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1、第六章第六章 核磁共振波谱分析法核磁共振波谱分析法第一节第一节 核磁共振基本原理核磁共振基本原理nuclear magnetic resonance spectroscopy; NMR principles of nuclear magnetic resonance 2024/7/26核磁共振波谱学的发展核磁共振波谱学的发展v 19461946年年，PurcellPurcell和和BlochBloch观察到核观察到核磁共振现象。磁共振现象。于于19521952年年获得获得诺贝尔物理奖诺贝尔物理奖2024/7/261945-19511945-1951年间，化学位移和自旋偶合的发现，年间，化学位移
2、和自旋偶合的发现，年间，化学位移和自旋偶合的发现，年间，化学位移和自旋偶合的发现，NMRNMR技术的化学应用。技术的化学应用。技术的化学应用。技术的化学应用。19531953年年年年 世界上第一台商品化世界上第一台商品化世界上第一台商品化世界上第一台商品化NMRNMR谱仪谱仪谱仪谱仪. .19641964年年年年 世界上第一台超导磁场的世界上第一台超导磁场的世界上第一台超导磁场的世界上第一台超导磁场的NMRNMR谱仪谱仪谱仪谱仪19711971年世界上第一台脉冲傅立叶变换年世界上第一台脉冲傅立叶变换年世界上第一台脉冲傅立叶变换年世界上第一台脉冲傅立叶变换NMRNMR谱仪谱仪谱仪谱仪2024/7
3、/261976年R.R.Ernst发表了二维核磁共振的理论和实验的文章。获得1991年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖2024/7/261 1原子核的自旋原子核的自旋: :atomic nuclear spin 一一. .基本原理基本原理如果放在外磁场中如果放在外磁场中,原子核和电子一样原子核和电子一样,存在自旋存在自旋.从而有自旋角从而有自旋角动量动量()和磁矩和磁矩2024/7/26 核的核的自旋角动量自旋角动量( () )是量子化的，不能任意取是量子化的，不能任意取值，可用自旋量子数值，可用自旋量子数( (I I) )来描述。来描述。I0 0、1/21/2、11 h:普朗克常数 I = 0， =
4、0=0， 无自旋，不能产生自旋角动量，无自旋，不能产生自旋角动量，不会产生共振信号。不会产生共振信号。 只有当只有当I I O O时，才能发生时，才能发生共振吸收共振吸收, ,产生共振信号。产生共振信号。 I I 的取值可用下面关系判断：的取值可用下面关系判断： 2024/7/262024/7/262.2.自旋核在外加磁场中的自旋核在外加磁场中的取向取向( (旋转方向旋转方向) ) 取向数取向数 = 2 I + 1 在没有外磁场时，自旋核的取向是任意的在没有外磁场时，自旋核的取向是任意的, ,并且自旋并且自旋产生的磁场方向也是任意的产生的磁场方向也是任意的. . 如果把如果把H H核放在外磁场
5、中核放在外磁场中, ,由于磁场间的相互作用由于磁场间的相互作用, ,氢核的磁场方向会发生变化氢核的磁场方向会发生变化: :如如:H:H的的I=1/2,I=1/2,则则: :2024/7/26 每一种取向都对映一个能级状态，有一个每一种取向都对映一个能级状态，有一个ms 。如：。如：1 1H H核：标记核：标记msms为为1/2 1/2 和和 +1/2 +1/2 2024/7/26H0m=1/2m=-1/2m=1m= - 1m=0m=2m=1m=0m= - 1m= - 2I=1/2I=1I=2zzz1Prm=1/2 m= -1/2H0HE2=+ m m H H0 0E= E2 E1 = 2m m
6、 H H0 0E1= m m H H0 0自旋核在磁场中的行为2024/7/26能级分布与弛豫过程能级分布与弛豫过程不同能级上分布的核数目可由不同能级上分布的核数目可由Boltzmann 定律计算：定律计算：磁场强度磁场强度2.3488 T；25 C；1H 的共振频率与分配比：的共振频率与分配比：两能级上核数目差：两能级上核数目差：1.6 10-5；弛豫弛豫(relaxtion)高能态的核以非辐射的方式回到低能态。高能态的核以非辐射的方式回到低能态。饱和饱和(saturated)低能态的核等于高能态的核。低能态的核等于高能态的核。2024/7/26讨论讨论:共振条件： 0 = H0 / (2
7、)（1）对于同一种核）对于同一种核 ，磁旋比，磁旋比 为定值，为定值， H0变，射频频率变，射频频率 变。变。（2）不同原子核，磁旋比）不同原子核，磁旋比 不同，产生共振的条件不同，需不同，产生共振的条件不同，需要的磁场强度要的磁场强度H0和射频频率和射频频率 不同。不同。 （3） 固定固定H0 ，改变，改变 （扫频）（扫频） ，不同原子核在不同频率处，不同原子核在不同频率处发生共振（图）。也可固定发生共振（图）。也可固定 ，改变，改变H0 （扫场）。扫场方式（扫场）。扫场方式应用较多。应用较多。 氢核（1H）： 1.409 T 共振频率 60 MHz 2.305 T 共振频率 100 MHz
8、 磁场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4 T（特拉斯）2024/7/26v氢核（1H）： 14092G 共振频率 60 MHzv 2.305 T 共振频率 100 MHzv 磁场强度H0的单位：1高斯（GS）=10-4 T（特拉斯）2024/7/26讨论讨论: 在1950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构（化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移和裂分，如右图所示。 由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化学环境的信息，进一步确定化合物结构。2024/7/26四、核磁共振波谱仪四、核磁共振波谱仪 nuclear magnetic resonance spec
9、trometer1永久磁铁永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2 射频振荡器射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。2024/7/26核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪2024/7/262024/7/262024/7/263 射频信号接受器射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4样品管样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转, 磁场作用均匀。2024/7/26NMR 谱仪600 MHz磁体探头机柜RF 产生RF 放大信号检测数据采集控制
10、数据信息交流运行控制磁体控制前置放大器计算机数据储存;数据处理;总体控制.2024/7/26NMR 谱仪: 探头RF 接口RF 线圈+调谐元件(电容器)HelmholtzSolenoid2024/7/26RF-Coil in NMR Probes2024/7/26傅立叶变换核磁共振波谱仪傅立叶变换核磁共振波谱仪 不是通过扫场或扫频产不是通过扫场或扫频产生共振；生共振； 恒定磁场，施加全频脉恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共立叶变换获得一般核磁共振谱图。振谱图。（类似于一台多道仪）（类似于一台多道仪）
11、2024/7/262024/7/26超导核磁共振波谱仪：超导核磁共振波谱仪： 永久磁铁和电磁铁：永久磁铁和电磁铁： 磁场强度100 kG 开始时，大电流一次性励磁后，闭合线圈，产生稳定的磁场，长年保持不变；温度升高，“失超”；重新励磁。 超导核磁共振波谱仪：超导核磁共振波谱仪： 200-400HMz；可 高达600-700HMz；2024/7/262024/7/2690年代末核磁共振波谱技术的新进展高场超导核磁谱仪的使用高场超导核磁谱仪的使用900MHz 800MHz2024/7/26样品的制备：样品的制备：试样浓度试样浓度：5-10%；需要纯样品15-30 mg； 傅立叶变换核磁共振波谱仪需
12、要纯样品1 mg ；标样浓度标样浓度（四甲基硅烷 TMS） ： 1%；溶剂溶剂：1H谱 四氯化碳，二硫化碳；氘代溶剂氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物；2024/7/26NMR图2024/7/261.化学位移化学位移: 吸收峰所在的相对不同位置吸收峰所在的相对不同位置. . 在照射频率确定时，在照射频率确定时，都是都是H H核核，所以吸收峰的位置，所以吸收峰的位置应该是相同的应该是相同的, ,而实际不是这样而实际不是这样. .(1).(1).化学位移的由来化学位移的由来 屏蔽效应屏蔽效应 化学位移是由核外电子的屏蔽效应引起的。化学位移是由核外电子的屏蔽效应引起的。 2024/7/26
13、 H核核在在分分子子中中是是被被价价电电子子所所包包围围的的。因因此此，在在外外加加磁磁场场的的同同时时，还还有有核核外外电电子子绕绕核核旋旋转转产产生生感感应应磁磁场场H。如如果果感感应应磁磁场场与与外外加加磁磁场场方方向向相相反反，则则H核核的的实实际际感感受受到的磁场强度为：到的磁场强度为： 式中：式中：为屏蔽常数为屏蔽常数 核外电子对核外电子对H核产生的这种作用，称为核产生的这种作用，称为屏蔽效应屏蔽效应( (如如果产生磁场与外加磁场同向果产生磁场与外加磁场同向, ,称之为称之为去屏蔽效应去屏蔽效应) )。 2024/7/26 显然，核外电子云密度越大，屏蔽效应越强，要发显然，核外电子
14、云密度越大，屏蔽效应越强，要发生共振吸收就势必增加外加磁场强度，共振信号将移向生共振吸收就势必增加外加磁场强度，共振信号将移向高场区；，共振信号将移向低场区。高场区；，共振信号将移向低场区。2024/7/26(2).(2). 化学位移的表示方法化学位移的表示方法 化学位移的差别约为百万分之十，精确测量十分化学位移的差别约为百万分之十，精确测量十分困难，现采用相对数值。以困难，现采用相对数值。以四甲基硅（四甲基硅（TMS）为标准为标准物质，规定：它的化学位移为零，然后，根据其它吸物质，规定：它的化学位移为零，然后，根据其它吸收峰与零点的相对距离来确定它们的化学位移值。收峰与零点的相对距离来确定它
15、们的化学位移值。仪器频率仪器频率2024/7/26为什么选用为什么选用TMS(四甲基硅烷四甲基硅烷)作为作为标准物质标准物质? ( (1) )屏蔽效应强，共振信号在高场区屏蔽效应强，共振信号在高场区(值规定为值规定为 0) )，绝大多数吸收峰均出现在它的左边。，绝大多数吸收峰均出现在它的左边。 ( (2) )结构对称，是一个单峰。结构对称，是一个单峰。 ( (3) )容易回收容易回收( (b.p低低) )，与样品不反应、不缔合。，与样品不反应、不缔合。 2024/7/26(3).(3).影响化学位移影响化学位移(电子云密度电子云密度)的因素的因素: a.电负性电负性: 元素的元素的电负性电负性
16、，通过诱导效应，使，通过诱导效应，使H核的核的核外电子核外电子云密度云密度，屏蔽效应，屏蔽效应，共振信号共振信号低场。低场。例如：例如： C CH Ha aH Hb b高高 场场低低 场场屏屏 蔽蔽 效效 应应 ：H Ha aH Hb bO O2024/7/26b b磁各向异性效应：磁各向异性效应： A.双键碳上的质子双键碳上的质子 双键碳上的双键碳上的质子质子位于位于键环流电子产生的键环流电子产生的感生磁场与感生磁场与外加磁场方向一致的区域外加磁场方向一致的区域（称为去屏蔽区），（称为去屏蔽区），去屏蔽效应去屏蔽效应的结果，使双键碳上的的结果，使双键碳上的质子质子的的共振信号移共振信号移向稍
17、低的磁场区向稍低的磁场区 =9.410 = 4.55.7 2024/7/26c.c.共轭效应共轭效应 : :电子云密度增加电子云密度增加磁屏蔽增加磁屏蔽增加d.Van der waals d.Van der waals 效应效应 : :在空间中两个氢核靠在空间中两个氢核靠 的很近时的很近时, ,核外电子会互相排斥核外电子会互相排斥, ,这时氢核电这时氢核电 子密度下降子密度下降, , 值变大值变大. .2024/7/26第六节 核磁共振碳谱(13C)简介v有机化合物中C元素的重要性；v核磁共振碳谱与氢谱的差别信号强度低： v13C丰度为1.1；磁旋比比1H小四倍；v为1H谱图的1/6000。化
18、学位移范围宽v0250(350)，有利于结构分析。耦合常数大v13C与直接相连的1H的耦合常数在125250Hz；v一般通过质子噪声去耦，得到单峰。2024/7/26弛豫时间长v比1H慢；v可得到较多信息；v不能用于定量共振方法多、信息多v质子噪声去耦、偏共振去耦、门控去耦。谱图简单v一般为一级谱图。2024/7/262024/7/262024/7/26第七节 二维核磁共振谱v二维谱是两个独立频率变量的信号函数S(1,2);v目前，主要是先得到以独立时间为变量的信号函数S(t1,t2)，再经过傅立叶转换成为两个独立频率变量的信号函数。2024/7/26二维谱图的表示方法2024/7/26二维谱
19、图举例12024/7/26谱图举例22024/7/26生物大分子空间结构的生物大分子空间结构的测定方法测定方法X射线晶体学多维核磁共振波谱学2024/7/262024/7/26核磁共振的特点核磁共振的特点蛋白质处于溶液状态蛋白质处于溶液状态适合研究蛋白质适合研究蛋白质-蛋白质，蛋白质，蛋白质蛋白质-核酸，蛋白质核酸，蛋白质-配基相互作用配基相互作用可研究蛋白质分子内部运动可研究蛋白质分子内部运动可研究膜蛋白可研究膜蛋白核磁共振基本原理 11讲吴季辉2024/7/26NMR structure of the recombinant murine prion protein核磁共振基本原理 11讲
20、吴季辉2024/7/26核磁技术和应用范围2024/7/26蛋白质三维空间结构测定蛋白质三维空间结构测定v样品制备v记录核磁共振谱v谱峰归属v确定二级结构单元v约束条件的建立v从NMR数据到分子模型核磁共振基本原理 11讲吴季辉2024/7/26药物设计和筛选药物设计和筛选2024/7/262024/7/26hr-MAS of biological tissue相同强度相同强度LipidCH2-COLipidCH2-C=CLipidCH2-CH2-COLipidCH2LipidCH3CitrateLactateAlanine放大放大人前列腺组织（prostate tissu）良性良性 vs. 恶性恶性癌症组织给出更多的脂类癌症组织给出更多的脂类物含量（物含量（lipid ）！）！2024/7/26用用NMR连续监测蛋白质复性过程连续监测蛋白质复性过程vStopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from 5.5 to 2.75 M urea at 5 C in the presence of 3.8 mM NADP+2024/7/26
