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1、液相色谱根底知识液相色谱实际开展简况液相色谱实际开展简况色谱法的分别原理是：溶于流动相色谱法的分别原理是：溶于流动相(mobile phase)(mobile phase)中的各组分经过固定相中的各组分经过固定相时，由于与固定相时，由于与固定相(stationary phase)(stationary phase)发生作用吸附、分配、离子吸引、发生作用吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从排阻、亲和的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨
2、维特色谱法最早是由俄国植物学家茨维特TswettTswett在在19061906年研讨用碳酸钙分年研讨用碳酸钙分别植物色素时发现的，色谱法别植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)(Chromatography)因之得名。后来在此根底因之得名。后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开场阶段是用大直径的玻璃管柱在室温暖常压下用液位差保送液相色谱法开场阶段是用大直径的玻璃管柱在室温暖常压下用液位差保送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长常有几个小时。流动相，称为经典液相色谱法，此
3、方法柱效低、时间长常有几个小时。高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography(High performance Liquid Chromatography，HPLC)HPLC)是在是在经典液相色谱法的根底上，于经典液相色谱法的根底上，于6060年代后期引入了气相色谱实际而迅速开年代后期引入了气相色谱实际而迅速开展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压保送流动相，故又称高压液相色谱法高柱效，但会引起高阻力，需用高压保
4、送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)HPLC)。又因分析速度快而称。又因分析速度快而称为高速液相色谱法为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)HSLP)。也称。也称现代液相色谱。现代液相色谱。色谱来源色谱来源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱经典液相色典液相色谱色谱分别的机理色谱分别的机理分别是一个物理的过程流动相流动相Mobile P
5、hase固定相固定相Stationary Phase样品溶解于流动相中的溶质样品溶解于流动相中的溶质色谱法分类色谱法分类 按两相的物理形状分：气相色谱法按两相的物理形状分：气相色谱法(GC)(GC)、 液相色谱法液相色谱法(LC)(LC)和超和超临界流体色谱法临界流体色谱法(SFC) (SFC) 。气相色谱法适用于分别挥发性化合物。气相色谱法适用于分别挥发性化合物。GCGC根据固定相不同又可分为气固色谱法根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)(GSC)和气液色谱法和气液色谱法(GLC)(GLC)，其中以，其中以GLCGLC运用最广。液相色谱法适用于分别低挥发性运用最广。液相色谱法适用于分别
6、低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。或非挥发性、热稳定性差的物质。LCLC同样可分为液固色谱法同样可分为液固色谱法(LSC)(LSC)和液液色谱法和液液色谱法(LLC)(LLC)。超临界流体色谱法以超临界流体界。超临界流体色谱法以超临界流体界于气体和液体之间的一种物相为流动相常用于气体和液体之间的一种物相为流动相常用CO2CO2，因其分，因其分散系数大，能很快到达平衡，故分析时间短，特别适用于手性化散系数大，能很快到达平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。合物的拆分。按原理分：吸附色谱法按原理分：吸附色谱法(AC)(AC)、分配色谱法、分配色谱法(DC)(DC)、离子交换色谱法、离
7、子交换色谱法(IEC)(IEC)、排阻色谱法、排阻色谱法(EC(EC，又称分子筛，又称分子筛) ) 、凝胶过滤、凝胶过滤(GFC)(GFC)、凝胶浸、凝胶浸透色谱法透色谱法(GPC(GPC和亲和色谱法和亲和色谱法, ,此外还有电泳。此外还有电泳。按操作方式分：纸色谱法按操作方式分：纸色谱法(PC)(PC)、薄层色谱法、薄层色谱法(TLC)(TLC)、柱色谱法、柱色谱法HPLC的特点和优点的特点和优点HPLCHPLC有以下特点：有以下特点：高压：压力可达高压：压力可达150150300Kg/cm2300Kg/cm2。高速：流速为高速：流速为0.1 0.1 10.0 mL/min 10.0 mL/
8、min。高效：可达高效：可达50005000塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达100100种。种。高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng0.01ng。同时耗费样品少。同时耗费样品少。HPLCHPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：速度快：通常分析一个样品在速度快：通常分析一个样品在15 15 30 min 30 min，有些样品甚至在，有些样品甚至在5 min5 min内内即可完成。即可完成。分辨率高：可选择固定相和流动相以到达最正确分别效果。分辨率高：可选择固定相和流动相以到达最正确分别效果。
9、灵敏度高：紫外检测器可达灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng0.01ng，荧光和电化学检测器可达，荧光和电化学检测器可达0.1pg0.1pg柱子可反复运用：用一根色谱柱可分别不同的化合物。柱子可反复运用：用一根色谱柱可分别不同的化合物。样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以搜集单一组样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以搜集单一组分或做制备。分或做制备。什么是高效液相色谱什么是高效液相色谱High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色高效液相色谱谱法，法，
10、简简称：称：HPLCHPLC是利用高是利用高压输压输液液泵泵将将规规定的流定的流动动相相泵泵入装有填充入装有填充剂剂的色的色谱谱柱，按照固液相之柱，按照固液相之间间的分配机理的分配机理对对混合混合物物进进展分展分别测别测定的色定的色谱谱方法。方法。广泛运用于各个广泛运用于各个领领域：域：医医药药 / / 环环保保 / / 石化石化 / / 生命科学生命科学 / / 食品及食品及农业农业在技在技术术，实际实际及运用上仍及运用上仍处处于开展于开展阶阶段段HPLC在药学中的运用在药学中的运用 含量测定最普遍运用含量测定最普遍运用 还包括有关物质检测，杂质还包括有关物质检测，杂质/ /有害物质限量检测
11、。有害物质限量检测。 指纹图谱检测指纹图谱检测 主要用于中药注射剂。主要用于中药注射剂。 鉴别鉴别 与薄层鉴别类似，被测物质与对照品具有一样保管时间相当与薄层鉴别类似，被测物质与对照品具有一样保管时间相当于具有一样于具有一样RfRf值，即初步以为同一物质。值，即初步以为同一物质。 纯度检测纯度检测 通常用面积归一化法检测对照品纯度。通常用面积归一化法检测对照品纯度。 分别纯化样品或制备对照品仅限制备型色谱分别纯化样品或制备对照品仅限制备型色谱高效液相色谱仪器引见高效液相色谱仪器引见HPLC的仪器配置的仪器配置色色色色谱泵谱泵自自自自动进样动进样器器器器柱温箱及色柱温箱及色柱温箱及色柱温箱及色谱
12、谱柱柱柱柱检测检测器器器器数据数据数据数据处处置系置系置系置系统统溶溶溶溶剂剂液相色液相色谱的根本流程的根本流程图流动相 泵泵色谱柱检测器输液系统分别系统分别系统 检测检测系系统统记录系统记录系统AEGBCDF进样阀进样系统进样系统P680A色谱泵前面板色谱泵前面板屏屏幕幕光光标标键键高高低低压压极极限限显显示示直直接接操操作作键键泵泵开开关关键键功功能能键键遥遥控控状状态态显显示示流速显示流速显示压力显示压力显示P680A色色谱泵谱泵内部构造内部构造混合腔混合腔混合腔混合腔真空脱气真空脱气真空脱气真空脱气泵泵 ( ( 在在在在线线脱气脱气脱气脱气) )压压力力力力传传感器感器感器感器蠕蠕蠕蠕
13、动泵动泵清洗瓶清洗瓶清洗瓶清洗瓶普通普通普通普通为为5050甲醇，每周甲醇，每周甲醇，每周甲醇，每周改改改改换换一次一次一次一次清洗阀清洗阀比例阀比例阀进口单向阀进口单向阀出口单向阀出口单向阀泵泵任务泵头任务泵头平衡泵头平衡泵头压力传感器压力传感器混合腔混合腔清洗阀清洗阀真空脱气泵真空脱气泵比例阀比例阀废液废液P680A LPG流路图流路图低压四元剃度泵只需一个泵，四个通道，溶液泵前混合低压四元剃度泵只需一个泵，四个通道，溶液泵前混合需配在线脱气机，由于容易构成气泡需配在线脱气机，由于容易构成气泡P680 HPG流路图流路图任务泵头任务泵头平衡泵头平衡泵头压力传感器压力传感器混合腔混合腔 清清
14、 洗洗 阀阀高压二高压二/四元剃度泵有二个泵，二四元剃度泵有二个泵，二/四个通道，溶液泵后混合四个通道，溶液泵后混合无需配在线脱气机，由于不容易构成气泡无需配在线脱气机，由于不容易构成气泡溶剂选择阀溶剂选择阀六通阀六通阀构造构造六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫样器，它是由圆形密封垫( (转子转子) )和固定底座和固定底座( (定子定子) )组成。美国组成。美国RheodyneRheodyne公司的六通阀进样器最为公司的六通阀进样器最为通用，各大通用，各大HPLCHPLC仪器制造商均以此产品作为仪仪器制造商均以此产品作为仪
15、器的进样器。器的进样器。任务原理任务原理手柄位进样手柄位进样(Load)(Load)位置时，样品经微量进样针从位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充溢后，多余样品进样孔注射进定量环，定量环充溢后，多余样品从放空孔排出；从放空孔排出； 将手柄转动至进样将手柄转动至进样(Inject)(Inject)位置位置时，阀与液相流路接通，由泵保送的流动相冲洗时，阀与液相流路接通，由泵保送的流动相冲洗定量环，推进样品进入液相分析柱进展分析。定量环，推进样品进入液相分析柱进展分析。六通阀进样演示六通阀进样演示单击单击NEXTNEXT播放播放如无法播放动画，请安装如无法播放动画，请安装shock
16、wave flash objectshockwave flash object控件控件高效液相色谱根本概念高效液相色谱根本概念色谱图：色谱图：HPLC图形结果图形结果Chromatogram色谱图即色谱柱流出物经过检测器时所产生的呼应信号对时间的色谱图即色谱柱流出物经过检测器时所产生的呼应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保管时间。曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保管时间。 色色谱峰峰保管时间保管时间min峰高峰高峰面积峰面积呼应值呼应值mAU基基线液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语色谱峰色谱峰 Peak Peak色谱柱流出组分经过检测器时产生的呼应信号的微分曲线色谱柱流出
17、组分经过检测器时产生的呼应信号的微分曲线峰底峰底 Peak Base Peak Base峰的起点与终点之间衔接的直线峰的起点与终点之间衔接的直线峰高峰高 Peak Height Peak Height峰最大值到峰底的间隔峰最大值到峰底的间隔峰宽峰宽 Peak Width Peak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的间隔在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的间隔半高峰宽半高峰宽 Peak Width at Half Height Peak Width at Half Height经过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两经过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相
18、交两点之间的间隔点之间的间隔液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语峰面峰面积积 Peak Area Peak Area峰与峰底之峰与峰底之间间的面的面积积, ,又称呼又称呼应值应值规规范偏向；范偏向； Standard Error Standard Error0.6070.607倍峰高倍峰高处处所所对应对应峰峰宽宽的一半的一半拖尾峰拖尾峰 Tailing Peak Tailing Peak后沿后沿较较前沿平前沿平缓缓的不的不对对称峰称峰前伸峰前伸峰 Leading Peak Leading Peak前沿前沿较较后沿平后沿平缓缓的不的不对对称峰称峰鬼峰鬼峰 Ghost Peak Ghost Pea
19、k并非由并非由试样试样所所产产生的峰；亦称假峰生的峰；亦称假峰液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语基线基线 Baseline Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的呼应信号的曲线在正常操作条件下，仅由流动相所产生的呼应信号的曲线基线飘移基线飘移 Baseline Drift Baseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；基线噪声；N N Baseline Noise Baseline Noise由各种要素所引起的基线动摇由各种要素所引起的基线动摇谱带扩展谱带扩展 Band Broadening Band Broadening由于纵向分散由于
20、纵向分散, ,传质阻力等要素的影响传质阻力等要素的影响, ,使组分在色谱柱内使组分在色谱柱内挪动过程中谱带宽度添加的景象挪动过程中谱带宽度添加的景象液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语死时间，死时间，t0 t0 Dead time Dead time不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间间保管时间，保管时间，tR tR Retention time Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积，死体积，V0 V0 Dead volume Dead volume不被固定相滞留
21、的组分，从进样到出现峰最大值所需的流不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积动相体积保管体积，保管体积，VR VR Retention volume Retention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱的根本参数色谱条件液相色谱的根本参数色谱条件流流动动相：种相：种类类及配比，等度或梯度及配比，等度或梯度有机相：甲醇、乙有机相：甲醇、乙腈腈。水相：水水相：水+ +改性改性剂剂。改性改性剂剂防止拖尾，防止拖尾，获获得更好的分得更好的分别别度和峰型度和峰型 酸酸0.40.4磷酸磷酸/ /醋酸溶液：分醋酸溶液：分别
22、别有机酸；有机酸； 碱碱0.10.1二乙胺二乙胺/ /三乙胺：分三乙胺：分别别生物碱；生物碱； 缓缓冲冲盐盐HAc-NaAcHAc-NaAc，H3PO4-NaH2PO4H3PO4-NaH2PO4：当加酸加碱无法：当加酸加碱无法获获得更好得更好 的分的分别别效果效果时时，思索加适当，思索加适当缓缓冲冲盐盐，让让其以其以盐类盐类方式存在。方式存在。色色谱谱柱柱/ /固定相：固定相：填料填料类类型型C18C18KromasilKromasil，DiamonsilDiamonsil，HypersilHypersil；粒径：粒径：5m5m；内径：；内径：4.6mm4.6mm；长长短：短：250mm250
23、mm、200mm200mm、150mm150mm。流速：通常流速：通常为为1mL/min1mL/min。测测定波定波长长：检测检测波波长长通常通常选择选择其最大吸收波其最大吸收波长长，200200380nm380nm紫外区。紫外区。柱温：常柱温：常设值设值：2525、 30 30、 40 40。进样进样量：通常量：通常为为1010或或20L20LHPLC根本操作过程根本操作过程预备预备 过滤流动相，并超声脱气过滤流动相，并超声脱气101020min20min。 翻开泵，柱温箱，检测器平衡翻开泵，柱温箱，检测器平衡30min30min后和计算机电源，并设定流动相及比例，柱后和计算机电源，并设定流
24、动相及比例，柱温。温。启开任务站、平衡系统、采集基线启开任务站、平衡系统、采集基线分析分析建立样品表：依次设置对照品样品信息样品称号、样品数、进样针数、进样量；建立样品表：依次设置对照品样品信息样品称号、样品数、进样针数、进样量；采集程序；积分方法；报告模板，序列称号。采集程序；积分方法；报告模板，序列称号。修正色谱条件：翻开程序文件，修正柱温、流动相比例、测定波长、运转时间等修正色谱条件：翻开程序文件，修正柱温、流动相比例、测定波长、运转时间等运转样品表：进样测定。运转样品表：进样测定。设置相关参数：在样品表中输入取样量、稀释因子等进样信息，并设置积分参数最设置相关参数：在样品表中输入取样量
25、、稀释因子等进样信息，并设置积分参数最小峰面积、积分时间等，设置峰表主峰保管时间和称号，定量方式峰面积或小峰面积、积分时间等，设置峰表主峰保管时间和称号，定量方式峰面积或峰高，对照品浓度等信息，自动计算含量。峰高，对照品浓度等信息，自动计算含量。报告输出。报告输出。关机关机运用终了，先关紫外运用终了，先关紫外/ /可见灯，再关检测器。可见灯，再关检测器。以适当溶剂冲洗色谱柱、进样器、进样针。确保冲洗干净后封锁电源。以适当溶剂冲洗色谱柱、进样器、进样针。确保冲洗干净后封锁电源。登记运用记录。登记运用记录。此为根本操作过程，详见规范操作规程。此为根本操作过程，详见规范操作规程。系统顺应性实验系统顺
26、应性实验系统顺应性实验即用各种类项下规定的对照品和条件对色谱系统进展实系统顺应性实验即用各种类项下规定的对照品和条件对色谱系统进展实验，应符合要求。否那么可对色谱分别条件作适当的调整。验，应符合要求。否那么可对色谱分别条件作适当的调整。实际板数实际板数n n主要调查柱效，药典通常要求不低于主要调查柱效，药典通常要求不低于30003000或或40004000。分别度分别度R R主要调查相邻色谱峰的分别效果，主要调查相邻色谱峰的分别效果， R R应大于应大于1.5 1.5 。拖尾因子拖尾因子T T主要调查峰对称性，峰高定量时主要调查峰对称性，峰高定量时T T应在应在0.950.951.051.05
27、间，峰面积定量可适间，峰面积定量可适当放宽至当放宽至0.80.81.21.2。反复性反复性主要调查丈量的精细度。取对照品溶液，延续进样主要调查丈量的精细度。取对照品溶液，延续进样5 5次，峰面积次，峰面积RSDRSD应应不大于不大于2 2。分别度和反复性是系统适用性实验中更具实意图义的参数分别度和反复性是系统适用性实验中更具实意图义的参数实际板数、分别度、拖尾因子普通任务站均可自动计算。实际板数、分别度、拖尾因子普通任务站均可自动计算。系统顺应性实验系统顺应性实验t t实际板数实际板数n n调查柱效调查柱效t t在选定的条件下，注入供试品溶液或各种类项下规定的对在选定的条件下，注入供试品溶液或
28、各种类项下规定的对照物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质照物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保管时间峰的保管时间tRtR以分钟或长度计，下同以分钟或长度计，下同, ,但应取一样单但应取一样单位和半顶峰宽位和半顶峰宽(Wh/2),(Wh/2),按下式计算色谱柱的实际板数。按下式计算色谱柱的实际板数。假设测得实际板数低于各种类项下规定的最小实际板数，假设测得实际板数低于各种类项下规定的最小实际板数，应改动色谱柱的某些条件如柱长、载体性能、色谱柱充应改动色谱柱的某些条件如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等，使实际板数到达要求。填的优劣等，使实际板数到达要求。式中式中:
29、:tRtR为为保管保管时间时间；Wh/2Wh/2为为半峰高半峰高处处的峰的峰宽宽；系统顺应性实验系统顺应性实验t t 分别度分别度R R 调查分别效果调查分别效果t t在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰定量峰与相邻峰的分别度。除另按下式计算待测峰定量峰与相邻峰的分别度。除另有规定，分别度应大于有规定，分别度应大于1.51.5。式中式中: :tR2tR2为为相相邻邻两峰中后一峰的保管两峰中后一峰的保管时间时间；tR1tR1为为相相邻邻两峰中后一峰的保管两峰中后一峰的保管时间时间；W1W1及及W2W2为为此相此相邻邻两峰
30、的峰两峰的峰宽宽。系统顺应性实验系统顺应性实验t t拖尾因子拖尾因子T T调查色谱峰对称性调查色谱峰对称性t t调查色谱峰的对称性，保证丈量的准确度。特别是采用峰调查色谱峰的对称性，保证丈量的准确度。特别是采用峰高法丈量时，应检查待测峰的高法丈量时，应检查待测峰的T T能否符合规定。除另有规能否符合规定。除另有规定外，定外，T T应在应在0.950.951.051.05之间。之间。式中式中: :W0.05hW0.05h为为5 5峰高峰高处处的峰的峰宽宽；d1d1为为峰峰顶顶点到峰前沿之点到峰前沿之间间的的间间隔。隔。系统顺应性实验系统顺应性实验反复性反复性 调查丈量的精细度调查丈量的精细度取各
31、种类项下的对照溶液，延续进样取各种类项下的对照溶液，延续进样5 5次，除另有规定外，次，除另有规定外，其峰面积丈量值的相对规范偏向应不大于其峰面积丈量值的相对规范偏向应不大于2.02.0。也可按。也可按各种类校正因子测定项下，配制相当于各种类校正因子测定项下，配制相当于8080、100100和和120120的对照品溶液，参与规定量的内标溶液，配成的对照品溶液，参与规定量的内标溶液，配成3 3种种不同浓度的溶液，分别进样不同浓度的溶液，分别进样2 2次，计算平均校正因子，其次，计算平均校正因子，其相对规范偏向也应不大于相对规范偏向也应不大于2.02.0。含量测定方法学调查含量测定方法学调查1.
32、1. 提取提取纯纯化方法化方法调查调查 提取方法：超声、索氏、回流、渗漉、浸提取方法：超声、索氏、回流、渗漉、浸渍渍等等 纯纯化方法：液化方法：液- -液萃取、固相萃取、大孔液萃取、固相萃取、大孔树树脂、中性氧化脂、中性氧化铝铝、聚、聚酰酰胺等胺等2. 2. 色色谱谱/ /测测定条件定条件选择选择检测检测波波长长的的选择选择：检测检测波波长长通常通常选择选择其最大吸收波其最大吸收波长长。色色谱谱柱柱选择选择：填料：填料选择选择： Kromasil Kromasil、DiamonsilDiamonsil、HypersilHypersil 柱柱长选择长选择：250mm250mm、200mm200m
33、m、150mm150mm 流流动动相种相种类选择类选择：有机相：有机相选择选择：甲醇、乙：甲醇、乙腈腈、甲醇、甲醇- -乙乙腈腈有机相添加，峰前移有机相添加，峰前移 水相水相选择选择：分：分别别皂苷皂苷类类等中性化合物可直接用水等中性化合物可直接用水 分分别别有机酸等酸性化合物加酸有机酸等酸性化合物加酸( (磷酸、醋酸磷酸、醋酸), ),并可并可调调理理pHpH值值(0.1(0.1、0.5%)0.5%) 分分别别生物碱等碱性化合物加碱生物碱等碱性化合物加碱( (二乙胺、三乙胺二乙胺、三乙胺) )，普通采用，普通采用0.1%0.1%浓浓度度 流流动动相配比相配比选择选择：等度洗脱：如甲醇：等度洗
34、脱：如甲醇- -水水1212 8888 剃度洗脱：如乙剃度洗脱：如乙腈腈-0.1-0.1磷酸，磷酸，0min0min，6565 4545；20min20min，8080 2020；40min40min，9595 5 5 柱温柱温选择选择：2525、 30 30、 40 40等柱温添加，峰前移等柱温添加，峰前移3. 3. 规规范品范品纯纯度度调查调查 采用面采用面积归积归一化法，一化法，应应大于大于9898。检测波长选择实例检测波长选择实例没食子酸紫外吸收图谱没食子酸紫外吸收图谱检测波长通常选择其最大吸收波长检测波长通常选择其最大吸收波长测定波长测定波长参比波长参比波长2：Off参比波长参比波长
35、1：300nm呼应值呼应值1呼应值呼应值2由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故为防止干扰，通常不宜选低波长做测定波长为防止干扰，通常不宜选低波长做测定波长含量测定方法学调查含量测定方法学调查4. 4. 线性实验线性实验绘制规范曲线，确定线性范围绘制规范曲线，确定线性范围( (回收率中高浓度组不能超越这个范围回收率中高浓度组不能超越这个范围) )5. 5. 精细度实验精细度实验 取同一样品或对照品，延续测定五次，峰面积取同一样品或对照品，延续测定五次，峰面积RSDRSD不得大于不得大于3 3。6. 6. 反复性实验反复性实验 取同一批号样品，按样品测定方法
36、操作，测定五份，样品含量取同一批号样品，按样品测定方法操作，测定五份，样品含量RSDRSD不不得大于得大于3 3 由于每份样品取样量不同，故应计算含量的由于每份样品取样量不同，故应计算含量的RSDRSD 。7. 7. 稳定性实验稳定性实验取同一样品，取同一样品， 分别于制备后分别于制备后0 0、2 2、4 4、8 8、1212、2424、36h36h测定，峰面积测定，峰面积RSDRSD不得大于不得大于3 3。通常调查。通常调查36h36h内的稳定性内的稳定性8. 8. 回收率实验回收率实验取同一样品，取同一样品， 分别添加高、中、低三组浓度对照品每组三份，测定分别添加高、中、低三组浓度对照品每
37、组三份，测定峰面积，并计算回收率，回收率应在峰面积，并计算回收率，回收率应在9595105105间，间，RSDRSD不大于不大于5 5。操。操作复杂的特殊样品要求在作复杂的特殊样品要求在9090110110 。高、中、低三组浓度与样品含量之比约为：高、中、低三组浓度与样品含量之比约为：1.21.2、1 1、0.80.8含量测定含量测定t t外标法外标法t t按各种类项下的规定，精细称按各种类项下的规定，精细称( (量量) )取对照品和供试品，配取对照品和供试品，配制成溶液，分别精细取一定量，注入仪器，记录色谱图，制成溶液，分别精细取一定量，注入仪器，记录色谱图，丈量对照品和供试品待测成分的峰面
38、积或峰高，按下丈量对照品和供试品待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量：式计算含量：t t由于微量注射器不易准确控制进样量，当采用外标法测定由于微量注射器不易准确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量或或自动进样器供试品中某杂质或主成分含量时，以定量或或自动进样器进样为好。进样为好。t t外标一点发为最常用的定量计算方法。外标一点发为最常用的定量计算方法。式中式中: :C C 为浓为浓度，度，A A为为峰面峰面积积；X X为为供供试试品，品，R R为对为对照品。照品。t t内标法内标法t t按各种类项下的规定，精细称量取对照品和内标物质，按各种类项下的规定，精细称量取
39、对照品和内标物质，分别配成溶液，精细量取各溶液，配成校正因子测定用的分别配成溶液，精细量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。丈量对照品对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。丈量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：式中式中: :C C 为浓为浓度，度，A A为为峰面峰面积积；S S为为内内标标物，物，R R为对为对照品。照品。 再取各种类项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色再取各种类项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，丈量供试品中待测成分或其杂质和内标物质的峰面积谱图，丈量
40、供试品中待测成分或其杂质和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：或峰高，按下式计算含量：式中式中: :C C 为浓为浓度，度，A A为为峰面峰面积积；S S为为内内标标物，物，X X为为供供试试品。品。加校正因子的主成分本身对照法加校正因子的主成分本身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分本身对照法。测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分本身对照法。在建立方法时，按各种类项下的规定，精细称量取杂在建立方法时，按各种类项下的规定，精细称量取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上法计算杂质的
41、校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各种类正文中，用于校正杂质子。此校正因子可直接载入各种类正文中，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作较正计算的杂质，通常以主成分的实测峰面积。这些需作较正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保管时间定位，其数值一并载入各种类项为参照采用相对保管时间定位，其数值一并载入各种类项下。下。测定杂质含量时，按各种类项下规定的杂质限制，将供试测定杂质含量时，按各种类项下规定的杂质限制，将供试品溶液稀释成与杂质限制相当的溶液作为对照溶液，进样，品溶液稀释成与杂质限制相当的溶液作为对照溶液，进样，调理仪器灵敏度以噪音程度可接受为
42、限或进样量以调理仪器灵敏度以噪音程度可接受为限或进样量以柱子不过载为限，使对照溶液的主成分色谱峰高约达满柱子不过载为限，使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的量程的10102525或其峰面积能准确积分通常含量低或其峰面积能准确积分通常含量低于于0.5%0.5%的杂质，峰面积的相对规范偏向的杂质，峰面积的相对规范偏向RSDRSD应小于应小于10%10%；含量在；含量在0.5%2%0.5%2%的杂质，峰面积的的杂质，峰面积的RSDRSD应小于应小于2%2%。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保样，供
43、试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保管时间的管时间的2 2倍，丈量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，倍，丈量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。较，依法计算各杂质含量。不加校正因子的主成分本身不加校正因子的主成分本身对对照法照法当没有当没有杂质对杂质对照品照品时时，也可采用不加校正因子的主成分本，也可采用不加校正因子的主成分本身身对对照法。同上述照法。同上述(3)(3)法配制法配制对对照溶液并照溶液并调调理理检测检测灵敏度灵敏度后，取供后，取供试试品溶液和品溶液和对
44、对照溶液适量，分照溶液适量，分别进样别进样，前者的，前者的记记录时间录时间除另有除另有规规定外，定外，应为应为主成分保管主成分保管时间时间的的2 2倍，丈量倍，丈量供供试试品溶液色品溶液色谱图谱图上各上各杂质杂质的峰面的峰面积积并与并与对对照溶液主成分照溶液主成分的峰面的峰面积积比比较较，计计算算杂质杂质含量。含量。假假设设供供试试品所含的部分品所含的部分杂质杂质未与溶未与溶剂剂峰完全分峰完全分别别，那么按，那么按规规定先定先记录记录供供试试品溶液的色品溶液的色谱图谱图，再，再记录记录等体等体积纯积纯溶溶剂剂的色的色谱图谱图。色。色谱图谱图上上杂质杂质峰的峰的总总面面积积包括溶包括溶剂剂峰，峰
45、，减去色减去色谱图谱图上的溶上的溶剂剂峰面峰面积积，即，即为总杂质为总杂质峰的校正面峰的校正面积积。然后依法然后依法计计算。算。面面积归积归一化法一化法 由于峰面由于峰面积归积归一化法一化法测测定定误误差大，因此，本法通常只能用差大，因此，本法通常只能用于粗略于粗略调查调查供供试试品中的品中的杂质杂质含量。除另有含量。除另有规规定外，普通不定外，普通不宜用于微量宜用于微量杂质杂质的的检查检查。方法是丈量各。方法是丈量各杂质杂质峰的面峰的面积积和色和色谱图谱图上除溶上除溶剂剂峰以外的峰以外的总总色色谱谱峰面峰面积积，计计算各峰面算各峰面积积占占总总峰面峰面积积的百分率。的百分率。 常用于常用于调
46、查对调查对照品含量能否到达照品含量能否到达9898。HPLC含量测定运用实例含量测定运用实例 黄金咽喉片中黄金咽喉片中绿绿原酸的含量原酸的含量测测定定黄金咽喉片是由黄花蒿、金黄金咽喉片是由黄花蒿、金银银花、青果、花、青果、乌乌梅、甘草和薄荷等梅、甘草和薄荷等多味中多味中药药提取的有效部位及有效成分提取的有效部位及有效成分组组成的复方制成的复方制剂剂。实验实验采采用用HPLCHPLC测测定金定金银银花所含的主要有效成分花所含的主要有效成分绿绿原酸原酸 。色色谱谱条件条件色色谱谱柱：柱：Dikma Kromasil C18Dikma Kromasil C18250 mm4.6 mm250 mm4.
47、6 mm，5 m5 m；流流动动相：甲醇相：甲醇0.40.4磷酸溶液磷酸溶液2626 7474；检测检测波波长长：326 nm326 nm；柱温：柱温：3030；流速：流速：0.8 mLmin-10.8 mLmin-1；进样进样量：量：10 L10 L。HPLC含量测定运用实例含量测定运用实例试试液的制液的制液的制液的制备备 对对照品溶液照品溶液照品溶液照品溶液 绿绿原酸原酸原酸原酸对对照品适量，精照品适量，精照品适量，精照品适量，精细细称定，置棕色量瓶中，加称定，置棕色量瓶中，加称定，置棕色量瓶中，加称定，置棕色量瓶中，加5050甲醇甲醇甲醇甲醇制成每制成每制成每制成每1 mL1 mL含含含
48、含绿绿原酸原酸原酸原酸80 g80 g的溶液，即得。的溶液，即得。的溶液，即得。的溶液，即得。供供供供试试品溶液品溶液品溶液品溶液 取分量差取分量差取分量差取分量差别项别项下的本品下的本品下的本品下的本品2020片，精片，精片，精片，精细细称定，研称定，研称定，研称定，研细细，取，取，取，取约约0.5 g0.5 g，精精精精细细称定，置具塞称定，置具塞称定，置具塞称定，置具塞锥锥形瓶中，精形瓶中，精形瓶中，精形瓶中，精细细参与参与参与参与5050甲醇甲醇甲醇甲醇50 mL50 mL，称定分量，超声，称定分量，超声，称定分量，超声，称定分量，超声处处置置置置45 min45 min，取出，放冷，
49、再称定分量，用，取出，放冷，再称定分量，用，取出，放冷，再称定分量，用，取出，放冷，再称定分量，用5050甲醇甲醇甲醇甲醇补补足减失的分量，足减失的分量，足减失的分量，足减失的分量，摇摇匀，匀，匀，匀，滤过滤过，即得。，即得。，即得。，即得。阴性阴性阴性阴性对对照溶液照溶液照溶液照溶液 取按取按取按取按处处方比例及制方比例及制方比例及制方比例及制备备工工工工艺艺制得不含金制得不含金制得不含金制得不含金银银花提取物的阴性花提取物的阴性花提取物的阴性花提取物的阴性对对照照照照样样品，按供品，按供品，按供品，按供试试品溶液的制品溶液的制品溶液的制品溶液的制备备方法制成阴性方法制成阴性方法制成阴性方法
50、制成阴性对对照溶液。照溶液。照溶液。照溶液。系系系系统顺应统顺应性性性性实验实验 分分分分别别精精精精细细汲取汲取汲取汲取对对照品溶液、供照品溶液、供照品溶液、供照品溶液、供试试品溶液、缺金品溶液、缺金品溶液、缺金品溶液、缺金银银花提取物的阴性花提取物的阴性花提取物的阴性花提取物的阴性对对照溶液照溶液照溶液照溶液各各各各10 L10 L，注入高效液相色，注入高效液相色，注入高效液相色，注入高效液相色谱仪谱仪，记录记录色色色色谱图谱图，见见以下以下以下以下图图。从。从。从。从图图中可中可中可中可见见，绿绿原酸的保管原酸的保管原酸的保管原酸的保管时间约为时间约为10.5 min10.5 min，绿
51、绿原酸峰与其前后色原酸峰与其前后色原酸峰与其前后色原酸峰与其前后色谱谱峰的分峰的分峰的分峰的分别别度分度分度分度分别别为为3.783.78、4.274.27，拖尾因子，拖尾因子，拖尾因子，拖尾因子为为1.021.02，实际实际塔板数以塔板数以塔板数以塔板数以绿绿原酸峰原酸峰原酸峰原酸峰计为计为93139313，绿绿原原原原酸峰酸峰酸峰酸峰纯纯度因子度因子度因子度因子为为10001000，阴性，阴性，阴性，阴性对对照在照在照在照在绿绿原酸峰原酸峰原酸峰原酸峰处处无干无干无干无干扰扰，即本，即本，即本，即本实验实验条件下条件下条件下条件下绿绿原酸与其它原酸与其它原酸与其它原酸与其它组组份分份分份分
52、份分别别完全。完全。完全。完全。HPLC含量测定运用实例含量测定运用实例A B C A B C A. A. 绿原酸对照品；绿原酸对照品；B. B. 供试品；供试品；C. C. 阴性对照；阴性对照；1. 1. 绿原酸绿原酸测定法测定法分别精细汲取对照品溶液和供试品溶液各分别精细汲取对照品溶液和供试品溶液各10uL10uL，按上述色谱条件测定，记录绿原酸的峰面积，并按上述色谱条件测定，记录绿原酸的峰面积，并按外标法计算绿原酸的含量。按外标法计算绿原酸的含量。结果：绿原酸峰面积供试品为：结果：绿原酸峰面积供试品为：30.156230.1562，对照，对照品为：品为：28.628828.6288HPL
53、C含量测定运用实例含量测定运用实例正反相色谱正反相色谱液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)(NPC)和反相色谱法和反相色谱法(RPC)(RPC)。正相色谱法正相色谱法采用极性固定相采用极性固定相( (如聚乙二醇、氨基与腈基键合相如聚乙二醇、氨基与腈基键合相) )；流动相为相对；流动相为相对非极性的疏水性溶剂非极性的疏水性溶剂( (烷烃类如正已烷、环已烷，常参与乙醇、烷烃类如正已烷、环已烷，常参与乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调理组分的保管时间。常用于分异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调理组分的保管时间。常用于分别
54、中等极性和极性较强的化合物别中等极性和极性较强的化合物( (如酚类、胺类、羰基类及氨基酸如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。类等。反相色谱法反相色谱法普通用非极性固定相如普通用非极性固定相如C18C18、C8C8；流动相为水或缓冲液，常；流动相为水或缓冲液，常参与甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂参与甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调理保管时间。适用于分别非极性和极性较弱的化合物。以调理保管时间。适用于分别非极性和极性较弱的化合物。RPCRPC在现代液相色谱中运用最为广泛，据统计，它占整个在现代液相色谱中运用最为广泛，据统计，它占整个HPLCHPLC运
55、用的运用的80%80%左右。左右。正相色谱法与反相色谱法比较正相色谱法与反相色谱法比较从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界限如氨基键合固定相。没有明显的界限如氨基键合固定相。高效液相色谱仪的保养高效液相色谱仪的保养HPLC的环境设置的环境设置HPLCHPLC的日常操作条件：温度：的日常操作条件：温度：10103030；相；相对对湿度湿度8080； 最好是恒温、恒湿，最好是恒温、恒湿，远远离高离高电电磁干磁干扰扰、高振、高振动设备动设备，有良好的通，有良好的通风设备风设备。HPLC用水可以经过以下几个方面来得到：用水可以
56、经过以下几个方面来得到：1 1 专门专门的的纯纯水机或超水机或超纯纯水机；水机；2 2 去离子水重蒸；去离子水重蒸；3 3 二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水；4 4 采用采用类类似家用的似家用的纯纯水机；水机；5 5 市市场场上瓶装的上瓶装的纯纯真水或蒸真水或蒸馏馏水，如：娃哈哈水，如：娃哈哈纯纯真水；真水；6 6 其它途径；其它途径； 不不论论采用何种途径，配制流采用何种途径，配制流动动相运用新相运用新颖颖水，水水，水质质越高越高放置放置时间时间越短。越短。 理想的理想的HPLCHPLC用水用水应为应为18.218.2的超的超纯纯水，并水，并经过经过0.22m0.22m的的滤滤膜，除去膜，
57、除去热热源、有机物、无机离子及空气等。源、有机物、无机离子及空气等。HPLC六通阀进样器的保养六通阀进样器的保养虽虽然六通然六通阀进样阀进样器具有构造器具有构造简单简单、运用方便、寿命、运用方便、寿命长长、日常无需、日常无需维维修修等特点，但正确的运用和等特点，但正确的运用和维护维护将能添加运用寿命，将能添加运用寿命，维护维护周周边设备边设备，同，同时时添加分析准确度。如运用得当的添加分析准确度。如运用得当的话话，六通，六通阀进样阀进样器普通可延器普通可延续进样续进样3 3万次而无需万次而无需维维修。修。 手柄手柄处处于于LoadLoad和和InjectInject之之间时间时，由于，由于暂时
58、暂时堵住了流路，流路中堵住了流路，流路中压压力力骤骤增，再增，再转转到到进样进样位，位，过过高的高的压压力在柱力在柱头头上引起上引起损损坏，所以坏，所以应应尽快尽快转转动阀动阀，不能停留在中途。在，不能停留在中途。在HPLCHPLC系系统统中运用的注射器中运用的注射器针头针头有有别别于气于气相色相色谱谱，是平，是平头头注射器。一方面，注射器。一方面，针头针头外外侧紧贴进样侧紧贴进样器密封管内器密封管内侧侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头针头刺坏密刺坏密封封组组件及定子。件及定子。 六通六通阀进样阀进样器的器的进样进样方式
59、有部分装液法和完全装液法两种。运用部方式有部分装液法和完全装液法两种。运用部分装液法分装液法进样时进样时，进样进样量最多量最多为为定量定量环环体体积积的的7575，如，如20L20L的定量的定量环环最多最多进样进样15L15L的的样样品，并且要求每次品，并且要求每次进样进样体体积积准确、一准确、一样样；运用完；运用完全装液法全装液法进样时进样时，进样进样量最少量最少为为定量定量环环体体积积的的3 3至至5 5倍，即倍，即20L20L的定的定量量环环最少最少进样进样6060至至100L100L的的样样品，品，这样这样才干完全置才干完全置换样换样品定量品定量环环内残内残留的溶液，到达所要求的精留的
60、溶液，到达所要求的精细细度及重度及重现现性。引荐采用性。引荐采用100ul100ul的平的平头进头进样针样针配合配合20ul20ul满环进样满环进样。 HPLC六通阀进样器的保养六通阀进样器的保养可根据可根据进样进样体体积积的需求自已制造定量的需求自已制造定量环环，普通不要求准确，普通不要求准确计计算定量算定量环环的体的体积积，譬如，一根名，譬如，一根名义义上上10L10L的定量的定量环环，实实践是践是9L9L还还是是11L11L并不并不重要，由于被重要，由于被测样测样品和校正品和校正样样品的品的进样进样体体积坚积坚持一致，在持一致，在计计算算结结果果时时误误差都被抵消了。差都被抵消了。进样样
61、进样样品要求无微粒和能阻死品要求无微粒和能阻死针头针头及及进样阀进样阀的物的物质质，样样品溶液均要用品溶液均要用0.45m0.45m的的滤滤膜膜过滤过滤。防止微粒阻塞。防止微粒阻塞进样阀进样阀和减少和减少对进样阀对进样阀的磨的磨损损。为为防止防止缓缓冲冲盐盐和其它残留物和其它残留物质质留在留在进样进样系系统统中，每次中，每次终终了后了后应应冲洗冲洗进样进样器，通常用不含器，通常用不含盐盐的稀的稀释剂释剂、水或不含、水或不含盐盐的流的流动动相冲洗，在相冲洗，在进样阀进样阀的的LoadLoad和和InjectInject位置反复冲洗，再用无位置反复冲洗，再用无纤维纸纤维纸擦擦净净注射器注射器针头针
62、头的外的外侧侧。泵的保养泵的保养运用流动相尽量要清洁；运用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀； 防止泵内堵塞或有气泡；防止泵内堵塞或有气泡；每次分析终了后，要反复冲洗进样口，防止样品每次分析终了后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。的交叉污染。色谱柱的保养色谱柱的保养柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或剧剧烈震烈震动动；当柱子和色当柱子和色谱仪结谱仪结合合时时，阀阀件或管路一定要清洗干件或管路一定要清洗干净净；要留意流要留意流动动相的脱气；相的脱气；防止运用高粘度的溶防止运
63、用高粘度的溶剂剂作作为为流流动动相；尽量防止用相；尽量防止用缓缓冲冲盐盐特特别别是磷酸是磷酸盐盐。进样样进样样品要提品要提纯纯；严厉严厉控制控制进样进样量；量；每天分析任每天分析任务终务终了后，要清洗了后，要清洗进样阀进样阀中残留的中残留的样样品；品；每天分析每天分析测测定定终终了后，都要用适当的溶了后，都要用适当的溶剂剂来清洗柱；流来清洗柱；流动动相中含酸、相中含酸、缓缓冲冲盐类盐类均均应应先用甲醇先用甲醇- -水水5 5 9595冲洗至中性再用甲醇以冲洗至中性再用甲醇以1mL/min1mL/min的流速冲的流速冲洗洗约约20min20min，假，假设设含二乙胺之含二乙胺之类类可直接用甲醇冲
64、用水很可直接用甲醇冲用水很难难冲洗至中性。冲洗至中性。假假设设分析柱分析柱长长期不运用，运用适当有机溶期不运用，运用适当有机溶剂剂保管并封保管并封锁锁。紫外灯的保养紫外灯的保养在分析前、柱平衡得差不多时，再翻开检测器；在分析前、柱平衡得差不多时，再翻开检测器；在分析完成后，马上封锁检测器。在分析完成后，马上封锁检测器。防止频繁封锁检测器开关一次氘灯，相当于损防止频繁封锁检测器开关一次氘灯，相当于损失失30h30h的寿命。的寿命。样品池要假设受污染可用异丙醇冲洗。样品池要假设受污染可用异丙醇冲洗。联络方式联络方式 毕业设计时有液相相关和药学图像处置相关问题毕业设计时有液相相关和药学图像处置相关问题可联络：可联络：lyhb2021126lyhb2021126
