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1、肿瘤基因及其调控机制肿瘤基因及其调控机制第一节第一节 癌基因癌基因一、癌基因的基本概念一、癌基因的基本概念 逆转录病毒的研究对于阐明人类癌症的发生机理具有重要意义。逆转录病毒的基因组中除了病毒本身复制所必需的基因,如编码病毒核心蛋白(gag)、外壳糖蛋白(env)及逆转录酶(pol)等的基因外,还包括一个能引起细胞恶性转化的基因。这种基因就是现在为人们 所熟知的癌基因(oncogene,onc)。 由于最初是在病毒中发现的,所以称之为病毒癌基因(v-onc)。后来发现,在许多动物的正常细胞中都存在着与 v-onc 相对应的DNA序列,称之为原癌基因(protooncogene)或细胞癌基因(c
2、-onc) 现有资料表明: 细胞癌基因与病毒癌基因基本上是同源的,但用DNA测序技术可查明,在二者之间可以有一个或几个碱基对的差别。所以现在认为,细胞癌基因是病毒癌基因的前体,而病毒癌基因则是细胞癌基因的转导翻版; 细胞癌基因在长期进化过程中极为保守,在无脊椎动物(如果蝇)的基因组中就可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的序列。所以实际上在正常情况下,细胞癌基因不仅对机体无害,而且可能在发育过程中,以至于对生命的维持起着重大的作用: 细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达,而在癌组织中与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高的多。二、癌基因的分类二、癌基因的分类 较早期的分类是根据癌基因的
3、产物在细胞内的定位,将其区分为胞质癌基因和核癌基因两大类。随着癌基因数量的增加,这一分类显得不够完善。近年来,人们趋向于用癌基因蛋白的结构与功能及其在细胞内的定位来进行分类。 按照这一原则癌基因可分为五大类: 生长因子类生长因子类 酪氨酸激酶类酪氨酸激酶类 丝氨酸苏氨酸激酶类丝氨酸苏氨酸激酶类 GTP结合蛋白(结合蛋白( G蛋白)类蛋白)类 核结合蛋白类核结合蛋白类 Demezuk (1991)对癌基因作了全面的综述,列出了87种癌基因,并进行了分类。鉴于近年来又有一些新的癌基因和抑癌基因出现,对此作了一些增补。现以其资料为基础,对五举癌基因分别介绍如下: 1. 生长因子类:生长因子类: 属于
4、这异类的有sis,int-2等五个癌基因。 特点是其产物与某些生长因子极为相似:例如,猴肉瘤病毒v-sis癌基因的蛋白产物p28与血小板生长因子(PDGF)链几乎完全相同。因此sis蛋白可模拟PDGF同其受体结合,刺激细胞过度增殖。 受病毒感染的细胞可向周围分泌生长因子,后者又反过来向分泌它的细胞连续发放增殖信号,最终导致细胞癌变。这种癌变过程中的独特现象称为“自分泌”(autocrine)。 小鼠乳腺瘤病毒(MMLV)的int-2癌基因产物gp27-34类似于成纤维细胞生长因子(FGF),其过度表达可诱发小鼠乳腺新月形癌。2.酪氨酸激酶类:酪氨酸激酶类: 属于这一类的癌基因较多,现在较明确的
5、有21 种。根据其功能的差别,还可分成两个亚类: 细胞表面生长因子受体细胞表面生长因子受体 膜结合的酪氨酸激酶膜结合的酪氨酸激酶 细胞表面生长因子受体:细胞表面生长因子受体: 包括erbB-l,erbB-2/HER/neu等7个癌基因。 禽成红细胞瘤(AEV)病毒癌基因erbB-l的蛋白产物pl70与上皮细胞生长因子受体(EGFR)的氨基酸序列高度同源。因此,它可模拟EGFR进行工作。即使在没有外源性刺激时,也能不断地使胞内靶蛋白发生酪氨酸激酶反应,从而连续地向细胞核发放增殖信号,导致细胞过度增殖。 ErbB-2的蛋白产物pl85也与EGFR类似。 猫肉瘤病毒癌基因fims的蛋白产物gp105
6、165 则与集落刺激因子(CSF-l)受体相似。 膜结合的酪氨酸激酶:膜结合的酪氨酸激酶: 包括src-l,abl等14个癌基因。 Rous肉瘤病毒(RSV)癌基因src-l的蛋白产物 pp60是第一个被人们分离,并研究得最多的癌蛋白,分子量为 60 kD,长 526个氨基酸残基,分布在质膜内侧。pp60是专一地使蛋白质分于中的酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶,称为酪氨酸专一性蛋白激酶(用P-tyr表示)。 在正常细胞中,P-tyr仅占总蛋白磷酸化的13000(其余由丝氨酸专一性蛋白激酶磷酸化,占90,还有10由苏氨酸专一性蛋白激酶磷酸化),而在被RSV转化的细胞中,P-tyr升高了 10倍。本
7、亚类中其他癌基因的产物也具有 P-tyr活性。前述的 erbB- l等生长因于受体均具有P-tyr活性,因而推测本亚类癌基因也可能参与细胞生长的调控。 已知有一种含酪氨酸的粘着斑蛋白(vinculin)是 pp60 P-tyr蛋白激酶的底物之一。它位于质膜内侧的吸附斑中,而组成细胞骨架微丝结构的肌动蛋白束正好固定在吸附斑上。在正常细胞中,粘着斑蛋白的磷酸化仅占该蛋白磷酸化的1,而在转化的细胞中则上升至20 。同时发现在RSV转化细胞株中吸附斑大量减少,其肌动蛋白束的结构遭到严重破坏。 Pp60 P-tyr的另一种与细胞骨架有关的靶蛋白是p36,它结合在含有微管蛋白,肌动蛋白和肌球蛋白的细胞骨架
8、上,它的酪氨酸被 pp60 P-tyr磷酸化后也可导致细胞骨架破坏。 由此可见,RSV病毒转化的细胞中src癌基因的过度表达,是导致细胞骨架微丝、微管系统破坏的重要原因。 3.丝氨酸苏氨酸激酶类丝氨酸苏氨酸激酶类: 关于这类癌基因只列举了raf-1,mos和pim-1三种,它们的蛋白产物都是定位于胞质的丝氨酸苏氨酸专一蛋白激酶,与第二信使CAMP调节系统有密切关系。已知有一种CAMP依赖性蛋白激酶就是丝氨酸专一性蛋白激酶,具有传递CAMP的信号及调节基因表达的作用。 4 . GTP结合蛋白类结合蛋白类 此类包括ras族的H-ras,K-ras,N-ras三个癌基因,以及在垂体及卵巢肿瘤中发现的
9、gsp癌基因。 ras族癌基因是目前研究得最多的癌基因。从人体肿瘤分离到的活化癌基因都属于ras族,其基因产物p21ras蛋白的分子量约21kD,长188189个氨基酸残基,分布于质膜内侧。具有GTP依赖的GTPase活性,其一级结构和生化特性和“G蛋白”十分相似。 G蛋白是媒介多肽激素受体的信号与细胞内效应器腺苷环化酶之间的偶联因子,通过激活或抑制腺苷环化酶的活性直接或间接地调节cAMP的浓度,进而调控细胞的生长。 ras族原癌基因可能象G蛋白一样参加腺苷环化酶信号系统的调控。ras族癌基因在12,13或61位氨基酸残基的点突变将使 p21ras失去水解的活性,并使细胞过度增殖。 5.核蛋白
10、类:核蛋白类: 属于这一举的癌基因有myc,myb,fos等12个。 其中研究得最为详尽的是 c-myc。c-myc最早发现于禽粒细胞瘤病毒( AMV)中,并广泛分布于从酵母到人的基因组中。它含有 3个外显子,编码一种含439个氨基酸,分子量为62kD的蛋白质。该蛋白定位于细胞核内,属DNA结合蛋白,可同单链或双链DNA结合。 c-myc 的表达具有组织专一性,细胞周期特异性和发育阶段特异性。在正常组织中 c-myc 可有低水平表达,而在大多数实体肿瘤中,其表达明显增高。在癌前病变和一些良性肿瘤中,也可见到表达增高。一般认为, c-myc 的扩增是导致原癌基因活化的主要途径。 以上资料表明,c
11、-myc蛋白可能是一种调控细胞增值和分化的调控蛋白,它可以识别和结合到基因组中特定的识别序列,并活化那些与细胞增殖和分化有关的基因。 c-myb 也有类似性质,主要在造血细胞分化的某些特定阶段表达,而在一些造血系统肿瘤中其表达可增高。 近年来陆续发现了一些新的癌基因,它们在癌变过程中起着重要的作用: int-2 jun met PCNA Ki-67核抗原核抗原 mdm2 int-2 定位于 7q31,编码分子量为 27kD的蛋白,该蛋白的部分结构与成纤维细胞生长因子具有同源性。它具有刺激表皮细胞生长的作用,但需要与其他基因协同才能完成细胞的恶性转化。Int-2基因的扩增率在乳腺癌中达19,但扩
12、增的倍数不高。一般认为,该基因的高表达与肿瘤的转移,复发和预后不良有关。 jun 定位于lp3132,编码分子量39kD的蛋白。蛋白定位于核内。Jun与随后发现的junB,junD都是核转录因子,与c-fos形成转录调节复合物,其蛋白产物FOSJun能与其他反式因子如视甲醛受体(RAR)、糖皮质激素等相互竞争,对转录起调节作用。 met 定位于7p31,其转录产物有多种,分别为9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kb mRNA。蛋白产物主要有两种,分别为 ppl40-145met肝细胞生长因子受体和 pp65tpr-met活化融合蛋白。最初确定其为转化基因是在以MNNG处理的人骨肉瘤细胞系中
13、,由于l号染色体的tpr序列插入到7号染色体的 met基因形成tpr-met重排而使其活化。 其主要功能为促进肝细胞生长及诱发细胞转化。 c-met基因的活化与多种肿瘤的发生有关,其活化机理主要为扩增和重排。现已证明,9.0 kb c-met mRNA及其蛋白产物在胃癌和肝癌等肿瘤中的表达高出正常组织许多倍,而且表达程度与预后有关。 PCNA 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一种在细胞增殖周期中合成和表达的36kD蛋白质,主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在细胞核内聚集,因此进入细胞周期的正常细胞和肿瘤细胞都含有
14、PCNA。采用PCNA单抗定位研究PCNA,可以作为判断细胞增殖情况和预后的一种手段。 Ki-67核抗原核抗原 Ki-67存在于增殖细胞核内,在G1中期开始表达, S期和 G2期增多, M期达到高峰,G0期细胞阴性,因此Ki-67在调节细胞增殖中起重要作用。用免疫组化法证明,癌组织中阳性细胞数明显高于正常细胞和良性肿瘤,因此对鉴别良恶性病变有一定实际意义。Ki-67表达水平的高低与肿瘤预后之间也有密切关系。 mdm2 mdm2基因最初是从一个含有双微体( DM)的自发转化的 BALB3T3细胞系中克隆出来的一个高度扩增的基因,定位于12ql314上,该基因全长由2372个碱基对组成,编码区全长
15、1473个碱基,编码一个长度为491个氨基酸践基的蛋白质,分子量为90kD。 动物实验己证明,mdm2可使细胞转化并具有成瘤性。在某些恶性软组织肿瘤,骨和脑肿瘤中发现了mdm2扩增,说明其可能与这些肿瘤的发生有关。 mdm2癌基因不仅可通过扩增而直接致癌,而且可作用于抑癌基因p53使正常的p53失活而间接致癌。三三 、癌基因的活化机理、癌基因的活化机理 细胞癌基因存在于正常细胞中,但在正常情况下并不表现出致癌性,只有在各种外因和内因作用下使细胞癌基因活化,才能导致肿瘤发生,癌基因活化的机理可能多种多样的,但主要的有以下6种:1. 转导(转导( transduction) 2. 点突变(点突变(
16、point mutation) 3. 插入突变(插入突变(insertional mutation) 4. 易位易位(translocation) 5基因扩增(基因扩增( gene amplification) 6. 基因甲基化的改变基因甲基化的改变 1. 转导(转导( transduction) 在漫长的生物进化过程中,现在的逆转录病毒的祖先在感染正常细胞的同时,通过复杂的遗传学重组和突变,将正常细胞的细胞癌基因整合到其基因组中,并使之改变成活化的病毒癌基因。带有病毒癌基因的逆转录病毒在感染适当的动物时,可使之发生肿瘤。 2. 点突变(点突变(point mutation) 美国的 Wein
17、berg,Wigler和 Cooper等实验室于 1983 年分别从不同的膀胱癌细胞系中分离DNA,用以转染NIH3T3细胞系,可使之发生恶性转化。从转化细胞中已分离到活化癌基因的分子克隆,并证明其与Harvey鼠肉瘤病毒的癌基因 (v-Ha-ras)非常相似。 在人类正常细胞中也发现了其对应物(c-Ha-ras), Barbacid与Weinberg的研究组分别发现,膀胱癌中的活化癌基因与其对应的正常癌基因之间只有一个碱基对的差别,即(c-Ha-ras)基因的第一个外显子(exon)所编码的多肽链氨基端第 12位密码子上发生了有突变,其鸟瞟呤被胸腺嘧啶所取代,使其编码的甘氨酸被氨酸所取代。这
18、一单个碱基对的点突变,看来就是正常细胞癌基因变成活化癌基因的关键。 3. 插入突变(插入突变(insertional mutation) 逆转录病毒中的慢病毒本身不含有癌基因,但能以前病毒的形式插入到宿主细胞癌基因的邻近而将其激活。 在这方面最典型的例子是禽白血细胞增多症病毒(AW)。新生雏鸡在感染ALV后612月才产生肿瘤,在癌前期观察到法氏囊中大量细胞受到病毒感染,而且ALV的DNA插入到不同细胞基因组的不同位点。 但是,在肿瘤细胞中前病毒DNA却存在于所有细胞基因组的同一位点,说明它们是由ALV的DNA插入基因组适当位点的一个细胞所形成的克隆。在肿瘤细胞中ALV的DNA可发生部分缺失,但
19、至少项保存一部分。 Hayward等进一步证明,在大多数肿瘤中 ALV前病毒插入到细胞癌基因的5端,并处于相同的转录方向。 ALV前病毒的长末端序列( LTR)经常缺失或失活,所以可能其 3端 LTR为转录提供强有力的启动子,从而产生大量与前病毒DNA相连的c-myc序列。 在有些情况下,前病毒虽插入到c-myc的5端,但处于相反的转录方向,或插入到的3端而处于相同的转录方向。这两种情况也可加强cmvc的转录,但其作用机理尚不太清楚。 同时CooPer等发现,从这类肿瘤中提取的DNA可转化NIH3T3细胞,但奇怪的是,从中分离到的转化基因既不是ALV的DNA,也不是活化的c-myc,而是位于另
20、一位点的片段,称之为Blym,它编码一个分子量约为7kD的多肽。 由此可见,在诱发的肿瘤中至少涉及两个癌基因的活化。 4.易位易位(translocation) 在人类巴基特淋巴瘤的细胞系中,发现第8号染色体长臂远端片段易位至第2,22和14号染色体的一定部位。 现有资料证明,这些部位分别含有免疫球蛋白轻链Ig, Ig 和以及重链 IgH基因。由于这些部位经常进行着活跃的转录,可以提供强有力的启动子,而易位的第8号染色体片段已证明含有细胞癌基因c-myc,可以被相邻的启动子活化。 还有资料指出易位的c-myc的3端与免疫球蛋白基因的3端相连。这一情况类似于上述ALV前病毒的插入,即c-myc插
21、入到启动子的下游,但处于相反的转录方向。 5基因扩增(基因扩增( gene amplification) 在人的慢粒白血病细胞系( HL-60)中,发现了 c-myc的扩增,表现为双微体(dounle minutes, DMs)和均染区(Homogeneous staning region,HSR)的形成,可通过原位杂交法加以证实。 6. 基因甲基化的改变基因甲基化的改变 在肿瘤细胞中可发现癌基因和抑癌基因的甲基化改变,表现为癌基因的低甲基化或去甲基化,或抑癌基因的异常甲基化。有报道在胃癌细胞中发现了c-Ha-ras癌基因的低甲基化,而低甲基化可导致c-Ha-ras癌基因的过度表达。第二节第二
22、节 抑癌基因抑癌基因 抑癌基因 (antioncogene)过去常称之为肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)。关于抑癌基因存在的概念由来以久,人们最初从肿瘤细胞染色体特定部位的缺失推测它的存在。 细胞遗传学的发展在这方面提供了进一步的证据。当用正常细胞同肿瘤细胞杂交,或将某一条正常细胞染色体导人肿瘤细胞中时,观察到肿瘤细胞的恶性表型受到抑制,从而推测在正常细胞染色体上存在着抑癌基因。 但最终确定其存在,必须分离到抑癌基因,并对其结构与功能进行详细的分析。1986l987年国际上有3个实验室成功地分离到第一个抑癌基因Rb基因的cDNA克隆从而使抑癌基因研究进入了分子生物学时
23、代。 近年来又陆续发现了一些新的抑癌基因。目前对抑癌基因尚无明确分类,但近年来由于抑癌基因数量的增多,而其中一些基因在功能上与传统的抑癌基因有很大的不同,为便于了解起见,现将其分成两大类: 表现为丧失功能的抑癌基因(传统的抑癌基因) Rb基因基因 FAP 相关的抑癌基因相关的抑癌基因 p53基因基因 p21Cipl基因基因 p73基因基因 p27Kipl NF1基因基因 FHIT基因基因 WT1基因基因 PTEN ErbA基因基因 Kreyl基因基因 DPC4基因基因 INK4基因基因 参与DNA修复抑癌基因(新发现的抑癌基因) 错配修复基因错配修复基因 BRCA1基因基因 ATM基因基因 一
24、一 、表现为丧失功能的抑癌基因、表现为丧失功能的抑癌基因1. Rb基因基因 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)是婴幼儿眼恶性肿瘤中最常见的一种。大量研究资料证明,位于人类细胞第13号染色体长臂13ql4区域的视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene, Rb)的缺失或失活,是导致肿瘤发生的主要原因。 Rb基因在遗传学上是隐性的,即必须两个等位基因同时缺失形成所谓的缺失纯合子,或一个等位基因缺失而另一基因突变而失活,才能导致基因功能的丧失。 等位基因的缺失或失活可由以下情况引起: 染色体丢失(染色体丢失(13- ) 染色体部分缺失(染
25、色体部分缺失(13q - ) 等位基因突变(等位基因突变(13qRB I3qrb)因此,肿瘤细胞的基因型有以下几种可能性: 13qrb13qrb 13qrb 13q - 13qrb 13- 13q - 13q - 13- 13- 有关脂酶 D(esterase D, ED)的研究究揭示了一个饶有兴趣的现象。某些视网膜母细胞瘤患者的红细胞脂酶D活性只有正常人的一半,而在瘤细胞中则其活性为0。 这一现象提示,脂酶D基因与Rb基因紧密连锁,Rb基因的缺失导致脂酶D活性的相应下降。 同时提示,在体细胞中可能只有一个等位基因缺失,而另一个则是正常的,其基因型可能是 13q - l3RB。体细胞中的正常等
26、位基因如发生突变而失活,则可导致肿瘤发生,其基因型变成13q - l3rb。 脂酶D的研究不仅为阐明肿瘤发生的机理提供了有力的依据,更重要的是,脂酶D基因与Rb基因的紧密连锁,为Rb基因的分离铺平了道路。 Lee等于1987年首次成功地分离到了Rb基因的cDNA分子克隆: 以脂酶D的基因组DNA分子克隆为起点,将其两侧远端的 DNA片段作为探针,用染色体步移(Chromosome walking)的方法从人胚视网膜和胎盘的cDNA文库中筛选 Rb的相关基因。 经过反复筛选,获得了一个与脂酶 D相邻的,编码 46kb mRNA基因,定名为视网膜母细胞瘤易感基因,简称Rb基因。 检查了6例视网膜母
27、细胞瘤病人,发现其中2例基因完全不表达,其他4例则表达下降,而且表达的mRNA分子长度减少至4.0kb左右,对进行序列分析的结果表明,它编码一个含816氨基酸残基的蛋白,经计算机检索未发现与该基因同源的序列。 以后各国学者对Rb基因的结构与功能进行了大量的研究: 现已明确,Rb基因的基因组DNA总长为200kb,有27个外显子,转录为 4.7kb mRNA,编码含 928氨基酸残基的蛋白质,其分子量为110114kD。 常见的三种蛋白产物的分子量分别为 110kD 未磷酸化形式 112kD 磷酸化形式 114kD 其磷酸化程度在细胞周期中发生周期性变化: G0 期、G1期 蛋白未磷酸化 S期、
28、 G2期 大多数蛋白已磷酸化 Rb蛋白磷酸化程度与细胞周期调节因子cde2cde28的活性呈正相关。 未磷酸化型Rb蛋白可能是抑制细胞增殖的活性型。 Rb基因可与某些肿瘤病毒的转化蛋白形成稳定的复合物,其中包括SV40抗原,腺病毒EIA蛋白和人乳头瘤病毒E6/E7蛋白,故可能对肿瘤病毒的转化起抑制作用。 Rb蛋白还可以对细胞内转录因子、生长因子起调控作用: 研究资料表明,在正常细胞内可能存在着Rb蛋白的靶蛋白。例如,细胞内谷胱甘肽S转移酶能同Rb基因的LT/EIA结合,这种结合同Rb蛋白的生长抑制功能有关。一旦Rb蛋白同SV40或腺病毒基因组的相应部位结合,或在位点发生了点突变,就可能丧失其生
29、理功能。 转录因子E2F也能与Rb蛋白形成复合物,故Rb蛋白可通过同样的机理来调节E2F因子的转录活性。 另外, Rb基因可抑制细胞内癌基因的表达。例如,用Rb基因转染NIH/3T3细胞可抑制c-fos癌基因在G1晚期的表达。 Rb蛋白还可通过同c-myc,N-myc,erbB-2neu等癌基因产物相结合来调节细 胞的增殖和分化。 2P53基因基因 在过去十几年里,人们对p53基因的认识经历了一个漫长的历程: 最初是通过在鼠类细胞中p53蛋白与DNA肿瘤病毒抗原的结合而发现的。 随后克隆到了p53基因,并证明它能转化鼠类细胞,而且发现在恶性转化的哺乳动物细胞中,p53基因的表达增高。这些资料提
30、示,p53的作用类似于myc或ras,因此可能是一个癌基因。 随着研究的深入,发现了一些矛盾的现象。 在对大肠癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤进行大量细胞遗传学研究时发现,第17号染色体短臂经常丢失。 按照Knudson关于抑癌基因作用模式推测,丢失的染色体片段中可能存在着抑癌基因。 由于己知p53基因定位于17p13.1,所以有 可能成为等位基因丢失的靶基因因此对肿瘤细胞中残留的等位基因进行了序列分析,发现绝大多数残留的p53等位基因己经经历了点突变。 这种等位突变的模式表明,p33基因很可能象 Rb基因那样,是一个抑癌基因。 进一步的研究表明,能够使鼠类细胞发恶性转化的基因实质上是突变型p53基因
31、,而野生型p53基因不仅不诱发转化,相反地能抑制转化。 根据现有资料,基因全长1620 kb,由11个外显子组成产生长25kb的mRNA,编码含393个氨基酸残基的蛋白,分子量为53 kD。 蛋白有5个高度保守区,分别位于第1319、117142、171192、236258及270282密码子区域。基因突变大多数发生于外显子,与上述保守区基本相符。检查等位基因的缺失或突变可采用以下几种方法: 限制性 DNA片段长度多态性分析 单链 DNA构型多态性分析 直接 DNA测序 限制性限制性 DNA片段长度多态性(片段长度多态性(restriction DNA fragment length poly
32、morphism,RFLP)分析:)分析: 提取 DNA,用适当的限制性内切酶酶解,再用电泳分离。正常细胞的两个等位基因是杂合的,因而显示不同的带型。如果有一个等位基因缺失,就会显示单一的带型,这种现象称为杂合性丢失( loss of heterozygosity, LOH); 单链单链 DNA构型多态性(构型多态性( single Strand conformation polymorphism,SSCP)分析)分析: 正常细胞在变性后,经聚丙烯酸胺凝胶电泳,呈现一定的带型。如其中某一个单链发生了突变,就可使单链的构型发生变化,结果使其电泳速度发生变化,导致额外电泳带的出现;l 直接直接 D
33、NA测序:测序: 由于突变经常发生于第 58外显子,故可设计这 4个外显子上下游的引物进行聚合酶链反应( polymerase chain reaction, PCR)扩增,然后分别进行 DNA测序( DNA sequencing)。用这一技术不仅可以测定等位基因缺失或突变的性质,还可对其进行精确的定位。 正常野生型p53(wtp53)基因的转录产物不稳定,半衰期仅20分钟,而突变型p53(mp53)的半衰期则延长至1.47小时,所以如用原位杂交或免疫组化方法来检测,则不能检测到wtp53。而只能检测到mp53的mRNA和蛋白。 只有wtp53蛋白才具有抑癌活性,mp53蛋白则不仅丧失了抑癌活
34、性,而且还能与wtp53蛋白结合使其丧失抑癌功能。所以当一个p53等位基因发生突变时,就足以使细胞呈现恶性表型。 这一点与必须两个等位基因同时失活不同,说明p53基因突变的遗传型是显性的。这一特殊的遗传学现象称之为显性负效应( dominant negative effect)。wtp53基因的功能是多方面的,主要有以下几面: 转录因子活性 wtp53信号区的功能 转录因子活性转录因子活性 p53蛋白是一个转录因子,可通过转录活化区与通用转录因子(multisubunit transcription factor,TF11D)结合并相互作用。 TF11D是TATA结合蛋白(TATA bindi
35、ng protein.TBP)和 TBP相关因子(TBP associated factor,TAF)结合而成的复合物。 与TF11D中的TAF结合,TF11D再通过TBP与其下游基因启动子中的TATA box结合而发挥作用。 wtp53的转录活性受腺病毒EIB蛋白及癌基因产物MDM2蛋白的抑制。MDM2通过与wtp53转录活性区相互作用而起到抑制mp53活性的作用。 wtp53信号区的功能信号区的功能 此区34个氨基酸中有12个脯氨酸,含5个脯-X-X-脯重复序列,产生一个SH-3区结合部位。 wtp53基因基因借助于 SH-3区的结合活性,把它同信息传递通道直接联系起来,激活某些靶基因如
36、p21WAFIcip1的转录活性。 WAF1的蛋白产物p21是细胞周期调节因子,可有效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性,从而阻断细胞周期的演进。 总之, wtp53正是通过其转录活性和信号传递功能而发挥其抑癌功能的,主要表现为调节细胞周期和诱导细胞凋亡(将在其他章节中详细加以叙述)。 3. p73基因基因 p73基因的发现极为偶然。 Kaghad等于1997年在利用针对IRS-l结合区的寡核苷酸探针与COS细胞的cDNA文库进行杂交分析中,检出一假阳性克隆它与IRS-l结合区无任何同源性,却与p53基因的大部分保守序列均同源。根据此序列编码的蛋白的分子量,将其命名为p73基因。 利用荧光原位杂
37、交技术将基因定位于lp36区。此区域由于在神经母细胞瘤及其它多种肿瘤细胞中常发生缺失因而被认为可能存在着某种抑癌基因。 p73基因由13个外显子和 12个内含子组成, 其表达产物p73蛋白与 p53蛋白有同源性: p73蛋白和 p53蛋白一样具有4个主要的功能区,其氨基端的转录激活结构域与p53 29同源,中部的 DNA结合结构域与 p53 63同源, p53的 6个突变热点p73也完全保守,寡聚结构域有38同源,而羧基端则未检出明显同源。 迄今共发现6种p73基因的转录剪切变异体,它们分别为: p73 p73 p73 p73 p73 p73 p73 由 636个氨基酸残基组成,是全长的 p7
38、3蛋白, p73 则由 499个氨基酸残基组成,这是由于 p73基因转录时将外显子 13剪切而缺失了96个氨基酸残基,并导致开放读框的改变。 p73 除了最后 5个氨基酸残基为其所特有外,其余均与 p73 的相应序列完全相同。 虽然哺乳动物的 p53蛋白与 p73蛋白的羧基端没有明显的同源性,但是人 p73 蛋白的羧基端与最近在无脊椎动物中发现的p53蛋白同源,说明p53基因可能是从更为原始的“p73样”基因进化而来的。 利用酵母菌杂交系统研究蛋白各种剪切变异体之间相互作用时,发现p73蛋白形成同源二聚体的能力很强,类似于 p53,而 p73 则很弱。 P73 和 p73 蛋白与 p53之间有
39、较弱的异型间相互作用。 这些结果表明,p73蛋白各种剪切变异体能形成同型或异型相互作用,而且提示这些作用有可能发生于体内,以便协调整个p53-p73系统的功能。 p73基因在染色体上定位的特殊性以及其蛋白产物与p53蛋白在结构上的相似性,均提示它可能是一个抑癌基因,并且可能与p53蛋白在功能上有相似性: 实验证明,p73过表达时能抑制细胞生长和诱导细胞凋亡,而其突变体则无此功能。 p73还能激活部分p53的靶基因,但对绝大多数p53靶基因其作用则明显弱于 p53基因。 例如 p73和 p73对 p21的诱导水平分别比 p53低了6倍和 3倍。但有趣的是,对某些靶基因如 14-3-3 a和 PI
40、G7的诱导水平却远远高于 p53。 因此,虽然p53和 p73均能诱导细胞凋亡,但二者导致调亡的信号途径可能有所不同。 另外,不同型 p73蛋白的生物功能强弱不同,其中以p73的功能最强。 随着对p73作用分子机理研究的深入,发现了一些矛盾的现象: 在各种肿瘤中均检测不到p73的突变,甚至在一些癌细胞中发现了p73的高表达; p73-/-小鼠中见不到肿瘤易患现象,但却有严重的发育异常,尤其是脑和免疫系统。反之,p53 -/-小鼠易患肿瘤,却无明显的发有异常,这提示有一更原始的基因能够替代p53而完成小鼠某阶段的发育,而这个基因是否就是p73呢? 三种经典的病毒癌蛋白(SV40大 T抗原、腺病毒
41、 EIB55kD和 HPV E6)均能作用于 p53并使之失活,从而使宿主细胞发生恶性转化,却不能与p73蛋白相结合。 以上现象说明,p73抑癌和失活的分子机理尚有待于进一步研究阐明。4与家族性腺瘤样息肉病与家族性腺瘤样息肉病 (familial adenomatous polyposis, FAP) 相关的抑癌基因相关的抑癌基因 FAP过去通常称之为家族性结肠息肉病( familial polyposis coli,FPC),是一种常染色体显性遗传病。 近年来对 FAP与抑癌基因之间的关系研究得较多: APC (adenomatous polyposis coli)基因基因 MCC(muta
42、ted colorectal cancer)基因)基因 DCC(deleted in colorectal carcinoma)基因)基因lAPC (adenomatous polyposis coli)基因基因 是 FAP的易感基因,定位于第 5号染色体长臂(5q21),由 15个外显子及 14个内含于组成,其mRNA全长为 8535bp,编码 2842个氨基酸残基的蛋白,分子量为 500kD,与酵母菌中调节 ras族癌基因的基因中一个小片段有同源性。 其基因产物定位于细胞质,APC不仅同FAP有关,而且同散发性结肠癌、肺癌等肿瘤有关。 l MCC(mutated colorectal ca
43、ncer)基因)基因 也是 FAP的易感基因,定位于第5号染色体长臂(5q21),由 17个外显子 16个内含子组成,其 mRNA全长为4181bp,编码 829个氨基酸残基的蛋白,分子量为 93 kD。 在染色体上与APC相邻,同 G蛋白偶联的乙酰胆碱蕈毒碱受体的一小片段有很高的同源性。 MCC不仅同FAP及结肠癌有关,还同小细胞肺癌及非小细胞肺癌等有关。lDCC(deleted in colorectal carcinoma)基因)基因 定位于18号染色体长臂(18q21.3),基因全长约 370 kb其 mRNA长 1012 kb,编码含 750个氨基酸残基的蛋白,分子量为 190 kD
44、。其序列同神经细胞粘附分子有同源性。 DCC蛋白与细胞同细胞及细胞同基质之间相互关系有关。 在结肠癌中可见到DCC基因的丢失。 5. NF1基因基因 NF1(neurofibromatosis type l)基因是多发性神经纤维瘤的易感基因,定位于第17号染色体长臂(17q11.2)。 基因全长约6okb,转录成1113kb mRNA,编码2485个氨基酸残基的蛋白。NF1蛋白同ras族癌基因编码的GTP酶活性蛋白有一定的同源性。 NF1蛋白可能为抗增殖蛋白,表现为对 ras p21蛋白的负调节和阻止 ras介导的有丝分 裂信号。 NF1失活足以产生良性的神经纤维瘤,但在恶变时可能还有别的基因
45、参与。 6. WT1基因基因 WT1(Wilms tumors type 1)为Wilms瘤(肾恶性胚胎瘤)的易感基因,定位于第 17号染色作短臂( 17p13),基因全长约 59 kb,转录成 3kb mRNA,编码 345个氨基酸残基的蛋白。 该蛋白含 4个锌指纹族,显示与特异性 DNA结合的特性,能同上皮细胞生长因子受体 EGFR-l启动子区域的 CGCCCCCGC序列结合,从而抑制其转录活性。 表达有发育阶段特异性及组织特异性:l在胚胎肾上皮、睾丸和卵巢,及一些造血细胞中有表达但在成人细胞中不表达。l在纯合性缺失的 Wilms瘤中无 WT1 mRNA表达,但在绝大多数 Wilms瘤中呈
46、高表达。 推测其突变基因可能也象突变型p53那样,表现出显性负效应。突变的基因可过度表达,并对野生型等位基因起抑制作用。 7. ErbA基因基因 同 P53基因一样,erbA基因以前一直被认为是癌基因。用含 erb A和 erbB基因的禽成红细胞增多症病毒(AEV)感染红细胞系造血细胞,可产生红白血病。 近年来的研究表明,野生型erbA基因是一种抑癌基因编码正常甲状腺素受体可抑制细胞增值,促进终未分化,而突变型 erbA基因也象p53基因那样仅有显性负效应,不但无抑癌作用,反而能抑制野生型 erbA的作用。 8. Krevl基因基因 日本学者野田亮等用插入到真核细胞表达性质粒的人包皮成纤维细胞
47、cDNA文库提取的总DNA,转染经K-ras癌基因转化的小鼠NIH3T3细胞,从中筛选出扁平型表型逆转的细胞克隆。 最后从这些克隆中分离到一个能特异地抑制上述细胞恶性表型的cDNA片断,命名为Krevl基因。有关这一基因的结构与功能尚少报道,可能与人类肿瘤关系不大。 9. INK4基因基因 INK4基因的蛋白产物是一种细胞周期抑制蛋白( CKI)。 目前已知的 CKI可分为两大类:lINK4(inhibitor of CDK4)特异地抑制CyclinD1 CDK4和cylinD1 CDK6的磷酸化激酶活性;l Kip( kinase inhibition protein)抑制现己知的大多数 C
48、yclin CDK的磷酸化激酶活性。 现已知的INK4包括 pl6 INK4a p15INK4b p18 INK4c p19INK4d 其蛋白质结构与功能具有高度相似性。 为pl6 INK4a、p15INK4b编码的基因位于第9号染色体长臂9q21区。 pl6 INK4a基因又称多肿瘤抑制因子(multiple tumor suppressor l,MTSI)、细胞周期蛋白依赖性激酶 4抑制因子(cyclin-dependent kinase 4 inhibitor,CDK4I),是Kamb和Nobori在1994年发现的。 pl6 INK4a基因长约 85 kb,包括 3个外显子和 2个内含
49、子, cDNA全长 444 bp,编码由 148个氨基酸残基组成的。分子量为 16 kD的蛋白质。该类蛋白质的N-末端具有Cyclin box同源框及由 4个回钩状重叠组成的二级结构,该保守结构中氨基酸变异与肿瘤发生之间的相关性高于其他氨基酸部位。 最近发现,小鼠INKK4a基因组能产生、两种转录产物,两者长度基本相同。 产物编码pl6 INK4a , 产物编码分子量为 19kD的蛋白质称之为 p19ARF (alternative reading frame,ARF)。 INK4a基因和 ARF基因分别具有不同的启动子,产生不同的基因产物。 pl6 INK4a基因的转录产物由外显子l ,外显
50、子 2和外显子 3组成,而 ARF基因的转录产物则由外显子 1,外显子 2和外显子 3组成。 虽然 INK4a基因和 ARF基因共有外显子 2和外显子3,但由于读框互不相同,他们编码的蛋白质序列没有同源性。 两种抑癌机理; pl6 INK4a pRb途径途径 p19ARF p53途径途径lpl6 INK4a pRb途径:途径: pl6 INK4a与 CyclinD1竞争性结合 G1期激酶 CDK4CDK6,抑制其对 Rb蛋白(pRb)的磷酸化作用,使游离的转录因子E2F-l与未磷酸化的pRb结合,结果依赖于E2F-1转录的基因不能被转录,从而抑制 DNA合成,抑制细胞由 G1期进入 S期,抑制
51、细胞分裂。 pl6 INK4a还可间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应,从而抑制细胞周期进程。 pl6 INK4a失活可导致细胞周期紊乱。lp19ARF p53途径:途径: wtp53基因的表述受mdm2癌基因产物MDM2的负调控。在肉瘤和其他一些肿瘤中,MDM2过度表达,所以尽管wtp53基因本身无突变,却检测不到 wtp53 mRNA的存在。 p19ARF 的N-端结构域可以与 MDM2的 C-端结构域结合,阻止MDM2进入核内并加速其降解,因而可以提高wtp53的稳定性和在细胞核中的水平,抑制肿瘤发生。 pl6 INK4a基因中最常见的失活机理为纯合性缺失,其他两种可能的机理则为突变
52、和甲基化。 在多种肿瘤中均可发现pl6 INK4a基因的异常:l在胰腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、急性白血病、恶性黑色素瘤、鼻咽癌等人类肿瘤中的pl6 INK4a纯合性缺失率较高l在胰腺癌、食管鳞癌、家族性恶性黑色素瘤及胆管癌等肿瘤中则pl6 INK4a的突变率较高l在乳腺癌及胃癌中pl6 INK4a的突变率较低 近年来发现,非小细胞肺癌中 pl6 INK4a 5-CpG岛的甲基化达33,在对大肠癌、前列腺癌、乳腺癌等原发肿瘤和细胞系的检测中也发现了 pl6 INK4a 5 -CpG岛的高甲基化。 由此可见, pl6 INK4a 基因的异常甲基化也可能在肿瘤发生中起着重要的作用。 10p
53、21Cip1 基因基因 细胞周期抑制蛋白 CKI包括 INK4和KiP 两大类。现己知的Kip包括p21Cip1 (cyclin inhibition protein 1)、p27Kip1(kinase inhition protein) 及p57Kip2三种细胞周期抑制蛋白。 它们在N-末端的结构和功能具有高度的相似性。 p27Kip1与p21Cip1 N-端间具有 42的同源性, p27Kip1与p57 Kip2N-端间具有47的同源性。他们均可特异地抑制下列蛋白激酶活性,具有同 INK4相似的功能: CyclinD1 CDK4 CyclinD1 CDK6 CyclinE CDK2 Cyc
54、linACDK2 1993年 Harper和 EIDeiry两个试验小组同时分离出 p21基因的 cDNA。并根据其功能给予了不同的命名,如 CDK相互作用蛋白(CDK interacting protein 1, Cip 1),野生型 p53活化的片段(wild type p53-activated fragment 1,WAF 1)等。 p21基因定位于第6号染色体短臂(6p21.2),其基因组 DNA长度为 85kb,由 3个外显子组成。其 cDNA长约 2.1kb。 在 p21编码区上游24 kb和大于 8 kb处有 2个 p53结合区, p21蛋白定位于细胞核中,由 164个氨基酸残
55、基组成,富含精氨酸。其 N末端第 2126个氨基酸残基可与CyClinD,E结合,C末端第 124164氨基酸残基可与 PCNA结合,中间第4972对氨基酸残基可与CDK2结合。 p21是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白。 它能与多种Cyclin CDK复合物结合,通过多种途径对细胞周期演进起抑制作用。l p21蛋白能与CyclinD1 CDK4, CyclinE CDK2结合使其丧失磷酸激酶活性,使pRb不能发生磷酸化,从而使细胞周期停滞于G1期;l p21蛋白还能与增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)结合,使
56、PCNA不能与 DNA聚合酶 形成复合物,从而抑制 DNA合成。 p21基因的活化和表达可通过以下两个途径来完成: 依赖依赖P53途径途径 非依赖非依赖p53途径途径 依赖依赖p53途径途径 当细胞受到损伤时(如受辐射),在wtp53+/+ 细胞中常有wtp53,p21表达升高,细胞停滞于 G1期,而在 p53 -/- 细胞中则无 p21升高,细胞也无G1期停滞,说明wtp53 作为转录因子,可启动p21表达,使细胞停滞于GI期,以利于DNA修复,维持细胞遗传信息的稳定性。 非依赖非依赖p53途径途径 生长因子(PDGF、FGF、EGF、TGF )等作为细胞外信号,刺激p53 -/-的静止期细
57、胞,通过细胞分裂素活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径调节 p21转录。佛波酯、 干扰素等可诱导wtp53 -/-的人类白血病细胞系的 p21表达,并出现单核巨噬细胞系分化相关的生长停滞。 在大多数肿瘤细胞中未发现p21突变,而只见到其表达改变。在黑色素瘤细胞间变痣、SV40转化的黑色素瘤细胞和转移的黑色素瘤中,其表达水平依次显著降低,表明 p21表达与黑色素瘤的发生、发展有密切关系。 在43例非小细胞性肺癌及其对应的正常组织中,通过mRNA检测及免疫组化显示,在正常肺组织中p21mRNA及蛋白表达很低,而在肺癌组织中p21mRNA
58、及蛋白均高表达,其机理尚不太清楚。 11 p27Kip1 p27Kip1是Polyak等于1994年在TGF处理的生长抑制细胞,及接触抑制的细胞系中发现的另一种分子量为 27 kD的耐热细胞周期抑制蛋白。 它在体外与CyclinE CDK2,CyclinD1 CDK4紧密结合,其活性的发挥依赖于三者间的化学剂量关系。 CyclinE CDK2的浓度是细胞通过细胞周期关卡的关键因素,而p27Kip1则特异地抑制CyclinE CDK2的激酶活性。 人 p27Kip1是由198个氨基酸残基组成的热 稳定蛋白,与p21Cip1 在N-端有高度同源性。其末端2187位点的60个氨基酸残基具有两个Ser
59、磷酸化位点,具 CDK激酶抑制活性。 153169位的17个氨基酸序列为核定位序列,该序列在 Kip的三个成员平均存在,与其细胞周期调控功能密切相关。 p27Kip1的 C末端有一个 Thr磷酸化位点,与其H1组蛋白磷酸化抑制作用有关。 大量实验证明,在TGF处理的细胞系、有接触抑制的细胞系及多种外源性生长抑制因子作用的细胞系中p27Kip1表达量明显增多。在TGF处理前后细胞内p27Kip1的mRNA总量无明显变化,但在处理后G1末期细胞中游离的p27Kip1浓度增加。 在TGF 处理的细胞中加入过量的CyclinD1 CDK4可以使滞留于G1期的细胞重新分裂。 这些资料说明,抑制细胞周期的
60、最关键因素是细胞内游离 p27Kip1的量,而不是其总量。 另外, p27Kip1具有抑制染色质H1组蛋白 磷酸化的作用。 细胞内 DNA聚合酶作用的发挥依赖于 H1组蛋白磷酸化介导的染色质结构变化,抑制 H1组蛋白的磷酸化也就间接地抑制了DNA的合成。 p27Kip1具有多种细胞周期抑制作用,虽其作用弱于p21Cip1 ,但对正常组织的损伤明显低于后者,因此有可能作为基因治疗中可供选择的靶基因。 12FHIT基因基因 FHIT基因是1996年Ohta等用外显子捕获法克隆到的一个人类基因。 由于该基因定位于第3号染色体短臂(3p14.2),该处存在脆性部位FRA3B,而且根据其推算的蛋白质序列
61、 与具有三价组氨酸结构域的HIT蛋白质高度同源,因此定名为脆性组氨酸三联体 (fragile histidine triad, FHIT)。 FHIT基因 cDNA全长 1.1kb,具有 10个外显子,其开放阅读读框( open reading frame)起于外显子5,止于外显子9。 关于FHIT异常与肿瘤发生之间的关系已有许多研究报道,迄今尚未发现有关 FHI下基因突变的报道。 有报道在38例有第3号染色体复制(chromosomal duplication)异常的非小细胞肺癌病人中,50%有3p特定序列的缺失,83%有FHIT基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity
62、, LOH),说明 FHIT等位基因的丢失可能在肿瘤发生中起着重要作用。 13. PTEN PTENMMAC1/TEP1基因是1997年由3个研究组分别发现和命名的一种抑癌基因。 PTEN基因又名 MMAC1和 TEP1。lPTEN phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10lMMAC1 mutated in multide advanced cancerslTEP1 TGF -regulated and epithelial cell enriched phosphatase PTEN定位在 10q23.3上,并已被克隆。共
63、有 9个外显子,mRNA为 5.5 kb。 PTEN蛋白的主要结构功能区位于N-端,由个1209个核苷酸编码403个氨基酸残基组成一条多肽链。在第122123位的氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)符合酪氨酸磷酸酶的核心基序(HCXXGXGRX),是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。 目前对PTEN的作用机理已有较多报道,认为PTEN的抑癌作用可通过以下途径来完成: FA K途径途径 三磷酸脂酸肌醇激酶途径三磷酸脂酸肌醇激酶途径 丝裂原激活的蛋白激动途径丝裂原激活的蛋白激动途径 FA K途径途径 锚着点激酶(FAK)是整合素(integrin)介导的信号途径中的一个关键分子。整合素通过
64、与细胞外基质相互作用而被活化,继而激活FAK,促使细胞增殖、侵袭和转移。 PTEN 则可直接使FAK去磷酸化,从而抑制细胞生长。 三磷酸脂酸肌醇(三磷酸脂酸肌醇(PI3)激酶途径)激酶途径 三磷酸磷脂酸肌醇(PIP)位于细胞膜上,是一种细胞生长调控途径中的关键分子,主要作用是刺激细胞生长和阻断凋亡。是胰岛素生长因子( IGF)和上皮生长因于(EGF)等一些细胞生长因子在细胞内的第二信使。 生长因于与膜上受体结合,激活PI3激酶,从而使信使前体PIP2磷酸化生成PIP3。后者随后激活信号传导系统中的一系列激酶包括丝苏氨酸激酶(Akt)。这些酶可促使细胞进入分裂周期,并阻止细胞周亡。 PTEN能抑
65、制PI3激酶的磷酸化作用,阻止PIP2向PIP3转化从而阻断了Akt及其下游基因的活性,从而起到了抑癌作用。 丝裂原激活的蛋白激动(丝裂原激活的蛋白激动(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径)途径 有报道整合素可激活 MAPK途径及其细胞外调节激酶( ERK)。整合素可同生长因子协调作用,通过一系列复杂的信号传导系统,刺激细胞增殖。 PTEN可显择性地抑制ERK激活的MAPK途径,使其不受整合素和生长因子的影响,从而对细胞增殖起抑制作用。 关于 PTEN与肿瘤之间的关系已有较多报道。 Cowden( CD)综合症是一种常染色体隐性遗传性肿瘤综合症,其
66、特征为多个脏器发生错构瘤,包括甲状腺、乳腺、皮肤及女性生值系统,而且很容易发展成甲状腺癌和乳腺癌。 对5个家系进行的研究中,发现有4个家系存在着PTEN基因的生殖细胞突变。这些突变分别为无义突变和错义突变,均发在PTEN编码蛋白的主要结构功能区(酪氨酸磷酸酶核心基序)的DNA序列上。在其中两个家系病人的错构瘤中存在着PTEN等位基因的LOH。 这些资料充分说明,PTEN是一个典型的抑癌基因。 其他恶性肿瘤如恶性胶质瘤、前列腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌中,也发现了较高频率的PTEN等位基因LOH和突变,其中子宫内膜癌的突变率可高达50。 14 DPC4基因基因 DPC4( deleted in pa
67、ncreatic cancer locus 4)是 Haln等于 1996年新近克隆出的定位于人第18号染色体长臂( 18q21.1)的基因,其cDNA长 2680 hp,编码 552个氨基酸残基,有11个外显子和10个内含子。 Halm等报道,29.6%(2584)的胰腺癌有DPC4基因的纯合性缺失,22.2(627)有基因突变,多发生于外显子8,9,l0,11。 DPC4基因的功能目前尚不清楚,但其蛋白 产物Smad4的氨基酸序列与黑腹果蝇(drosophila)的Mad基因以及线虫(caenorhabditis elegans)的 Mad同源基因 Sma2, Sma3, Sma4具有高度
68、同源性,同源性最高的是外显子 l, 2, 11(高达85),而外显子8,9,10的同源性较低(75)。 这些基因都是TGF 超家族的成员。推测DPC4的功能可能是在TGF 受体介导的信号传导通路中作为一种重要的中心转录因子。 DPC4基因缺失或突变可能导致细胞过度增殖。 二、二、 参与参与 DNA修复的抑癌基因修复的抑癌基因 与经典的抑癌基因不同,有一些基因并不直接抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡,但在细胞DNA修复中起重要作用。 一旦这些基因由于缺失或突变而失活,则可使机体处于遗传不稳定(genetic instability)状态,也有人称之为突变者表型(mutator phenotype)。此
69、时由于各种原因造成的DNA损伤得不到及时修复,便突变逐渐积累,最终导致肿瘤发生。 这种发病机理与上述抑癌基因基本相同,所以目前许多学者向于把它们看成抑癌基因。 这类抑癌基因包括一些错配修复基因hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、GTBP等,以及BRCA1、BRCA2、ATM等。 1错配修复基因错配修复基因 基因突变是肿瘤发生的主要原因,而引起基因突变的直接诱因则是不同类型的DNA损伤。 其中多种原因造成的双链DNA分子的碱基错配是导致突变的主要DNA损伤类型之一。 大量研究表明,从细菌、酵母到人体细胞都存在着一种能修复碱基错配的安全保障体系,它们由一系列特异地修复碱基错配的酶分子组
70、成,称之为 DNA错配修复系统( DNA mismatch repair system,MMR),而编码这些酶分子的基因则称之为错配修复(MMR)基因。 人体细胞中由于MMR系统的存在可保持基因组的完整性和稳定性,避免基因突变的产生保证DNA复制的高保真度。 早在70年代,人们就在大肠杆菌中发现了一种称为MutHLS途径的MMR系统。这一修复途径主要依赖于mutH、 mutL、 mutS和 mutU等基因所编码的酶分子来完成。此外该途径还需要DNA聚合酶 、DNA连接酶、单链DNA结合蛋白和外切核酸酶等的参与。 随后从酵母中也分离到三种MMR基因,其中 MSH2基因与大肠杆菌中的mutS基因同
71、源,而 MLH1和 MPS1基因则与大肠杆菌的mutL基因同源。 有报道酵母MMR修复体系的三种MMR基因中任何一种发生突变,都会使酵母基因组中二核昔酸重复序列拷贝数大大增加或降低。由此可见,酵母MMR修复体系对酵母基因组的稳定性起重要调节作用。 人类MMR基因的发现则经历了一个较为曲折的过程,1993年世界上有几个实验室同时报道,在约1218的散发性结肠癌病人肿瘤细胞中检测到一种“遍在性体细突变”(ubiquitous somatic mutation)。 而且在遗传性非多发息肉型结肠癌 (hereditary mompolyposis colorectal cancer, HNPCC)中,
72、这种体细胞突变可发生于 HNPCC家系的几乎所有肿瘤病人的肿瘤 细胞中。 遍在性体细胞突变是指人体细胞基因组中普遍存在的,被称为微卫星的DNA简单重复序列拷贝数的变化,具体表现为肿瘤细胞和正常细胞中某些特定的微卫星序列长度上有差异。 这种遍在性体细胞突变因此又称为微卫星 DNA不稳定性(microsatellite DNA instability)。 随后各国学者对这一现象进行了深入的研究。首先发现,人体细胞提取液可催化错配修复反应,这种反应与大肠杆菌MutHLS系统介导的DNA链特异性错配修复反应极其相似。 大肠杆菌MutHLS系统在进化过程中高度保守,故可根据该系统中mutS和mutL 蛋
73、白质的高度保守氨基酸序列,设计出相应的兼并寡核着酸引物,用RT-PCR方法从特定的人体细胞总RNA中扩增出相应的产物。 经克隆测序鉴定出与该保守区氨基酸同源的PCR扩增片段,以此作为探针,从人体细胞cDNA文库中分离大肠杆菌mutS或mutL高度同源的MMR基因全长cDNA。 1993年首次分离到与大肠杆菌mutS同源的人hMSH2基因,以后又陆续分离到hMLH1、hPMS1、hPMS2等三种MMR基因,它们均与大肠杆菌mutL同源。 现已阐明,这4种MMR基因编码的蛋白可相互作用,形成一种多聚体复合物参与错配修复反应。 这一反应既可修复由损伤导致的碱基错配,又可消除由于简单重复序列的同源序列
74、之间的遗传重组出现的不配对碱基序列,这样可有效地防止 DNA复制差错( DNA replication error,RER)的产生。 在修复反应过程中首先 hMSH2蛋白与 GTP结合蛋白( GTP-binding protein,GTBP)形成一种称之为hMutS-的二聚体复合物。由于GTBP在修复反应中是必需的,因此有人也将其列为人类 MMR基因之一。 hMutS-结合到碱基错配区域,然后再 与由 hMLH1和 hPMS1基因产物形成的二聚体hMutL-结合,其中异源二聚体hMutL-起到识别带有缺口的新生DNA链的作用。 hMutS-与 hMutL-结合到错配区域后,整个错配修复反应即被
75、启动。修复反应包括切除含错配碱基区域的DNA片段,以及被切除区域DNA的重新合成与连接等三个步骤。 由此可见,人体细胞中MMR反应过程依赖于至少5种人类MMR基因产物的参与,而其中任何一种基因功能的丧失都将导致错配修复功能的异常。 对肿瘤细胞的微卫星不稳定性可能是由于MMR缺陷所致这一推论,很快在HNPCC中得到证实: HN PCC是一种较常见的常染色体隐性遗传性肿瘤综合症,在西方国家中其发病率占人口的1/200l2000,但在我国则尚少系统的报道。在HNPCC家族中包括结肠癌在内的多种恶性肿瘤的发病率高,发病年龄低。 在绝大多数HNPCC肿瘤细胞中可检测到某种MMR基因的突变,其中以hMSH
76、2和hMLH1基因突变所致的占大多数。 hMSH2 hMLH1 HNPCC 60% 30% 散发性结肠癌 42% 8% (百分数为突变率) 在HNPCC的发病过程中MMR基因的作用方式类似于经典的抑癌基因。MMR基因功能丧失需要两次突变事件:l第一次突变存在于生殖细胞中MMR的一个等位基因上,结果使突变个体获得对结肠癌的易患性。该个体的体细胞中基因处于杂合状态。l第二次突变发生于特定部位的体细胞中,结果使MMR突变纯合,导致其功能丧失。 MMR缺陷的后果:l使DNA复制过程中某些简单重复序列的同源序列发生同源重组,而出现序列长度的变异;l更重要的是,可使发生在某些原癌基因和抑癌基因中的突变得到
77、快速积聚,从而使这些细胞的增殖失控,最终导致肿瘤发生。 现已在HNPCC组织中发现了多种类型的 hMSH2及 hMLH1基因突变。这些突变有的是由于无义突变直接造成终止密码子的提前出现,也可由于DNA序列插入或缺失引起移码突变后导致终止密码子的产生。这二者均可使其表达产物变成截短的蛋白质(truncated protein)。 其后学者们进一步证实 hMPS1和 hMPS1基因突变绝大多数也导致截短蛋白的生成。这些实验室大多数采用体外偶联的转录转译反应( in vitro transcription reaction,IVTT)可快捷、有效、可靠地检出 MMR基因突变造成的截短蛋白。 IVIT
78、法可在一次反应中完成对整个基因或基因大部分结构的筛查,而其他方法如SSCP或DGGE每次反应只能检测基因的个别外显子。 该法只能检出编码截短蛋白的基因突变,因此该法所查出的基因突变均为病理性突变,而经SSCP或DGGE法所查出的基因突变尚需进一步区分为病理性突变抑或仅代表多态性。 基于以上特点,IVTT有望成为临床上对HN PCC家系成员进行症状前诊断的一种可靠的分子生物学检测方法。 目前对 MMR系统的研究虽取得了较大的进展,但还有许多问题尚未查明:l例如hMSH2在HNPCC中虽有较高的突变率,但尚不能解释全部病人的发病原因,可能还有其他基因在起作用。l另外,MMR基因的失活除突变外,是否
79、还存在着其他机理,也值得考虑。l有报道在hMSH2基因启动子区域有一个p53蛋白的识别位点。由此推测,hMSH2基因可能是受p53基因调控的一种靶基因,因而在某些肿瘤中hMSH2基因失活可能不是由于基因突变,而是由于基因的调控异常所致。l另外目前对MMR基因的研究大多集中在HNPCC肿瘤中而对存在着微卫星不稳定性的多种类型散发性肿瘤中MMR基因变异的研究却很少。迄今仅在少数激发性结肠癌肿瘤组织和子宫内膜癌细胞系中检测了hMSH2基因的突变。 2 BRCA1基因基因 乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene,BRCA1)是遗传性乳腺癌卵巢癌综合征(her
80、editary breast cancer/ovarian cancer syndrome, HBOC)的易感基因。l1990年 Hall 等通过遗传连锁分析,发现了一个与家族性乳腺癌有关的癌症易感基因,与第17号染色体上的 17qD17S74微卫星位点连锁。l1991年Narod等调查了5个大型HBOC家系,进一步将该基因定位于17q12-23,并提出该基因除了与遗传性乳腺癌有关外,还与遗传性卵巢癌有关。l 1992年这一基因被命名为BRCA1。l1994年Skolnick研究小组克隆了BRCA1基因。 BRCA1基因由22个外显子组成,基因组DNA长 100 kb, mRNA全长7.8 k
81、b,编码含 1863个氨基酸残基的蛋白。 BRCA1蛋白的氨基端有一个常见于核酸结合蛋白的锌指结构,提示BRCA1可能有基因调节功能。 BRCA1的基因失活符合于Knudson提出的抑癌基因失活的二次打击模式。在生殖细胞中的一个等位基因由于缺失或突变而失活,当体细胞中另一个正常的等位基因再由于丢失或突变而失活时,则可使基因功能丧失,从而导致肿瘤的发生。 现有资料表明,生殖细胞中基因突变大部分是移码突变或无义突变。目前常见的突变位点位于外显子 11(48.5%),2(18.6%),20(9.2%),5(8.2%), 18及21(各占 3.l%)。外显子 11的突变更为多见,可能由于其片段较长,占
82、据了全部编码序列的60有关。 BRCA1基因突变的检测可应用单链构象 多态性分析(single strand DNA conformation polymorphism,SSCP), 异源双链分析,等位 基因特异性寡核着酸杂交法(ASO)及直接DNA测序等技术。 由于BRCA1的突变大部分是移码突变和无义突变,所以最近发展的用以检测终止突变的IVTT或称 PPT(protein-truncation test)法己被成功地用于检测 BRCA1最大的外显子 11和基因其他部分的 cDNA。 Claus等估计在群体中乳腺癌异常易感基因的频率是0.0033,亦即大约在150个妇女中有1个是易感者,然
83、而,由于现在估计HBOC家族中只有60与BRCA1连锁,所以异常BRCA1等位基因携带者的频率低于1:150,估计接近于1;500。 国际乳腺癌连锁协作组(breast cancer linkage consortium, BCLC )对有明显连锁家族的检查表明,BRCA1的外显率接近100。在50岁时估计为59(95CL39%72%),70岁时为82% (95%CL64%91%)。 现有的基因频率的资料主要是通过遗传流行病学研究以间接的方式所获得,在BRCA1基因被克隆后,已可采用直接检测大批群体样本中BRCA1突变的方法更精确地测出BRCA1的基因频率和外显率。 综上所述,BRCA1基因是
84、一个与HBOC发生发展有密切关系的抑癌基因,它的失活可导致细胞的恶性转化和肿瘤发生。BRCA1基因的突变率和外显率很高。在有家族史的高危人群中检测BRCA1突变对乳腺癌和卵巢癌患病风险评估、发病检测及早期诊断都有很重要的意义。 3.ATM基因基因 ATM基因是毛细血管扩张性共济失调综合征(ataxia telangiectasis,ATM)的易感基因。本病发现很早,被认为是一种遗传不稳定性肿瘤综合征。本病的易感基因近年来才分离到。 ATM基因定位于第11号染色体长臂(11q23),其基因产物与PI-3激酶参与磷酸肌醇代谢,而三磷酸肌醇是细胞增殖信息传递通路的第二信使。实验证明,ATM基因有缺陷
85、时,ATM蛋白向p53蛋白传递信息的功能遭到破化。由于本病常拌有免疫功能低下及多发性肿瘤倾向,所以被认为与DNA 损伤修复有关。 第三节第三节 基因诊断技术和方法基因诊断技术和方法 人类恶性肿瘤的演变过程复杂,是多步骤、多基因参与的分子事件,涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的丢失。基因诊断是在对恶性肿瘤发生、发展和转移的规律及其分子机制有了较为深入的了解之后发展起来的新兴诊断技术。 基因诊断技术根据原理主要分为两大类: 核酸分子杂交技术 PCR技术 一、核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交是指具有一定互补序列的核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对的原则结合成双链的过程,实质上是
86、以用于检测的已知序列DNA或RNA片段作为探针与待测样品DNA或RNA片段进行核酸分子杂交,它是基因诊断最基本的技术之一。 应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量的检测,如测定待定DNA序列的拷贝数、DNA区域的限制性内切酶图谱、粗略DNA序列的结构和定量等。核酸分子杂交技术有 Southern印迹杂交 点杂交 原位杂交 Northern印迹杂交 挂锁FISH 比较基因组杂交 DNA芯片 1 Southern印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交是研究DNA图谱的基本技术,在PCR产物和遗传疾病诊断分析方面有重要价值。 主要步骤:l由限制性内切酶酶切已纯化的DNA样品l琼脂糖凝
87、胶电泳分离酶切DNA片段并用变性液使凝胶上DNA变性l中和l预杂交l杂交l放射自显影l结果分析 实际上Southern印迹杂交是由两部分即Southern印迹和Southern杂交组成。 2点杂交(dot bloting) 是一种快速、简便检测微量DNA或RNA的方法,在确定DNA样品之间的同源性,或确定两个克隆DNA片段是否来源于同一DNA样品等方面具有特殊用途。 斑点杂交法是将样品点到一张硝酸纤维素膜上,并将膜按区域划分,点多个样品,烘烤固定,然后进行杂交。 3原位杂交(in situ hybridization) 组织原位杂交简称原位杂交,是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与R
88、NA或DNA杂交,杂交反应在载物片上的细胞内进行。 根据所用探针种类和要检测核酸的不同可分为 DNA-DNA、 RNA-DNA、 RNA-RNA杂交,其基本程序都是适当处理使细胞通透性增加,探针进入细胞内与DNA或RNA杂交,用放射自显影或免疫酶法显色杂交结果。 原位杂交可以用来确定探针的互补序列在细胞内的空间位置,用标记的探针在细胞中期DNA杂交以研究染色体中特定核酸序列,在与RNA的杂交可精确分析任何RNA在细胞和组织中的分布和特定基因表达水平。 4Northern印迹杂交(Northern bloting) 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转移到固体支持物上(硝酸纤维膜)然后进行杂交的方法,
89、此方法可用于测定RNA或mRNA分子量大小。基本原理与Southern印迹杂交相似操作程序略有差异。 5挂锁FISH 挂锁 FISH(FISH with padlock)又称缠扭 FISH( FISH with a twist),是由 Nilsson M等(1994年)首先采用的一种新技术,是在荧光原位杂交的基础上发展起来的。 所谓缠扭是指使用一个奇异的寡核背酸探针,当其两侧臂的序列与靶核酸序列完全互补并结合时,DNA连接酶就可以将其两侧端连接并形成一个环。此探针的中间部分为连接序列,其上有经-NH2化的胞嘧啶核苷酸残基,可与生物素或地高辛通过此-NH2连接而标记上。 在设计时,有意使寡核苷酸
90、探针两侧臂的序列与待测核酸中特定的有可能出现某个碱基突变的序列互补。当探针的两侧臂与靶核酸序列结合后,两端能紧靠在一起,可被连接酶连接成一条链,因而形成与靶序列紧密缠绕在一起的一个环,并固定于靶序列上,形似挂锁。 用此方法可以检测出靶核酸是否有某一个碱基的差异。在不同的挂锁探针上标上不同的标记物,如生物素或地高辛,则可以同时检测出DNA序列上多处可能出现的突变。 6 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH) 是一种改进的染色体荧光原位杂交,以肿瘤基因组DNA和正常参照组DNA为探针,用切口平移法分别标记上不同的荧光。 通常将肿瘤DNA用生物素
91、脱氧核苷酸标记,用荧光素异硫氰酸盐卵白素(Avidin-FITC)检测显绿色,参照基因组DNA用地高辛脱氧核苷酸标记,用罗丹明-抗地高辛显红色。 两种标记DNA以1:1比例混合作为探针。与正常人外周血白细胞的有丝分裂中期染色体进行染色体原位抑制杂交( chromosomal in situ suppression,CISS)。 杂交后的荧光信号用荧光显微镜连接计算机数字式图像分析系统对绿红荧光比值进行定量分析,根据两种荧光探针荧光信号强度差异,找出基因组中DNA的增加或缺失区域。 如肿瘤DNA中的基因扩增或染色体重复显现绿红荧光强度比值升高,而染色体的缺失或丢失表现为这种比值降低。 7DNA芯
92、片(DNA chiP)技术 是在发现多态性非常复杂的新的基因标记物基础上,多种学科技术巧妙联合应用而形成的一种崭新技术,是近几年发展起来的基因定位技术。 20世纪70年代以来,由于分子生物学的发展,基因标记物有限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记和数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)。 由于有众多标记物,Steven Fodor等人运用半导体集成电路和照相平板印刷技术,设计将几千万个核苷酸探针,按顺序列阵排列在约 1cm2的硅片上,在每一个列阵
93、点上以固相法合成15bp的探针,制成类似集成电路的DNA芯片; 另一方面将待测基因(DNA, cDNA或RNA)标记上特异的荧光物质,然后用荧光标记的DNA与芯片上的探针杂交,用激光共聚焦显微镜及计算机扫描系统对芯片的荧光信号进行扫描,通过计算机进行综合分析。 由于这类标记物只有2种等位型,利用两 种荧光信号就可检出某一个标记物。若利用 20003 000个这类标记物以构建每条染色体单体型,便达到250350个微卫星标记物的覆盖范围,但分辨率比其高45倍,而工作量只需作点杂交,使工作效率提高上百倍。二、二、PCR技术技术1基本原理 PCR是在试管中的DNA复制反应,基本原理与体内者相似,不同之
94、处是耐热Taq酶取代DNA聚合酶,用合成 DNA引物 RNA引物,用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的方法使DNA得以复制,反复进行变性、退火、延伸循环,就可使DNA无限扩增。 2常用的几种PCR反应 反转录 PCR 定量PCR 彩色 PCR 重组 PCR 不对称 PCR 膜PCR 固着PCR 原位 PCR 反向PCR (1)反转录 PCR(RT-PCR) 以 RNA分子为模板进行扩增。首先要进行反转录cDNA,然后进行常规PCR反应。使用本法甚至可对单个细胞中至少10个拷贝RNA进行定量。RT-PCR主要用于:克隆cDNA、检测RNA病毒、cDNA探针。(2)定量PCR 对
95、基因表达的研究有时需要定量,主要是mRNA定量,即转录水平的研究。定量时要设立内参照,并且参照基因与待测基因在同一反应管内进行。为进行PCR,需要经过RNA制备、反转录PCR、凝胶电泳、定量等步骤。 (3)碱基替代PCR 碱基替代PCR是指应用PCR技术掺入某种碱基的修饰类似物,这些类似物可以是脱氧尿嘧啶(dU)、脱氧次黄嘌吟(dI)、5-溴脱氧尿嘧啶(Br5dU)等。( 4)彩色 PCR(color complementation assay) 将PCR的引物 5端用荧光物质标记,就可进行彩色PCR。有不同色彩的荧光染料可供标记。用不同荧光标记的引物PCR扩增后,合成的产物就带有不同的染料。
96、经电泳或离心沉淀,PE计激发产物,或用紫外灯观察电泳结果,可见彩色产物。 (5)重组 PCR(recombined PCR) 为了研究基因的功能,需要对基因进行点突变,包括碱基替代、缺失或插入等,以观察基因功能的改变。以往的方法是用合成5端带点突变的引物,来复制完整的基因,这种突变仅限于5端。PCR使体外定点突变既简单又省时,而且可以 DNA任何位置定点突变,这一方法称为重组PCR。 (6)不对称 PCR(assymmetric PCR) DNA序列测定是分子生物学中必经的手续,经典的测序方法有Sangerhe和Maxam等方法。用PCR和经典方法进行测序,DNA测序更简便,并且已可自动化。测
97、序中的一个关键步骤是要生成DNA,利用不对称PCR可方便地制成DNA,其原理是两种引物使用不同浓度。(7)膜PCR(membran。bound PCR) 将模板DNA用一定方法固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再行PCR,这种方法称为膜PCR。此方法的优点是,DNA模板极少时用本法可以使膜上DNA模板重复使用,或DNA有严重污染时可多次漂洗来纯化模板。缺点是由于模板固定在膜上,扩增效率较低,需要增加循环次数。 ( 8)固着 PCR( anchored PCR,SA-PCR) 膜 PCR是将 DNA固定,固着 PCR是将引物固相化,再行PCR。此时PCR产物就被固相化,易于分离。需要快速方便地PCR
98、产物,均可使用这一技术。(9)原位 PCR(insitu PCR) 以上 PCR都是将DNA从组织或细胞中分离出来以后进行的,这样无法知道DNA在组织中的什么种类细胞中,在细胞中的什么位置,以及细胞在组织中的百分比等等。欲解决这些问题,就要使用原位PCR。(10)反向PCR(inverted PCR) PCR扩增是沿着已知序列方向进行的,若扩增是对已知序列两侧的未知序列进行的,则称为反向PCR。 突变分子的检测有多种方法。例如寡核苷酸探针(ASO)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、变性凝胶电泳(DGGE)及其他等等,而聚合酶链反应-单链构型多态性(PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析技术提供了简便、快速、经济的检测手段。