优势优势杂交的效率高，杂交体杂交的效率高，杂交体较稳定。较稳定。RNA中不存在高度重复中不存在高度重复序列，因此非特异性杂序列，因此
39、非特异性杂交较少。交较少。杂交后杂交后RNase将未杂交将未杂交的探针分子消化掉，使的探针分子消化掉，使本底降低。本底降低。77 寡核苷酸探针是采用寡核苷酸探针是采用DNA合成仪人工合成的，合成仪人工合成的，与已知基因与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。一般长度为苷酸的片段。一般长度为 2050 个碱基。个碱基。 亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成以人工合成。4、oligonucleotide probe78探针的探针的制备方法制备方法探针长度一般以探针长度一般以50300bp为宜。为宜
40、。 制备方法：制备方法：1）利用）利用DNA重组技术重组技术（基因组（基因组DNA探探针制备）针制备）2）PCR扩增扩增（cDNA探针制备）探针制备）3）化学合成）化学合成（寡核苷酸探针制备）（寡核苷酸探针制备）79制备基因组文库制备基因组文库细胞细胞DNA酶切酶切重组重组DNA筛选获目的基因筛选获目的基因转化细菌，培养转化细菌，培养存在于转化细菌内，由克隆载存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组体所携带的所有基因组DNA的的集合称为基因组集合称为基因组DNA文库文库（genomic DNA library) 。制备探针时，增殖细菌，扩增、制备探针时，增殖细菌，扩增、提取质粒，用限制酶
41、切，回收提取质粒，用限制酶切，回收特定基因片段，经标记则成为特定基因片段，经标记则成为基因组基因组DNA探针。探针。80Construction of a Human Genomic Library81Restriction Enzyme - Action of EcoRI 82DNA recombination83cDNA 探针制备探针制备逆转录合成逆转录合成cDNA分离纯化分离纯化mRNA PCR扩增扩增84 根据已知的核酸顺根据已知的核酸顺序，采用序，采用DNA合成仪合成仪合成一定长度的寡核合成一定长度的寡核苷酸片段或根据蛋白苷酸片段或根据蛋白质氨基酸序列推导出质氨基酸序列推导出核酸顺序
42、加以人工合核酸顺序加以人工合成。成。化学合成（寡核苷酸探针制备）化学合成（寡核苷酸探针制备）Genetic code85合成寡核苷酸探针注意原则：合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（）长度（18-50 bp); 2）G:C对含量对含量40%-60%；3）探针内避免互补；）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有）与非靶序列有70%以上同源性或连续以上同源性或连续8个以个以上碱基序列相同，最好不用。上碱基序列相同，最好不用。Home86三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标
43、记，杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。以便在结合部位获得可识别的信号。87（一）标记物（一）标记物 1、理想标记物应具备的特性：、理想标记物应具备的特性：1）标记前后探针的基本结构、化学性质）标记前后探针的基本结构、化学性质相同相同;2）特异性强、本底低、重复性好；）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。）安全、无环境污染。88放放射射性性核核素素非非放放射射性性标标记记主要有：主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。等。优点：优点：灵敏度和特异性极高，可检出样灵敏度和特异性极高，可检出样 品中少于品中少于
44、1000个分子的核酸量。个分子的核酸量。缺点：缺点：半衰期短，稳定性差，污染环半衰期短，稳定性差，污染环 境、检测需时较长。境、检测需时较长。主要有：主要有：生物素、地高辛、辣根过氧生物素、地高辛、辣根过氧 化物酶，碱性磷酸酶及化物酶，碱性磷酸酶及FITC等。等。优点：优点： 具有稳定、安全、经济及实验周具有稳定、安全、经济及实验周期短等特点，近年来应用越来越期短等特点，近年来应用越来越广泛。广泛。缺点：缺点：灵敏度低于放射性核素标记的探针灵敏度低于放射性核素标记的探针2、标标记记的的种种类类89（二）探针的标记方法（二）探针的标记方法n放射性同位素标记法放射性同位素标记法v缺口平移法缺口平移
45、法(Nick translation)v随机引物延伸法随机引物延伸法(Random primer labelling)v末端标记法末端标记法(End labelling)n非放射性同位素标记法非放射性同位素标记法v酶促标记法、化学标记法酶促标记法、化学标记法90缺口平移法的原理缺口平移法的原理n 将将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的的53聚合酶活性和聚合酶活性和5 3外切酶活外切酶活性相结合。性相结合。nDNAase I 在探针在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助双链上造成缺口，然后再借助于于E.coli的的DNA pol I的的
46、53外切酶活性，切去带有外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 n 这两种活性同时作用，缺口不断向这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。探针。 91切口移位（平移）法切口移位（平移）法929394随机引物标记法原理随机引物标记法原理 用一些用一
47、些六核苷酸六核苷酸作为随机引物，将作为随机引物，将这些引物和探针这些引物和探针DNA片段一起热变性，片段一起热变性，退火后，引物与单链退火后，引物与单链DNA互补结合，互补结合，再在再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其补配对原则不断在其3- OH端添加标端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。记的探针片段。959697末端标记法原理末端标记法原理（1）一种是在）一种是在5末端加成标记法末端加成标记法： 先用先用碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷酸，再用磷酸，再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激
48、酶催化标记的催化标记的ATP转移加到转移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探针）在探针3-末端末端用末端转移酶用末端转移酶掺入一个掺入一个单标记的单标记的ddUTP。98末端标记法末端标记法99100非放射性同位素标记法非放射性同位素标记法光敏生物素标记核酸光敏生物素标记核酸 由一个光敏基团、一个连接臂和由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是的光敏基团是-N3，它在光作用，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。下可与核酸中的碱基结合。酶促标记法酶促标记法将标记物预先标记在核苷酸分子将标记物预先标记在核苷酸分子上，利用酶促聚合反应将其
49、掺入上，利用酶促聚合反应将其掺入到待标记的探针分子中去，或将到待标记的探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到核苷酸分子上的标记基团交换到核酸分子上。核酸分子上。 101探针的纯化探针的纯化1、乙醇沉淀法、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可片段，可去除去除dNTP和蛋白质和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将：利用凝胶的分子筛作用，将大分子大分子DNA和小分子和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷、磷酸根离子及寡核苷酸（酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法、微柱
50、离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针法则是利用离心的方式来纯化探针102103核酸分子杂交信号的核酸分子杂交信号的检测检测n放射性同位素标记探针：放射性同位素标记探针： 放射自显影放射自显影。 n非放射性同位素标记探针：非放射性同位素标记探针： 偶联反应偶联反应+显色反应显色反应。104放射自显影放射自显影 通过通过X光片检光片检测放射性核素标测放射性核素标记物。记物。其基本原理其基本原理为：为：同位素在不断衰同位素在不断衰变过程中释放出变过程
51、中释放出-粒子，粒子撞粒子，粒子撞击击X光片感光层，光片感光层，形成潜在影象，形成潜在影象，经过显影即可见经过显影即可见到成像。到成像。1051偶联反应偶联反应 可以通过抗原可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，再进行酶促显色反应。碱性磷酸酶的复合物结合，再进行酶促显色反应。2显色反应显色反应（1）酶促显色法：最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过）酶促显色法：最常用的酶是碱性
52、磷酸酶和辣根过氧化物酶氧化物酶（2）荧光法：荧光素探针主要用于原位杂交，最常用）荧光法：荧光素探针主要用于原位杂交，最常用的为的为FITC。 （3）化学发光法：化学发光指在化学反应过程中伴随）化学发光法：化学发光指在化学反应过程中伴随的发光反的发光反 应。应。化学法检测化学法检测106107地高辛标记探针杂交信号检测地高辛标记探针杂交信号检测Home108四、核酸分子杂交技术四、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 固相杂交固相杂交 液相液相杂交杂交 印迹杂交印迹杂交 原位杂交原位杂交n固相杂交：固相杂交：结合于某种固相支持物上的待结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进
53、行的杂测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。n液相杂交液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。进行杂交反应。109菌落杂交菌落杂交(Colony in situ hybridization)Southern印迹杂交印迹杂交(Southern blotting) 原位杂交原位杂交(in situ hybridization)其他类型杂交其他类型杂交（Other hybridization)斑点杂交斑点杂交(Dot blotting)Northern印迹杂交印迹杂交(Northern blotting
54、)110核酸分子杂交的基本程序核酸分子杂交的基本程序111 此技术由此技术由Southern 1975年首先设计。年首先设计。被被检测对象为检测对象为DNA。 （一）（一）Southern 印迹杂交印迹杂交112Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶蛋白酶K酚酚/氯仿氯仿无水乙醇无水乙醇离心离心113带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上纤维素滤膜）上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸
55、附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程1141、待测核酸样品的制备、待测核酸样品的制备 、裂解或破碎细胞、裂解或破碎细胞 、抽取纯化基因组、抽取纯化基因组DNA 、限制酶消化、限制酶消化DNA为大小不同的为大小不同的 DNA片段片段1152、待测、待测DNA样品的电泳分离样品的电泳分离 、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶分离小片段用高浓度胶 、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢泳动慢,小分子小分子DNA泳动泳动 快，大小
56、快，大小 相同的分子处于同一相同的分子处于同一 条带条带 、分子量标准：经、分子量标准：经Hind消化的消化的DNA，杂，杂 交所用分子量标准可用核素交所用分子量标准可用核素 标记标记 1163、凝胶中核酸的变性（碱变化）、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于凝胶置于NaOH溶液中使溶液中使DNA变性变性断裂为较短的单链断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。和凝胶中的缓冲液。4、Southern印迹印迹 指将电泳分离的指将电泳分离的DNA片段转移到片段转移到一定的固相支持物上的过程。一定的固相支持物上的过程。117固相支持物的选择固相支持物的选择（1）理想的固相
57、支持物应具备的特性）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能具有良好的机械性能 非特异吸附少非特异吸附少118（2）常用的固相支持物）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交优点是吸附能力强，杂交信号本信号本 底低。缺点是底低。缺点是DNA分子依靠疏水作用而吸分子依靠疏水作用而吸附在膜上，结合不牢固附在膜上，结合不牢固 尼龙膜：尼龙膜：优点是结合单链，双链优点是结合单链，双链DNA的能的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：
58、杂交信号本底高力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：化学活化膜：优点：优点：DNA与膜共价结合；与膜共价结合；对不同大小的对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：片段有同等结合能力；缺点：结合能力较低结合能力较低119120121122123Southern印迹的常用方法印迹的常用方法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的的DNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。 其其基本原理基本原理是是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、钠，上层吸
59、水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。片段移出凝胶而滞留在膜上。（1）毛细管虹吸印迹法）毛细管虹吸印迹法124白瓷盘白瓷盘玻玻璃璃板板滤滤纸纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物吸水纸转膜吸水纸转膜125126（2）真空转移法）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一将其放置在一个真空
60、室上，利用真空作用将转膜缓冲液个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。127真空转膜槽真空转膜槽滤滤纸纸尼尼龙龙膜膜凝胶凝胶盖子盖子+-真空转膜真空转膜128129（3）电转法）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。130131 5、Southern杂交杂交 、预杂交、预杂交：封闭膜上能与：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预
61、杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液。探针的杂交液。 、杂交、杂交：液相中的：液相中的DNA探针与膜上的待测探针与膜上的待测DNA 杂交，双链杂交，双链DNA探针需加热变性为单探针需加热变性为单 链，再杂交。链，再杂交。 、洗膜、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合：去除游离的放射性探针或非特异结合 的的 DNA。1326、杂交结果检测、杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针标记的探针1337、Southern杂交在医学中的应用杂交在医学中的应用 1
62、、酶切图谱分析、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量、特定基因定性和定量 3、基因突变分析、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析、限制性片段长度多态性的分析134（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基基 本相同本相同 2、检测目的、检测目的RNA的存在与否及含量的存在与否及含量 3、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 4、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNA 这是经典的这是经典的RNA分析法，目前主要用于检测某一分析法，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异组织或细胞中已知的特异mRN
63、A的表达水平以及的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。135Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持变性剂保持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前电泳前和电泳中不变性和电泳中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性转膜前需进行碱变性及中和处理及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA136 28S18S RNA电泳电泳
64、137138-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达139Northern 杂交的主要用途杂交的主要用途 主要用于检测某一组织或细胞主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异中已知的特异mRNA的表达水平以的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。的表达情况。140（三）（三）Western印迹杂交印迹杂交 检测检测蛋白质蛋白质，即将电泳分离的非，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。的方法。141主要步骤：主要
65、步骤：蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备PAGE电泳电泳蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：PVDF膜膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测n靶蛋白于第一抗体（一靶蛋白于第一抗体（一抗）反应抗）反应n与标记的第二抗体（酶与标记的第二抗体（酶标二抗）反应标二抗）反应n显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应142143144（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting原理：原理：是将被检标本的是将被检标本的RNA或或DNA变性后直接点样变性后直接点样吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针
66、与之杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。时检测多个样品。 优点：优点：用于基因组中特定基因及其表达的定性及定用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。缺点：缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。有一定比例的假阳性。145146147(五）原位杂交五）原位杂交in situ hybridization 又分为菌落杂交或噬菌斑、以及又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。真核细
67、胞原位杂交。 它是利用标记的它是利用标记的已知核酸探针已知核酸探针，在组织、，在组织、细胞及染色体上细胞及染色体上检测特异的检测特异的DNA或或RNA序序列列的核酸杂交技术。组织细胞原位杂交是检的核酸杂交技术。组织细胞原位杂交是检测细胞内的核酸片段，它保持了细胞的形态测细胞内的核酸片段，它保持了细胞的形态结构和组织的立体构型，适合于结构和组织的立体构型，适合于核酸定位和核酸定位和分布研究分布研究。148核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤149HPVHPVFISHFISH150菌落原位杂交菌落原位杂交 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上
68、，然后将滤膜上的移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出菌落裂菌以释出DNA。将。将DNA烘干固定于烘干固定于膜上与膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。位。151152153液相杂交液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。形成杂交分子的过程。nRNA酶保护分析法酶保护分析法n核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法154（六）（六）RNA酶保护分析法酶保护分析法
69、1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系专一水解杂交体系中的单链中的单链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成的双链互补形成的双链RNA，使杂交分子得，使杂交分子得到保护，称到保护，称RNA酶保护分析法。酶保护分析法。155 待测待测RNA样品样品 单链单链RNA探针探针 液相杂交液相杂交 RNA-RNA杂交双链杂交双链 RNA酶（专一降解未杂交的酶（专一降解未杂交的 RNA单链）单链） 酶解酶解 杂交体系纯化杂交体系纯化 脲脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影放射自显影2 2、杂交过程、杂交过程156（
70、七）核酸酶（七）核酸酶S1保护分析法保护分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体在一定条件下专一水解杂交体系中的单链系中的单链DNA和单链和单链RNA，不水解，不水解DNA探针与待测探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法。保护分析法。157 待测待测RNA样品样品 单链单链DNA探针（探针（M13体系合成体系合成） 液相杂交液相杂交 DNA-RNA杂交双链杂交双链 核酸酶核酸酶S1（专一降解未杂交的（专一降解未杂交的DNA和和 RNA单链）单链） 酶解酶解 杂交体系纯化杂交体系纯化 脲
71、脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影放射自显影 2 2、杂交过程、杂交过程158Home159五、生物芯片五、生物芯片 生物芯片（生物芯片（biochip）是近年来在生命）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的在固体芯片表面构建的微型生物化学分析微型生物化学分析系统系统，以实现对细胞、蛋白质、，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及以及其他生物组分的准确、快速与其他生物组分的准确、快速与大信息量大信息量的的检测。检测。 160Biochips
72、nGene chip, DNA chip, DNA microarraynProtein chipnLab-on-a-chip ( (缩微芯片实验室）缩微芯片实验室）161（一）（一）DNA芯片技术的芯片技术的基本原理基本原理 DNA芯片技术的芯片技术的基本原理基本原理是大是大规模集成的固相核酸分子杂交，与规模集成的固相核酸分子杂交，与Southern杂交和杂交和Northern杂交同出杂交同出一理，即一理，即DNA的碱基互补配对和序的碱基互补配对和序列互补原理。列互补原理。162n据芯片的制备分为：据芯片的制备分为： 1）原位合成芯片）原位合成芯片 2）DNA微集阵列（微集阵列（DNA mi
73、croarray)n据据DNA芯片上微排列的芯片上微排列的DNA不同分：不同分： 1）寡核苷酸芯片）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片芯片（二）（二）DNA芯片的类别芯片的类别1631芯片方阵的构建芯片方阵的构建2样品制备样品制备3生物分子反应生物分子反应4信号的检测及分析信号的检测及分析 （三）（三）DNA芯片技术流程芯片技术流程164DNA芯片技术流程芯片技术流程BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayernMicroarray fabricationnSample preparationnMolecular hybridizationnDetection and analysis165
