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1、第二章 酶的生产酶的应用领域EnzymesDiagnosticIndustrialenzymesBasic ResearchTherapeuticsAgricultureStructuralstudies 本课程讲授主要针对工业酶制剂酶的生产方法动植物天然提取但动植物原料生长周期长、成本高，又受地但动植物原料生长周期长、成本高，又受地理、气候和季节等因素影响。理、气候和季节等因素影响。野生菌发酵基因工程菌(已经成为主流方法)微生物发酵目前工业应用酶大多数来自微生物，这是因为目前工业应用酶大多数来自微生物，这是因为以微生物为生产原料有许多优点以微生物为生产原料有许多优点微生物种类繁多；微生物种类
2、繁多； 产酶微生物多；产酶微生物多；一种微生物可以产多种酶；一种微生物可以产多种酶；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物易改造，可通过多种手段进行育种。微生物易改造，可通过多种手段进行育种。微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程酶的发酵生产酶的生产菌酶的生产菌 先决条件，直接影响发酵的生产成本先决条件，直接影响发酵的生产成本. .对生产菌的要求：对生产菌的要求：产酶量高，产酶量高，最好分泌胞外酶最好分泌胞外酶；容易培养和管理，能容易培养和管理，能利用廉价原料，发酵周期短利用廉价原料，发酵周期短。生产菌稳定，生产菌稳定，不易变异、退化、不易感染
3、噬菌体不易变异、退化、不易感染噬菌体；非病源菌，非病源菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产毒素同时在系统发育上与病原菌无关，不产毒素及其他生理活性物质及其他生理活性物质；中国国家级菌种保藏管理中心（7个） 名称及成立年份名称及成立年份 依依 托托 单单 位位 中国农业微生物菌种保藏管理中心中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院土壤肥料研究所中国农业科学院土壤肥料研究所 (ACCC)(ACCC)1980 1980 中国工业微生物菌种保藏管理中心中国工业微生物菌种保藏管理中心 中国食品发酵工业研究院中国食品发酵工业研究院 (CICC)(CICC)1979 1979 中国医学微生物菌种保藏
4、管理中心中国医学微生物菌种保藏管理中心 中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所 (CMCC)(CMCC)1979 1979 中国兽医微生物菌种保藏管理中心中国兽医微生物菌种保藏管理中心 中国兽医药品检定所中国兽医药品检定所 (CVCC)(CVCC)1979 1979 中国林业微生物菌种保藏管理中心中国林业微生物菌种保藏管理中心 中国林业科学研究院中国林业科学研究院 (CFCC)(CFCC)1985 1985 中国抗菌素菌种保藏管理中心中国抗菌素菌种保藏管理中心 中国医学科学院医药生物技术研究所中国医学科学院医药生物技术研究所 (CACC)(CACC)1979 1979 中国普通微生物菌种
5、保藏管理中心中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所 (CCGMC)(CCGMC)1979 1979 国外菌种中心American Type Culture CollectionAmerican Type Culture Collection http:/www.atcc.org http:/www.atcc.orgJapan Collection of Microorganisms Japan Collection of Microorganisms http:/www.jcm.riken.go.jphttp:/www.jcm.riken.go.jpThe
6、 The United Kingdom National Culture United Kingdom National Culture collection collection http:/www.ukncc.co.ukhttp:/www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen und Zellkulturen http:/www.dsmz.dehttp:/www.dsmz.deATCC ATCC 美国菌种中心，最大的菌种中
7、美国菌种中心，最大的菌种中心心, ,有病毒、细菌、真菌、细胞有病毒、细菌、真菌、细胞等不同的微生物等不同的微生物JCM JCM 日本微生物菌种中心日本微生物菌种中心英国国家菌种中心，英国国家菌种中心，Over 70,000 Over 70,000 micro-organisms and cell micro-organisms and cell lines are available. lines are available. 德国微生物与细胞收集中心德国微生物与细胞收集中心主要产酶菌（野生）枯草杆菌枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖
8、氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。酵母：酵母：工业上广泛应用。工业上广泛应用。霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黄曲酶菌等）：霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黄曲酶菌等）：糖化糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。大肠杆菌：大肠杆菌：因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程工程菌菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸
9、脱羧酶、。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。主要产酶菌（基因工程菌）米曲霉（真核系统）木霉（真核系统）酵母（真核系统），毕赤酵母是高效表达系统。枯草杆菌（原核系统）大肠杆菌（E. coli） （原核系统）蛋白质的糖基化限制了原核系统。酶合成的调节原核部分为重点真核生物的仅做了解 一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription) 定义定义 以以
10、DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNARNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分分子的过程。子的过程。RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promotor) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种体上通过
11、各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译翻译翻译翻译(translation)(translation) 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌） 氨基酸的活化氨基酸的活化 肽链合成的起始肽链合成的起始 肽链的延伸肽链的延伸 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运反应式：反应式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tR
12、NA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的第一个而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操纵
13、子操纵子基因表达的协同单位基因表达的协同单位操纵子操纵子结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质, , structural gene, S）控制部位控制部位操纵基因操纵基因（operator gene, O）启动子启动子（promotor gene, P）（一）基因调控理论（一）基因调控理论 Jacob and Monod的的操纵子学说操纵子学说（operon theoryoperon theory） 调节基因调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein) ，通过与效应物通过与效应物(effector) （
14、包括诱导物或辅阻遏物）（包括诱导物或辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子 cAMP-CRP复合物的作用示意图复合物的作用示意图 启动基因启动基因（promo
15、tor gene）（）（启动子）：启动子）： 有两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），），又称环腺苷酸受体蛋白又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结
16、合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。 操纵基因操纵基因（Operater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因结构基因（Structural gene）: : 决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自的模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。( (二二) ) 酶合成调节的类型
17、酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。物而临时合成的一类酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制（三）酶合成的调节机制 1. 1. 1. 1. 酶合成的诱导酶合成的诱导酶合成的诱导酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物
18、合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1 1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；上述三种酶合成；（2 2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；酶合成； 表明菌体生物合
19、成的经济原则：表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性） 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端
20、产物的过量累积引起的阻遏。由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1 1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2 2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体生长的经济原则: :不需要就不
21、合成不需要就不合成。 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏
22、蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋阻遏蛋白白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够
23、阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物调控方式调控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 与操纵基与操纵基因结合因结合阻遏效应阻遏效应举例举例酶的诱导酶的诱导有活性有活性不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译诱导物诱导物转录，转录，继而翻译继而翻译乳糖操乳糖操纵子纵子酶的阻遏酶的阻遏无活性无活性阻遏物阻遏物不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译色氨酸色氨酸操纵子操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时
24、，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，
25、产生了两个对数生长萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象二次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。 这一现象又称葡萄糖效应，产生这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。解乳糖酶系的合成。此调节基因的产此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（物是环腺苷酸受体蛋白（CRPCRP）, ,亦称亦称降解物基因活化蛋白（降解物基因活化蛋白（CAPCAP）。）。分解代谢物阻遏分解代谢物阻
26、遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态酶生产发酵工艺菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐
27、试验酶生产发酵工艺培养基组成碳源、氮源、碳氮比、无机盐、生长因子pH值温度溶解氧诱导方式阻遏解除其它添加剂 发酵工艺的优化 培养基：碳源、氮源、无机盐和生长因子等； pH值：与细胞生长繁殖及发酵产酶都有密切关系，并且在细胞生长繁殖和代谢物产生过程中往往会发生变化，所以必须进行必要的调控。还可以此改变各种酶产量比。 温度： 是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素，不同细菌有各自不同的最适生长温度，在发酵的不同阶段培养基温度变化明显；产酶最适温度和细胞最适生长温度不同 ，故必须经常及时地进行温度调控。 溶解氧：根据细胞对溶解氧的需要量进行 连续不断的无菌空气供给，以使 培养基中的溶解氧维持在一定水
28、 平，保证碳源有氧降解。发酵周期：作生长曲线和产酶曲线，确定放 罐时间，避免自溶。 总之，总之，优良菌种的筛选、适宜条件的确定是优良菌种的筛选、适宜条件的确定是获得高产酶的重要措施，能较大幅度提高酶产量，获得高产酶的重要措施，能较大幅度提高酶产量，尽量挖掘微生物的产酶潜力。但是措施是有限的，尽量挖掘微生物的产酶潜力。但是措施是有限的，并且是经验的，随机性大，单靠这些措施很不够。并且是经验的，随机性大，单靠这些措施很不够。为了使酶产量有一个飞跃，要采取另外一些有效措为了使酶产量有一个飞跃，要采取另外一些有效措施。施。 2、采用添加诱导物、解除阻遏物、流加等技术 诱导酶：对于诱导酶的发酵生产，添加
29、适量诱导物可使酶产量显著提高；许多工业用酶都属诱导酶。 诱导物：原理是，加入效应物与阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使结构基因得以表达；实际工作中，关键是选择一个恰当的诱导物、确定诱导浓度及诱导时间。 诱导物一般有以下几类： 难于被利用的底物，底物类似物或底物修饰物； 诱导物的前体； 胞外酶的作用产物； 诱导物添加的量和时间要通过实验确定。 降低阻遏浓度 引起阻遏的原因有两种： 尾产物阻遏：可去除尾产物或使其尽量少形成，如添加尾产 物类似物或抑制剂；采用营养缺陷型菌株并限 制其生长必需因子的供应。 分解代谢产物阻遏： A)、尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源； B)、流加。 表面活性剂促进
30、分泌到胞外 细胞内酶含量提高到一定程度，会被胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂之类促进分泌剂，可使胞内酶未被分解即被释放到胞外。因为表面活性剂有助于改善细胞通透性，因而也可打破细胞内酶合成的“反馈平衡”。 常用：Tween-80、Triton x-100等。3、诱变育种-人为引起基因突变， 使亲株失去固有产酶机制 诱变育种是采用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速高效的筛选方法，从中挑选出少数符合要求的突变株。 (1) 基因突变： 是遗传物质核酸(DNA,RNA)中的核苷酸顺序突然发生稳定的可遗传的变化，包括DNA链上一对或少数几对碱基发生改变
31、（点突变），或是DNA的大段变化、损伤（染色体畸变） 突变可发生在DNA顺序的不同位置上：结构基因、调节基因、操纵基因、启动基因 (2) 诱变目的： 诱导型 组成型：以使获得的突变株在没有诱导物存在条件下，酶产量也能达到诱导水平。 阻遏型 去阻遏型：即获得的突变株通常引起阻遏的条件下酶产量也达到无阻遏水平。 (3) 引发因素： 自发 物理：紫外线、X射线、射线、高能电 子、快速中子等； 化学： 亚硝基胍、亚硝酸等。 基因重组 构建工程菌 所谓基因重组是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体 上，组成重组子，将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达
32、到改造生物细胞目的的技术 。 利于克服上述基因突变预见性小、工作量大的利于克服上述基因突变预见性小、工作量大的不足，成为微生物发酵产酶菌改造的新途径，又可不足，成为微生物发酵产酶菌改造的新途径，又可把有实用价值的人和动植物来源的酶基因引入微生把有实用价值的人和动植物来源的酶基因引入微生物中，用微生物作为物中，用微生物作为“工厂工厂”生产天然来源不易得生产天然来源不易得到的或纯度极底的酶。到的或纯度极底的酶。如组织型纤维蛋白溶酶原激如组织型纤维蛋白溶酶原激活剂活剂 （tpa)等等 构建工程菌分为四步： 目的基因片断的产生和分离； 目的基因片断共价连接到载体上，即体外重组； 体外重组的杂合分子转入
33、合适的宿主； 筛选和检测。基因工程基本流程图分离分离酶切酶切外源基因外源基因供体细胞供体细胞载体分子载体分子拼接拼接基因工程基本流程图（续2）鉴定表达鉴定表达蛋白表达产物蛋白表达产物培养纯化培养纯化 从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种产产 品品基因工程基因工程基因工程基因工程诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种生产用菌种生产用菌种生产用菌种生产用菌种扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原原原原 料料料料微生物菌体微生物菌体微生物菌体微生物菌体代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物分离提纯分离提纯分离提纯分离提纯接种接种接种接种培养基配置培养基配置培养基配置培养基配置灭菌灭菌灭菌灭菌问题列举常用的碳源和氮源？无机盐和生长因子为什么可以影响产酶？常见产酶微生物的适宜pH一般为多少？调节溶解氧的方法有哪些？发酵工业氧气利用率一般为多少？谢谢！
