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1、生物制药工艺学生物制药工艺学Biopharmacetical Technology 第七章第七章 亲和层析亲和层析 Affinity Chromatography 亲和层析亲和层析 ( Affinity Chromatography, AC) 亲和层析的亲和层析的基本概念基本概念 亲和层析亲和层析载体载体的性质与选择的性质与选择 亲和层析亲和层析配基配基的性质与选择的性质与选择 载体、配基、目的物的载体、配基、目的物的连接连接(难点)(难点) 亲和层析的亲和层析的基本操作基本操作(重点)重点)第一节:第一节: 亲和层析(亲和层析(Affinity Chromatography)的基本概念及特点
2、:)的基本概念及特点: 一、一、 基本概念:基本概念:(basic concept): 1: 亲和层析亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基是利用待分离物质与其特异性配基之间之间特异性的亲和力特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术进行分离的一类特殊的层析技术. Typically offers purities 95% in one step. 2: 配基(配基(ligand) :被固定在基质上的分子被固定在基质上的分子称为配基,配基和基质是以共价键结合的。称为配基,配基和基质是以共价键结合的。 3: 基质(基质(matrix):亦称为载体(亦称为载体(vector):是是 构成固定相的骨
3、架构成固定相的骨架 。 二:亲和层析有如下特点:二:亲和层析有如下特点:(Characteristics of Affinity Chromatography)n 1:纯化纯化过程简单过程简单、迅速、迅速.n 2:分离分离效率效率高。高。n 3:产物产物纯度纯度高。高。n 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。求稳定的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。因此应用范围受到一定的限制。 三:亲和层析的基本原理三:亲和层析的基本原理(Mechanism of Affinity Chromatography) 1:亲和的一对分子中的一方以
4、共价键形式与:亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为不溶性载体相连作为固定相吸附剂固定相吸附剂。 2:当含有混合组份的样品(流动相)通过:当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。和力的无关组份就随流动相流出。 3:然后改变流动相成份,将结合的亲和物:然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来。(见洗脱下来。(见Fig1、Fig2)。 ( Fig1. Mechanism of AC)( Fig2.
5、Mechanism of AC)具有特异性亲和作用的生物分子具有特异性亲和作用的生物分子 四:配基的种类四:配基的种类:(sorts of ligand)1:抗原与抗体。:抗原与抗体。2:DNA与互补与互补DNA或或RNA(cDNA、 mRNA)。3:酶与其底物。:酶与其底物。4:激素与其受体。:激素与其受体。5:维生素与结合蛋白。:维生素与结合蛋白。6:糖蛋白与植物凝集素。:糖蛋白与植物凝集素。 五:亲和层析载体的性质与选择五:亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择(selection of vectors)1:多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的:多孔的立体网状结构,
6、能使被亲和吸附的 大分子自由通过。大分子自由通过。2:颗粒均匀,具有良好的流速。:颗粒均匀,具有良好的流速。3:具有惰性,尽量减少非专一性吸附。:具有惰性,尽量减少非专一性吸附。4:在温和的条件下:在温和的条件下 能与配基共价偶联。能与配基共价偶联。亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择 六:常用的亲和层析载体:六:常用的亲和层析载体: (Vectors of Affinity Chromatography) 1:纤维素:纤维素 (cellulose) 2:葡聚糖凝胶:葡聚糖凝胶 (Sephadex) 3:琼脂糖凝胶:琼脂糖凝胶 (Sepharose) 4:聚丙烯酰胺凝胶:聚丙烯酰胺
7、凝胶(Bio-gel P) 5:多孔玻璃珠:多孔玻璃珠 (Bio-Glass) 6:其它新型载体:其它新型载体 (Other gels) 七:七: 亲和层析配基的选择亲和层析配基的选择 (Selection of ligand) 1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力. 2.但亲和力太高也是有害的,因为在解离配但亲和力太高也是有害的,因为在解离配 基复合物时所基复合物时所 需的条件就要强烈,这样可需的条件就要强烈,这样可 能使生物分子变性。能使生物分子变性。 3.配基必须具有适当的化学基团,可用于和配基必须具有适当的化学基团,可用于和 载体相连,同时又不影
8、响配基与生物分子载体相连,同时又不影响配基与生物分子 之间的亲和力。之间的亲和力。亲和层析配基的性质与选择亲和层析配基的性质与选择n配基的偶联配基的偶联:n 1: 酸酐法酸酐法n 2: 羟基琥珀酰亚胺法羟基琥珀酰亚胺法n 3:叠氮化作用:叠氮化作用n 4:还原性烷基化合物(西夫碱)的形成:还原性烷基化合物(西夫碱)的形成第二节第二节:载体、配基、目的物的连接:载体、配基、目的物的连接:(Conjunction of vector、ligand and target material)n载体(载体(Vectors or Matrix) +n配基(配基(Ligand) +n目的物(目的物(targ
9、et material) 见见(Fig3,Fig4, Fig5)Fig 3. AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.Fig4 .Spacer arm principle A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.Fig5 . Principle of preparing AC media第三节:亲和层析的基本操作方法:第三节:亲和层析的基本操作方法:n1.平衡(平衡( Equilibration) 用平衡用平衡Buffer 冲洗柱体,至基线平稳冲洗柱体,至基线平稳.2. 样品上柱和冲洗:样品上柱和冲洗:(Sample application and wash) 样品中的目的物与层析介质选择样品中的目的物与层析介质选择性的吸附,杂质不被吸附。用上样性的吸附,杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体,杂质被冲洗下来。冲洗柱体,杂质被冲洗下来。形成杂质峰(见下图)。形成杂质峰(见下图)。3. 洗脱(洗脱(Elution) 选择适当的条件,将吸附在亲和介质选择适当的条件,将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来(见下图)。上的目的物解吸下来(见下图)。