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1、细胞生物学基础实验细胞生物学基础实验米非司酮对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响米非司酮对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动物细胞融合（五）植物组织培养实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动物细胞融合（五）植物组织培养（一）石蜡切片的制备实验目的实验原理实验用品实验步骤实验结果实验目的1.熟悉动物石蜡切片的制作过程。2.掌握HE染色的基本原理和染色方法。3.掌握番红-固绿对染法的基本原理和具体方法。动物实验原理石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木
2、素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。植物实验原理石蜡切片法也是在研究动植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成连续薄片，切片经染色，观察效果甚好。番红-固绿对染法，为植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色；固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的
3、细胞壁染成绿色。实验用品1.器材：切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。2.药品：卡诺氏固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿3.材料：鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织，大豆的根、茎、叶实验步骤取材固定洗涤脱水透明浸蜡包埋切片粘片脱蜡染色脱水透明封片实验步骤（HE染色）1.取材：颈椎脱臼法处死小鼠，
4、打开腹腔，剪取肝组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm5mm2mm或10mm10mm2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块23mm厚。注意事项：取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化(搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构)。切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。实验步骤（HE染色）2.固定：将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定3050min。注意事项：一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变
5、化，失去固定作用。有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的2030倍，有些水分多的材料，中间应更换12次新液。材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。实验步骤（HE染色）3.洗涤：材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定
6、液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%70%乙醇冲洗。实验步骤（HE染色）4.脱水：30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。注意事项：脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。在高浓度或纯酒精
7、中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。如需过夜，应停留在70%酒精中。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象脱水、透明、染色都在染色缸内进行实验步骤（HE染色）5.透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。注意事项：使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。在透明
8、过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。实验步骤（HE染色）6.透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡、石蜡透蜡各2030分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在5560左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。注意事项：尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。石蜡、蜡
9、杯、蜡杯钳实验步骤（HE染色）7.包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。用于包埋的石蜡的熔点在5060之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为5256，植物材料用的石蜡熔点为5458。操作过程：包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中
10、包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。实验步骤（HE染色）8.修蜡和切片：切片之前要把包埋好的蜡快修成梯形，然后将已修好的石蜡固定在台木上装在切片机的夹物台上。将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为410微米。一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以4050r/min。切成的蜡带到2030cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡
11、带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。切片机实验步骤（HE染色）9.贴片：取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。滴12滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在404
12、5）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。实验步骤（HE染色）10.脱蜡复水：石蜡切片经二甲苯、脱蜡各510min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各35min，再放入蒸馏水中3min。染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。实验步骤（HE染色）11.染色：切片放入苏木精中染色约1030min。染色时间
13、应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。实验步骤（HE染色）12.水洗： 用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。 实验步骤（HE染色）13.分化： 就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤
14、是H.E.染色成败的关键，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。实验步骤（HE染色）14.漂洗：切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。15.脱水：切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各35min。16.复染：用0.5%伊红乙醇液对比染色25min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着
15、色，并且经乙醇脱水时不易褪色。实验步骤（HE染色）17.脱水：放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中35min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。18.透明：切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯、中各35min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。实验步骤（HE染色）19.封藏：中性树胶封存切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂
16、如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。封藏的方法：封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，
17、可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。学生实验结果：小鼠脾脏纵切永久切片学生实验结果：小鼠肾脏横切永久切片实验步骤（番红固绿）1.取材：取已培养好的大豆的根或茎、叶等用刀片将其尖端约1.2cm根尖切割下来，用刀片切割其成熟区部分成5mm长的小段（亦可切带侧根的部分），将切好的材料放入玻管中。2.固定：将卡诺固定液倒入盛有材料的玻管中，固定时间为24h3.冲洗：用70%酒精换洗3次，每次0.5-2h。4.脱水：80%、90%酒精各1-2h，纯酒精（中间换一次）1-2h。5.透明：等量纯酒精及二甲苯中1-2h，二甲苯（中间换一次）1-2h。实验步骤（番红固绿）6.透蜡：方法同HE染
18、色。7.包埋：方法同HE染色。8.切片：方法同HE染色。9.贴片：方法同HE染色。实验步骤（番红固绿）10.染色：a.切片在二甲苯中脱蜡，约10min。b.等量纯酒精二甲苯5min。c.经纯酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。d.蒸馏水2-5min。e.1%番红水溶液染色2h左右。f.用水洗去多余染液。g.50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。h.1%的固绿（用95%酒精配制）染色10-40s。i.95%酒精洗一下。j.纯酒精脱水5min。k.等量纯酒精二甲苯混合液中5min。l.二甲苯5min。实验步骤（番红固绿）注意：番红与固绿在
19、酒精中很容易脱色，因此在酒精中脱水时，不能放置太久。用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适，所染颜色应稍深一些，以防其在以后脱水步骤中仍会脱色，如果太浅，应退回重染。11.中性树胶封藏：方法同HE染色。学生实验结果：蚕豆根纵切永久切片实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动物细胞融合（五）植物组织培养（二）PAS反应实验目的实验原理PAS反应原理示意图实验用品实验步骤实验结果注意事项实验目的1观察细胞内糖类的分布。2掌握糖类的染色方法。实验原理组织内的多糖、粘多糖及粘蛋白等都用PAS法来显示。其化学基础是利用过碘酸的氧化作用。过碘酸是一种强氧化剂，能破坏各种结
20、构内的C-C键，若有1，2乙-二醇基（CHOH-CHOH）存在，可变为二醛（CHO-CHO），然后与Schiff试剂反应，与Schiff试剂生成紫红色反应物。过碘酸较常用的氧化C-C键的试剂（KmnO4、H2CRO4、H2O2等）灵敏而优越，不再氧化所产生的醛基，与Schiff试剂生成紫色反应物以此得到定位。PAS反应原理示意图实验用品1.器材显微镜，染色缸，盖玻片。2.试剂1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，纯酒精，95酒精，二甲苯。Schiff试剂的配制：蒸馏水100ml煮沸后取下，立即放入碱性品红使之溶。冷却至50摄氏度时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸纳（或钾）（或亚硫酸氢
21、盐）及1mol/LHCl20ml。避光放置1824小时（室温）。溶液变为草黄色。然后加入300mg活性炭，用力摇动1分钟，过滤。过滤后即得无色品红。此液配就后，封严瓶塞，外包黑纸，贮于4摄氏度冰箱备用，用前升至室温。3.材料兔或鼠的肝、肾、心肌、脾、马铃薯。实验步骤(动物)1取12mm厚的肝、肾、心肌、骨胳肌或其它组织块，一般用Carnoy固定液固定较好，放冰箱24h。用无水乙醇饱和的苦味酸和甲醛混合液固定糖原较好；如只为显示粘蛋白等多糖类，可用秦克-甲醛固定液。2经乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。3切片脱蜡到水。（1）切片在二甲苯中脱腊，约10分钟。（2）等量无水乙醇二甲苯5分钟。（3）经无
22、水乙醇，95，90，80，70，50，30各级乙醇各5分钟。（4）蒸馏水25分钟。实验步骤(动物)40.5%1%过碘酸水溶液浸泡25min（不能过长）。5蒸馏水洗。6Schiff试剂浸泡15min。7亚硫酸盐溶液浸泡三次，共6min（或0.5%Na2S2O53次，共6min）8自来水冲洗5min。9蒸馏水浸泡1min。10苏木精复染胞核（约510分钟）。11流水洗5min。实验步骤(动物)12蒸馏水，吸干。13从95%酒精开始脱水（95酒精浸泡12分钟，无水乙醇浸泡两次，每次35分钟）。14二甲苯透明（二甲苯和无水酒精等量混合液5分钟，二甲苯5分钟两次）。15中性树胶封藏。对照片的制作1切片脱
23、蜡复水，用唾液处理，每30min换一次，共两次，室温。2流水洗5-10min，蒸馏水洗。3PAS反应。实验结果含糖蛋白呈不同程度的紫红色，糖原着色深。对照片中呈阴性反应的，PAS片中深染的块粒为糖原。实验结果：小鼠肝脏PAS反应的反应的应用1证明与鉴别细胞内空泡变性，是脂肪变性还是糖原的脱失。2心肌病变与其它心血管疾病的诊断与研究。3糖尿病在肝脏、肾脏内均有大量糖原沉积。4某些肿瘤的鉴别诊断，如肝细胞癌糖原反应阳性。实验步骤(植物).取马铃薯，使用徒手切片技术切一薄片置于载玻片上滴一滴0.5%1%过碘酸水溶液浸泡min（不能过长）。70%乙醇或蒸馏水洗。Schiff试剂浸泡min（避光)。亚硫
24、酸盐溶液浸泡三次，共6min（或0.5%偏重亚硫酸钠溶液3次，共6min）染色结束，蒸馏水洗去染料（注意不要冲掉马铃薯片），盖上盖玻片，显微镜下观察。实验结果:在显微镜下观察到马铃薯细胞中的糖颗粒被染成粉红色实验结果：马铃薯实验组实验结果：马铃薯对照组注意事项1.染色的深度取决于过碘酸处理的时间，切片在过碘酸水溶液中不能放太长时间。2.PAS反应后，因过碘酸氧化加速苏木精的染色，染色时间可减少一半，常用苏木精稀染液复染。实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动物细胞融合（五）植物组织培养（三）核酸的细胞化学Feulgen反应实验目的1.学习DNA的Feulge
25、n染色方法,了解反应原理2.了解细胞中DNA的分布3.观察染色结果，并进行分析实验原理Feulgen反应的机理：利用1NHCl、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。实验用品1.器材：水浴锅，染色缸，盖玻片，显微镜2.试剂：卡诺固定液，1mol/L盐酸溶液，Schiff试剂，1亮绿，酒精，二甲苯3.材料：做好的小鼠肝脏的石蜡切片实验步骤1.制作石蜡切片具体步骤见石蜡切片的实验2.染色a
26、.切片脱蜡至蒸馏水切片脱蜡至蒸馏水；b.1mol/L盐酸溶液（室温）1min；c.1mol/L盐酸溶液（60）1min；d.1mol/L盐酸溶液（室温）1min；实验步骤2染色e.蒸馏水稍洗；f.放入Schiff试剂，室温1h左右；g.亚硫酸盐溶液洗3次，总时间6min；h.流水洗5min；i.蒸馏水洗片刻；j.经70、80、90、95酒精脱水2-3min；实验步骤k.如需要对染，可用1的亮绿酒精溶液对染数秒钟（注意切勿染的过深）；l.95酒精浸泡1min；m.无水酒精浸泡两次，每次3-5min；n.纯酒精与二甲苯等量混合液5min；o.二甲苯、各5min；p.中性树胶封藏实验结果由于DNA主
27、要分布在细胞核，所以经Schiff试剂反应着色后，细胞核呈紫红色。细胞质和核仁被亮绿复染成浅绿色；实验结果注意事项1.稀酸水解的时间Feulgen反应的一个关键步骤是稀酸水解的DNA，使其释放出游离的醛残基，水解时间一定要适宜，如果水解时间不够，嘌呤碱脱落不下来，反应就变弱；反之，如水解时间过长，则可能使DNA和组蛋白过度降解，使反应变弱，甚至呈阴性反应。2.Schiff试剂的质量Schiff试剂的质量好坏直接影响着DNA的呈色反应，所以应选用质量好的碱性品红来配制Schiff试剂，并注意避光保存，防止氧化变红失效。一些试剂的配制方法1.1mol/L盐酸浓盐酸8.5ml和91.5ml蒸馏水混合
28、；2.亚硫酸氢盐溶液10偏重亚硫酸钾（钠）5ml，1mol/L盐酸5ml，加蒸馏水90ml；3.Schiff试剂蒸馏水100ml煮沸后取下，立即加入碱性品红1g使之溶解。冷却至50时用滤纸过滤。加偏重亚硫酸钠（钾）（或亚硫酸氢盐）2g及1mol/LHCl20ml。避光放置18-24h（室温）。溶解为草黄色。然后加入300mg活性炭，用力摇动1min，过滤。过滤后即得无色品红。此液配好后，封严瓶塞，贮存于4冰箱中备用，用前升至室温，在染色缸外亦用黑纸包起来，以避免氧化变成红色，如变成红色即失去了染色能力。固定的方法OsO4固定液Camary氏固定液乙醇-甲醛固定液100%甲醛固定液Bouin-A
29、ller固定液Bouin固定液Schiff试剂碱性品红碱性品红:三三氨基三苯基氨基三苯基甲烷氯化物甲烷氯化物(桃红色)偏亚硫酸钠偏亚硫酸钠盐酸盐酸H2SO3副品红碱副品红碱:N-亚磺亚磺酸亚硫酸酸亚硫酸(无色透无色透明明)醛基醌型结构醌型结构(紫红色紫红色)思考题1.如何制作Feulgen反应的对照片,要求写清实验原理,步骤及结论.2.不利用做好的石蜡切片是否能够观察到细胞内的DNA？利用何种材料观察？设计实验题目设计实验观察植物在极端环境条件下细胞形态及内含物的变化设计实验观察动物在极端环境条件下细胞形态及内含物的变化实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动
30、物细胞融合（五）植物组织培养（四）细胞融合实验目的1.了解并掌握细胞融合的方法2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用继“多莉羊”之后：1998年日本获得两头体细胞克隆牛继“多莉羊”之后：中国第一头克隆猪2005年8月5日问世继“多莉羊”之后：188次实验，世界第一只宠物猫克隆成功 继“多莉羊”之后：继“多莉羊”之后：植物原生质体融合植物原生质体融合 创造新型物种创造新型物种番茄薯 Potato + tomato Pomato 德国 Melchers 年德国和美国的科学家先后将番茄和马铃薯的体细胞融合在一起，并获得了杂种植株。被
31、人们称之为“番茄薯”或“薯番茄”。年，美国的科学家获得的“马铃薯番茄”在性状上基本上像马铃薯，但却带有番茄抗枯萎病的特性。橙+ + 橘橘柚柚+ + 细胞融合技术的发展原生质体融合细胞的再生愈 利用细胞融合技术观察蛋白质运动实验原理 两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分
32、钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、
33、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。电融合所用的细胞融合仪实验用品1.实验材料：成年公鸡2.实验器材：离心机，EP管，微量取样器，吸管，水浴锅，载玻片，盖玻片，显微镜3.Alsever溶液、GKN溶液、0.85生理盐水、50PEG溶液，双蒸水鸡血细胞收集鸡血细胞悬液制备PEG诱导细胞融合鸡血细胞收集终止PEG反应细胞悬液制备染色镜检实实 验验 流流 程程实验步骤1.在公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的Alsever液中，使血液与Alsever液的的比例达14，
34、混匀后可在冰箱中存放一周；2.取此储存鸡血0.2ml加入0.8ml的0.85生理盐水，充分混匀，1000r/min离心5min，弃去上清，加入1ml的0.85生理盐水，重复上述条件离心两次。最后弃去上清，加GKN液1ml，离心；3.弃去上清，加入1ml的GKN溶液，制成细胞悬液；（也可以用血球计数板计数，用GKN液将其调整为106个/ml）；实验步骤4.取以上细胞悬液0.1ml放入1ml的EP管中，然后再加入0.1ml的GKN液，放入37水浴中预热，同时将50PEG液一并预热20min；5.20min后将0.2ml的50PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入3
35、7水浴中保温20min；6.20min后，加入GKN溶液1ml，静止于水浴中20min左右；7.1000r/min离心5min，弃去上清，加GKN溶液再离心1次；8.弃去上清，加入GKN液少许，混匀，取少量悬浮于载玻片上，加入詹纳斯绿染液，用牙签混匀，3min盖上盖玻片，观察细胞融合情况。瞧，我们三个融合了瞧，我们三个融合了融合过程融合过程相关实验溶液的配制Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl0.42g，溶于100ml双蒸水中。GKN溶液：NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO42H2O1.77g，NaH2PO4H2O0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶
36、于1000ml水中。50PEG溶液：称取一定量的PEG（WM4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50时，加入等体积预热至50的GKN溶液，混匀，置37备用。实验内容（一）石蜡切片制作（二）PAS反应（三）Feulgen反应（四）动物细胞融合（五）植物组织培养（五）植物组织培养Planttissueculture实验目的1.熟悉植物组织培养技术2.了解培养基的配置及原理3.掌握无菌操作的原理及过程实验原理植物的组织和细胞培养是基于高等植物细胞具有全能性，在高等植物细胞分化过程中，他们的遗传潜力并没有丧失，仍保持着潜在的全能性。已分化成熟的活细胞在一定的营养因素的作用下，有可能回复
37、遗传全能性，类似合子的发育功能，有单细胞发育成为胚状体，继而形成完整的植株。实验步骤培养基配制培养基配制培养基灭菌培养基灭菌材料消毒材料消毒接种接种培养观察培养观察愈伤组织分化愈伤组织分化愈伤组织培养基诱导愈伤组织培养基诱导实验培养基实验培养基实验步骤1.MS培养基母液的配制成分成分母液母液MS培养基培养基大量元素大量元素NH4NO3KNO3CaCl2H2OKH2PO4MgSO47H2Omg/L(100)165000190000440001700037000mg/L16501900440170370微量元素微量元素mg/L(100)mg/LMnSO44H2OZnSO44H2OH3BO3KINa
38、2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O223086062083252.52.522.38.66.20.830.250.0250.025实验步骤铁盐Na2EDTAFeSO47H2Omg/L(100)37252785mg/L37.2527.85有机物有机物质甘氨酸硫铵素烟酸盐酸吡哆醇肌醇mg/L(100)20040505010000mg/L2.00.40.50.5100实验步骤实验步骤2.MS固体培养基的配制取1000ml烧杯，分别取各种成分的母液100ml，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂6.5g，按照需要的浓度分别加入激素，加水至800ml。加热使琼脂溶解，定容至1000ml，用
39、10NaOH调节pH至5.8和6.0。加入激素:2,4-D0.1mg/L实验步骤3.培养基的灭菌将配好的培养基迅速分装至50ml三角瓶中，用棉花塞好，用牛皮纸或报纸包扎。放入灭菌锅121，灭菌20min。实验步骤4.材料的脱毒 选取胡萝卜含形成层的部分,横切厚度约为2cm。用水洗净，用70酒精浸泡15-30s，然后放入5-7的次氯酸钠溶液浸泡20min，进行材料脱毒，然后用无菌水冲洗多次。实验步骤5.接种(1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的滤纸上。(2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。胡萝卜切成1c
40、m见方的小块(含形成层)；在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。(3)用灼烧消毒过的器械将切割好的胡萝卜放置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸，将三角瓶几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使瓶口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取一块切好的材料送入瓶内，轻轻帖到培养基,以放13块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。实验步骤 6.培养 本实验将已接种好的培养瓶,在最适条件下培养 ,采取暗培养、25温度的条件 ，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 实验结果【资料注意事项1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死；5、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。
