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1、DNA和RNA提取原理和方法第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策DNA提取的几种方法提取的几种方法q非基因组非基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原
2、理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂）是可溶的，通过有机溶剂抽提
3、，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加）使用前加入入T
4、ris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白 ）。）。CTAB溶解细胞膜，溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法褐变褐变qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tri
5、s-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（聚乙烯吡咯烷酮）lPVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上
6、常以按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的值表示，不同的K值分别代表相应的值分别代表相应的PVP平均分平均分子量范围。子量范围。K值实际上是与值实际上是与PVP水溶液的相对粘度水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用物理量，因此可以用K值来表征值来表征PVP的平均分子量。的平均分子量。通常通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。值越大，其粘度越大，粘接性越强。l l在研磨过程中加入在研磨过程中加入PVP，其中的，其中的CO-N=基有很强的基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机结合多酚
7、的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。会。l同时向抽提液中加入还原剂同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。后经抽提而去除。 qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解
8、细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。3.加入150ul
9、 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右q SDS SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例） 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材
10、料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用
11、利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性
12、，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解
13、干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液SDS碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA中溶液中溶液1的成分的成分及作用及作用 l溶液溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去 l溶液溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 l溶液溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 l这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PD
14、S（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀 质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢
15、复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的
16、物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法
17、简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要
18、反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝
19、或大质粒，则应加大菌体拷贝或大质粒，则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）严谨性质粒和松弛性质粒l按照复制性质，可以把质粒分为两类：l一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；l另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低
20、量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，
21、否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猕猴桃大提，猴桃大提，10000转转20min）针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过
22、程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯
23、(1/2(1/2体积体积) )，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏
24、糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗
25、涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子1.1
26、.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）DNA提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打
27、断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于
28、缓冲液中，避免反复冻融反复冻融DNA提取常见问题提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策原原因因1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.
29、4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策原原因因猕猴桃猕猴桃DNA提取实例提取实例l1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 l2.65水浴一个小时 l3.氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 l等体积预冷的异丙醇 ，7
30、5%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。l用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 猕猴桃基因组猕猴桃基因组DNA第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介RNA提取的通用方法提取的通用方法q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚
31、法 原理：原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；性，核酸释放；释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分别位于整个体下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。 RNA提取的通用方法提取的通用方法q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步骤步骤: :材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异
32、硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的）：维持变性的细胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。RNA提取的通
33、用方法提取的通用方法影响影响RNA提取的因素提取的因素q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在存在TRIzolTRIzol或样品贮存液中，于或样品贮存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，液氮长期保存，7070短期保存短期保存影响影响RNA提取的因素提取的因素影响影响RNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的
34、处理方法：培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：酵母和细菌：一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量影响影响RNA提取的因素提取的因素q 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，在使用氯仿抽提纯化
35、时，一定要充分混匀，且动作快速；一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成造成 RNA RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA RNA 后续酶反后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。应的杂质，是目前较为理想的选择。影响影响RNA提取的因素提取的因素第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第
36、三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策RNA提取常见问题提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳RNA降解降解q 新鲜细胞或组织：新鲜细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组
37、织裂解不充分组织裂解不充分另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 ( (如如脾脾脏脏，胸胸腺腺等等) )，很很难避免难避免 RNA RNA 的降解。的降解。 建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组织织碾碾碎碎，并并且且匀匀浆浆时时使使用用更更多裂解液多裂解液。RNA降解降解q 冷冻样品：冷冻样品：样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中速速冻冻，然然后后可可以以移移至至-70-70冰箱保存。样品要相对小一点；冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化，研研磨磨用用具
38、具必必须须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。预冷，碾磨过程中及时补充液氮。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 蛋白质污染：蛋白质污染：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法解决办法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：苯酚残留：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层的离心力
39、和时间要足够。层的离心力和时间要足够。解决办法解决办法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。ODOD260260 /OD /OD280280 比值偏低比值偏低q 抽提试剂残留：抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 RNARNA，并且彻底去掉，并且彻底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。解决办法解决办法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：设备限制：测测定定OD260 OD260 及及OD280 OD280 数数值值时时，要要使使OD260 OD260 读读数数在在 0.10 0.10 - - 0.50 0.50 之间。此范围线性最好
40、。之间。此范围线性最好。q 用水稀释样品：用水稀释样品：测测 OD OD 时时，对对照照及及样样品品稀稀释释液液请请使使用用 10 10 mM mM TrisTris，pH pH 7.57.5。用用水作为稀释液将导致比值的降低。水作为稀释液将导致比值的降低。 电泳带型异常电泳带型异常q 非变性电泳：非变性电泳：上样量超过上样量超过3ug，电压超过，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，电泳缓冲液陈旧，均可能导致均可能导致28S和和18S条带分不开。条带分不开。q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡： EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳
41、比非变性电泳要淡一些；变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高甲醛的质量不高 。下游实验效果不佳下游实验效果不佳q RNA RNA 降解降解 q 抽提试剂的残留抽提试剂的残留 75% 75% 乙醇洗涤乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀多糖等杂质，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题一：问题一：少量或没有少量或没有RT-PCR产物产物RNARNA降解降解分离无污染，高质量的分离无
42、污染，高质量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNARNA量太低量太低增加增加RNARNA的量的量 多糖同多糖同RNARNA共沉淀共沉淀用氯化锂沉淀用氯化锂沉淀RNARNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNAcDNA第一链合成的引物第一链合成的引物退火失败退火失败确定退火温度适合所用的引物确定退火温度适合所用的引物RNARNA模板存在较多二级结构模板存在较多二级结构将将RNARNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变
43、性/ /退火，退火，提高逆转录反应温度提高逆转录反应温度反转录成功，反转录成功，PCRPCR失败失败PCRPCR步骤中使用超过步骤中使用超过1/51/5的逆转录反应产物的逆转录反应产物可能原因可能原因解决方案解决方案RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题二：问题二：有非特异性带有非特异性带q 引物和模板的非特异性退火引物和模板的非特异性退火 q 基因特异性引物设计较差基因特异性引物设计较差qRNA中有基因组中有基因组DNA的污染的污染q 形成引物二聚体形成引物二聚体q 镁离子浓度太高镁离子浓度太高提高反应的温度和特异性提高反应的温度和特异性提高引物的特异性提高引物的特异性使用
44、扩增级使用扩增级DNaseDNase处理处理RNA RNA 设计在设计在33端没有互补序列的引物端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度优化镁离子浓度可能原因可能原因解决方案解决方案RTRT常见问题分析和解决方案常见问题分析和解决方案问题三：问题三：产生弥散（产生弥散（smear）条带）条带 q 第一链产物的含量过高第一链产物的含量过高q PCRPCR反应中引物过多反应中引物过多q 循环数过多循环数过多q 退火温度过低退火温度过低q 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增寡核苷酸片段产生的非特异性扩增常规常规PCR步骤中减少第一链产物的量步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少引物的用量 减少减少PCR
45、PCR的循环次数的循环次数 提高退火温度提高退火温度提取高质量提取高质量RNARNA，防止被，防止被DNADNA污染污染可能原因可能原因解决方案解决方案谢谢！谢谢！北京天为时代科技有限公司北京天为时代科技有限公司http/www.tw-http/www.tw- 本公司产品江苏地区特约代理商本公司产品江苏地区特约代理商南京天为生物科技有限公司南京天为生物科技有限公司联系电话：联系电话：025-86073713 84705301 84701501025-86073713 84705301 847015012424小小时订货热线：1305758517713057585177联系人：王彤联系人：王彤免费技术支持：免费技术支持：8008102177
