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1、细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养技术培养技术细胞系的建立和鉴定细胞系的建立和鉴定培养物的固定、染色培养物的固定、染色显微镜观察显微镜观察1 1优质课件优质课件1、细胞培养技术、细胞培养技术细胞原代培养细胞原代培养细胞传代培养细胞传代培养细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏细胞的运输细胞的运输2 2优质课件优质课件1.1.1 1 细胞的原代培养细胞的原代培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、
2、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养脏器等更容易进行原代培养3 3优质课件优质课件意义原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。原来组织的特性。利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学方面）效果很好。方面）效果很
3、好。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。4 4优质课件优质课件掌握无菌操作技术掌握无菌操作技术了解小鼠解剖操作技术了解小鼠解剖操作技术了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解培养细胞的消化分散了解培养细胞的消化分散了解倒置显微镜的使用了解倒置显微镜的使用原代细胞培养的原代细胞培养的实验目的和要求实验目的和要求5 5优质课件优质课件实验材料实验材料实验动物实验动物：孕鼠或新生小鼠：孕鼠或新生小鼠 液体液体：细胞生长液（内含：细胞生长液（内含20%20%小牛血清）小牛血清）0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶平
4、衡盐溶液平衡盐溶液70%70%乙醇乙醇器材器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯6 6优质课件优质课件原代细胞培养方法原代细胞培养方法胰酶消化法组织块直接培养法冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化 消化法：消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官）采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经从动物体内取出，经酶消化酶消化处理，使分散成单个细胞，处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。7 7优
5、质课件优质课件贴块法贴块法消化法消化法原原代代培培养养方方法法分分类类8 8优质课件优质课件分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类9 9优质课件优质课件外植块培养步骤图解外植块培养步骤图解1010优质课件优质课件操作步骤操作步骤1 1 - - 取材取材 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 把整个孕鼠浸入盛有把整个孕鼠浸入盛有7575乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。后放在大平皿中携入超净台。 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。镊子将皮肤
6、扯向后腿。 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。置于无菌的培养皿上。 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。直至清洗液清亮为止。1111优质课件优质课件操作步骤操作步骤2 2 - -切割切割将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，将部分胚胎转移至一个无菌小
7、瓶中，用用平衡平衡盐溶液盐溶液漂洗漂洗。然后用眼科手术剪刀然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎小心地绞碎胚胎，直到，直到成成1mm1mm3 3左右的小块，再用左右的小块，再用平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，清洗，洗到组织块发白为止。洗到组织块发白为止。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。1212优质课件优质课件1313优质课件优质课件胰酶消化法操作步骤胰酶消化法操作步骤 - - 消化、接种培养消化、接种培养 视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍的倍的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-40min20-40min，每隔，每隔5min5m
8、in振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 加入加入3-5ml3-5ml细胞生长液细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 静置静置5-10min5-10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 1000rpm1000rpm，离心，离心5-10min5-10min，弃上清液。，弃上清液。 加入加入平衡盐溶液平衡盐溶液5ml5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 加入加入细胞生长液细胞生长液l-2mll-2ml（
9、视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。 将细胞调整到将细胞调整到5105105 5/ml/ml左右，转移至左右，转移至25ml25ml细胞培养瓶中，细胞培养瓶中，3737下培养。下培养。1414优质课件优质课件胰酶消化法操作步骤胰酶消化法操作步骤 - - 消化、接种培养消化、接种培养也可将此步骤简化为：也可将此步骤简化为：视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍的倍的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-4020-40minmin，每隔，每隔5min5min振荡一次。振荡一次。静置，吸去上清，用静置，吸去上清，用细胞生长液细胞生长液漂洗消化后的组织块
10、，用漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。织块下沉。取细胞悬液接种至加了取细胞悬液接种至加了细胞生长液细胞生长液的培养瓶中（调整细胞的培养瓶中（调整细胞浓度到浓度到5105105 5/ml/ml左右），左右），3737下培养。下培养。（注意：省略了离心、计数等步骤）（注意：省略了离心、计数等步骤）1515优质课件优质课件组织块直接培养法组织块直接培养法操作步骤操作步骤 组织块接种：将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将翻转瓶底朝上，将细胞生长液细胞生长
11、液加至瓶中，培加至瓶中，培养液勿接触组织块。养液勿接触组织块。3737静置静置3-5h3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入浸入细胞生长液细胞生长液中（勿使组织漂起），中（勿使组织漂起），3737继续培养。继续培养。1616优质课件优质课件原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5-7 d5-7 d即可形成单层即可形成单层1717优质课件优质课件1.1.2 2 传代细胞培养传代细胞培养 细胞细胞“ “一代一代” ”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细
12、胞世代指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增或倍增不同。在一代中，细胞培增3-63-6次次 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:21:2或或1:31:3以上的比以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养传代培养。 也是一种也是一种将细胞种保存下去的方法将细胞种保存下去的方法。同时也是。同时也是利用培养细胞进行各利用培养细胞进行各种实验的必经过程种实验
13、的必经过程。 悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。1818优质课件优质课件细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种。种。1. 1. 悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/ /分分）去上清，沉淀物加新培养液后再）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-1/2-2
14、/32/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2. 2. 半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（HeLaHeLa细胞）细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3. 3. 贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用消化液是采用酶消化法传代。常用消化液是0.250.25胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。1919优质课件优质课件消化法传代培养步
15、骤消化法传代培养步骤2020优质课件优质课件选选取生取生长长良好的良好的细细胞，在超胞，在超净净工作台的酒精灯工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培养旁，倒去瓶中的旧培养液，加入液，加入2 2- -3 3 mlml的的D-HanksD-Hanks液，液，轻轻轻轻振振荡荡漂洗漂洗细细胞，以除去胞，以除去悬悬浮在浮在细细胞表面的碎片胞表面的碎片( (思考：思考：还还有什么作用？）有什么作用？）加入适量加入适量0 0.1-.1-0.250.25胰蛋白胰蛋白酶酶消化液，室温消化，倒置消化液，室温消化，倒置显显微微镜镜下下观观察，察，待待细细胞胞单层单层收收缩缩突起出突起出现现空隙空隙时时，倒去，倒去酶酶液
16、液用用HanksHanks液洗液洗涤涤1 1次，加入适量培养液，反复吹打次，加入适量培养液，反复吹打细细胞，使其成胞，使其成细细胞胞悬悬液。液。以以1 1: :2 2或或1 1: :3 3进进行分装，并在培养瓶上做好行分装，并在培养瓶上做好标标 记记，注明代号、日期，注明代号、日期，轻轻轻摇轻摇匀，匀，37CO37CO2 2培养箱培养。培养箱培养。 观观察：察：细细胞培养胞培养24h24h后，即可后，即可观观察培养液的察培养液的颜颜色及色及细细胞的生胞的生长长情况。情况。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法2121优质课件优质课件传代细胞培养结果传代细胞培养结果一般情况，传代后的细胞在2h
17、时左右就能附着在培养瓶壁上，2-4d就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代2222优质课件优质课件取生取生长长良好的良好的细细胞，在超胞，在超净净工作台用无菌吸管工作台用无菌吸管 把培养瓶把培养瓶中的中的细细胞吹打均匀。胞吹打均匀。转转移到无菌的离心管中，盖移到无菌的离心管中，盖紧紧胶盖，平衡后离心胶盖，平衡后离心（10001000r rpmpm/min/min）5min5min。( (区区别贴别贴壁壁传传代代) )在超在超净净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打管吹打细细胞，制成胞，制成悬悬液。液。以以1 1: :2 2或或1 1: :3
18、3进进行分装，并在培养瓶上做好行分装，并在培养瓶上做好标记标记，注明代，注明代号、日期，号、日期，轻轻摇轻轻摇匀，匀，37CO37CO2 2培养箱培养。培养箱培养。观观察：察：细细胞培养胞培养24h24h后，即可后，即可进进行行观观察。察。悬液细胞的传代培养悬液细胞的传代培养2323优质课件优质课件要要预预先与先与临临床外科医生和床外科医生和护护士商量士商量，并做好一切必要的并做好一切必要的准准备备工作。争取拿到的工作。争取拿到的标标本新本新鲜鲜、无菌、少坏死等。、无菌、少坏死等。 联联系好手系好手术时间术时间后，立即做好如下准后，立即做好如下准备备工作：准工作：准备备1-21-2个个贮贮有培
19、养液和抗生素的有培养液和抗生素的标标本收集瓶，将盖盖本收集瓶，将盖盖紧紧，保持无，保持无菌，瓶外菌，瓶外贴贴上上标签标签，写上工作人，写上工作人员员名字、地点和名字、地点和电话电话号号码码；将收集瓶送往医院，并与医生和；将收集瓶送往医院，并与医生和护护士士讲讲清取手清取手术标术标本的部位及注意事本的部位及注意事项项。1.3 1.3 人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料2424优质课件优质课件标标本放入收集瓶后，送出手本放入收集瓶后，送出手术间术间，立即送往，立即送往组织组织培养培养实验实验室。工作人室。工作人员员最好是等在手最好是等在手术间术间外。但有外。但有时时手手术时间难术时间
20、难以掌握。以掌握。则请护则请护士将收集士将收集材料的瓶子盖好后，放入材料的瓶子盖好后，放入44冰箱，尽快打冰箱，尽快打电话电话通知工作人通知工作人员员。取取临临床床标标本本时时，虽虽然尽可能做到无菌操作，但仍有然尽可能做到无菌操作，但仍有污污染可能性的存在。染可能性的存在。可可选选用抗生素用抗生素类类控制控制污污染。如手染。如手术标术标本比本比较较大（大（约约200mg200mg以上），可以上），可将其浸于将其浸于70%70%酒精中酒精中约约30-6030-60秒，秒，这样这样会减少表面会减少表面污污染而不染而不损损坏内部坏内部组组织织的的结结构和存活。不要用构和存活。不要用纱纱布包裹布包裹标
21、标本，本，纱纱布布纤维纤维易粘附在易粘附在组织组织上。上。人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料2525优质课件优质课件整个取材整个取材过过程中，都要注意保持程中，都要注意保持组织组织的湿的湿润润，随，随时给组织时给组织块块滴加一些培养液或平衡滴加一些培养液或平衡盐盐溶液。一般情况下，最好是使溶液。一般情况下，最好是使用用冰冷的冰冷的液体。液体。在剪碎或切割在剪碎或切割组织块时组织块时，尽量使用，尽量使用锋锋利的利的刀剪，防止以刀剪，防止以钝钝器器对组织对组织揉、捻、撕拉等而造成揉、捻、撕拉等而造成细细胞胞损伤损伤。整个取材整个取材过过程程耗耗时时越短越短越好。在万不得已的情况下，取
22、材越好。在万不得已的情况下，取材后也可将后也可将组织贮组织贮存在冷的存在冷的(4(4 )含平衡含平衡盐盐溶液溶液( (或其它或其它缓缓冲冲盐盐溶液溶液) )的的营营养液中，最好不超养液中，最好不超过过2424- -4848 h(h(视视不同不同组织类组织类型型而定而定) )。需要注意的事需要注意的事项2626优质课件优质课件1.4 1.4 培养细胞生长测定培养细胞生长测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 任任何何培培养养瓶瓶内内生生长长的的细细胞胞都都由由死死细细胞胞和和活活细细胞胞组组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。成，从形态上区别死、活细
23、胞是困难的。方法：方法：细胞计数法细胞计数法台盼蓝染色法台盼蓝染色法生长曲线法生长曲线法四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法2727优质课件优质课件细胞计数细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数血细胞计数板人工计数 细胞计数器细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)(Neubauer)血细胞计数板。血细胞计数板。 2828优质课件优质课件细胞计数细胞计数实验原理实验原理实验原理实验原理：血球计数盘一般有二个血球计数盘一般有二个
24、chamberschambers，每个，每个chamberchamber中细刻中细刻9 9个个1m1mmm2 2 大正方形，其中大正方形，其中4 4个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻1616个个小格，深度均为小格，深度均为0.1mm0.1mm。当。当chamberchamber上方盖上盖玻片后，上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为每个大正方形之体积为1 1mmmm2 20.1mm=1.0100.1mm=1.010-4-4mlml。使用。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以再乘以10104 4，即为每，即为每mlml中
25、之细胞数目。中之细胞数目。存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。2929优质课件优质课件细胞计数细胞计数 具体操作具体操作具体操作具体操作： 1. 1.将计数板及盖片用将计数板及盖片用75%75%酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板。酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板。 2. 2.吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置盖片和计数板之间，静置3min3min，注意盖片下不要有气泡
26、，也，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。不能让悬液流入旁边槽中。 3.3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：然后按公式计算：细胞数细胞数/mL=/mL=四大格细胞总数四大格细胞总数/410/4104 4 稀释倍数稀释倍数注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液3030优质课件优质课件由于由于由于由于死细胞死细胞死细胞死细胞的的的的细胞膜通透性细胞膜通透性细胞膜通透性细胞膜通透性发生改变，某些染料可发生改变，某些染料可发生改变，某些染
27、料可发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞呈色呈色呈色呈色。而。而。而。而活细胞活细胞活细胞活细胞反反反反之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色不易着色不易着色不易着色。此。此。此。此法的原理即是法的原理即是法的原理即是法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应而而而而区分开两种细胞。区分开两种细胞。区分开两种细胞。
28、区分开两种细胞。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2 min2 min2 min2 min）。）。）。）。台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法3131优质课件优质课件将将1 1滴细胞悬液滴细胞悬液( (贴壁细胞可经贴壁细胞可经0.250.25胰蛋白酶溶胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液液消化后，吹打制成细胞悬液) )与与2 2滴台盼蓝液滴台盼蓝液混混合后，合后，滴入细胞计数板滴入细胞计数板。2min2min后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少200200个细胞。未着色个细胞。未着色的为活细胞，呈
29、蓝色的为死细胞。计算活细胞百的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。分比。活体染色与细胞计数活体染色与细胞计数3232优质课件优质课件细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线细胞生长曲线细胞生长曲线细胞生长曲线(cell growth curve)(cell growth curve)(cell growth curve)(cell growth curve)是观测细胞在是观测细胞在是观测细胞在是观测细胞在一代生存期一代生存期一代生存期一代生存期内的内的内的内的增生过程增生过程增生过程增生过程的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据
30、细胞生长曲线分析生长曲线分析生长曲线分析生长曲线分析细胞增殖速度细胞增殖速度细胞增殖速度细胞增殖速度，确定，确定，确定，确定细胞传代细胞传代细胞传代细胞传代、细胞细胞细胞细胞冻存冻存冻存冻存或或或或具体实验具体实验具体实验具体实验的最佳时间。的最佳时间。的最佳时间。的最佳时间。它以培养它以培养它以培养它以培养时间时间时间时间为为为为横坐标横坐标横坐标横坐标、细胞密度细胞密度细胞密度细胞密度为为为为纵坐标纵坐标纵坐标纵坐标作坐标作坐标作坐标作坐标图。图。图。图。 3333优质课件优质课件1)1)培养细胞培养细胞 首先首先在在2 2孔培养板内分别接种孔培养板内分别接种相同数量的相同数量的细胞。计数
31、并记录接种的细细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为0 h0 h。2)2)计数细胞密度计数细胞密度 从接种时间算起，每从接种时间算起，每隔隔2424 h h计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数高准确率，对每孔细胞可计数2 2- -3 3次。如此操作至第七天结束次。如此操作至第七天结束。l 3) 3)绘制曲线绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度以培养时间为横坐标、细胞密度 为纵坐标，将全部结为纵坐标，将全部结果在坐标纸果在坐标纸 上绘图，即得所培养细胞的生长上绘图，即得所培养细胞的生长 曲线。曲
32、线。3434优质课件优质课件 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）商品名为噻唑蓝）商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（水的蓝紫色产物（formazan)formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。种功能。 二甲亚砜（二甲亚砜（DMSODMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的色深浅与所含的formazanformazan量成正比，用酶标仪测定量成正比，用酶标仪测定ODOD570nm570n
33、m值。值。 MTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。肿瘤放射敏感性实验等。四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法3535优质课件优质课件操作步骤操作步骤四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。37、5CO2培养箱中培养一段时间加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；继续培养3h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。高浓
34、度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。3636优质课件优质课件1.5 1.5 细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏 SpallanzaniSpallanzani( (17761776) )最早最早发发表了表了“ “冷冷” ”处处理理对对“ “细细胞胞” ”生命活生命活动动影响的影响的报报道。道。 19001900年前后，科学家基本上肯定了生物成分年前后，科学家基本上肯定了生物成分( (如精子如精子) )能能够够在零下温度在零下温度贮贮存的事存的事实实。 PolgePolge等人等人( (19491949) )发现发现了了甘油甘油对对
35、低温下低温下贮贮存存细细胞的保胞的保护护作用。作用。 Luyet(1951)Luyet(1951)与与Lovelock(1953)Lovelock(1953)等多位学者等多位学者发现发现电电解解质浓质浓度增大度增大是造成冷是造成冷冻贮冻贮存存细细胞胞损伤损伤的主要原因。的主要原因。 LovelockLovelock等人等人( (19591959) )发现发现了一种新的化学保了一种新的化学保护剂护剂，这这就是就是现现在人在人们们熟熟知的知的二甲基二甲基亚砜亚砜(DMSO)(DMSO)。 当前低温液氮当前低温液氮冻冻存存贮贮存存细细胞已是胞已是细细胞培养室常胞培养室常规规性通用技性通用技术术 ，贮
36、贮存存时时间间几乎是无限的。几乎是无限的。 3737优质课件优质课件细胞冻存细胞冻存细胞冻存细胞冻存(cryopreservation)(cryopreservation)：将体外培养物悬：将体外培养物悬浮在浮在冷冻保护剂冷冻保护剂的溶液中，以一定的的溶液中，以一定的降温速率降温速率降降至零下某一温度至零下某一温度(-70 (-70 ) )，并在此温度下对其长，并在此温度下对其长期保存的过程。期保存的过程。复苏复苏复苏复苏(thawing)(thawing)：以一定的：以一定的复温速率复温速率将冻存的培将冻存的培养物养物恢复到常温恢复到常温的过程。的过程。3838优质课件优质课件影响冷冻效果的
37、因素影响冷冻效果的因素1.1.冷冻速率冷冻速率细胞冷至细胞冷至-5-15-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动外流动- -冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高，细胞内不冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰，但脱水严重，细胞体积严重收缩，甚至使细胞失去活性；发生结冰，但脱水严重，细胞体积严重收缩，甚至使细胞失去活性；- -冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，随着温度的下降会冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间
38、外渗，随着温度的下降会发生细胞内结冰，造成细胞膜及细胞器的破坏。发生细胞内结冰，造成细胞膜及细胞器的破坏。3939优质课件优质课件影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素2.2.冷冻保存温度冷冻保存温度液氮温度（液氮温度（-196-196）是目前最佳冷冻保存温度。）是目前最佳冷冻保存温度。-70-70-80-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，时间延长，细胞存活率下降。影响，时间延长，细胞存活率下降。3.3.复温速率复温速率是在细胞复苏时温度升高的速度是在细胞复苏时温度升高的速度一般复温速度越快越好一般复温速度越快越好1-2min1-2min内
39、从内从-196-196升温至升温至3737（水浴锅）。（水浴锅）。4040优质课件优质课件4. 4. 冷冻保护剂冷冻保护剂 可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。渗透性：甘油、渗透性：甘油、DMSODMSO 非渗透性：聚乙烯吡咯烷酮非渗透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、蔗糖、聚乙二醇影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。4141优质课件优质课件慢冻程序慢冻程序
40、标准程序标准程序标准程序标准程序：采用细胞冻存器：采用细胞冻存器当温度在当温度在-25-25以上时，以上时， 1 12/min2/min当温度达当温度达-25-25以下时，以下时， 5 510/min10/min当温度达当温度达-100-100时，可迅速放入液氮时，可迅速放入液氮(-196(-196 C C) )中中 简易程序简易程序简易程序简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1-21-2的速度，在的速度，在40mi
41、n40min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。 传统程序传统程序传统程序传统程序：冷冻管置于：冷冻管置于41h-201h-8016-18h(41h-201h-8016-18h(或隔夜或隔夜) )液氮槽长期储存液氮槽长期储存 4242优质课件优质课件低温保护剂的应用低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是二甲基亚枫（二甲基亚枫（DMSODMSO），它是一种，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对
42、水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶减少胞内冰晶，从而，从而减少冰晶对细胞的损伤。减少冰晶对细胞的损伤。常温下常温下DMSODMSO对细胞的毒副作用较大，在对细胞的毒副作用较大，在44时，其毒时，其毒副作用大为减弱，冻存时副作用大为减弱，冻存时DMSODMSO平衡应在平衡应在44下进行。下进行。4343优质课件优质课件细胞冻存方法细胞冻存方法预先配制冻存液预先配制冻存液-10-10DMSODMSO 细胞生长液（细胞生长液（2020血清基础培养液）血清基础培
43、养液）取取对数生长期对数生长期对数生长期对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液存液, ,用吸管吹打制成细胞悬液（用吸管吹打制成细胞悬液（1-5101-5106 6cell/ml)cell/ml)加加1ml1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名细胞名细胞名细胞名称和冷冻日期称和冷冻日期称和冷冻日期称和冷冻日期。液氮长期保存。液氮长期保存4444优质课件优质课件注意事项注意事项1.控制冻存细胞的质量2.不宜将冻存的细胞放置在-20过长时间，易引起低温损伤3.冻存小管宜用塑料冻存管4545优质课件优质课件保存细胞的复苏方法保存细胞
44、的复苏方法快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入3737水浴中，轻轻摇水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在动冷冻管，使其在1min1min内（不要超过内（不要超过3min3min）全部融化）全部融化 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进行培养，行培养，24h24h后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSODMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种解冻后
45、的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中到含完全生长培养液的培养瓶中4646优质课件优质课件1.准备水浴准备水浴2.取冻存管，入水浴快速晃动至完全融取冻存管，入水浴快速晃动至完全融化化3.去除去除DMSODMSO4.4.加入培养基制成细胞悬液，移入培加入培养基制成细胞悬液，移入培养瓶培养养瓶培养4747优质课件优质课件注意事项注意事项1.尽快使细胞恢复到常温2.尽快离心弃去冷冻保护液，防止对细胞的毒害4848优质课件优质课件冻存和复苏的原则：冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻快融冷到零度以下，细胞可以产生以下变化：冷到零度以下，细胞可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞
46、器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。，即冰晶的重结晶。4949优质课件优质课件1.6 1.6 细胞的运输细胞的运输由于培养细胞株由于培养细胞株( (系系) )的商品化，细胞培养室之间的交流、的商品化，细胞培养室之
47、间的交流、交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。装运细胞的主要方法如下：装运细胞的主要方法如下： 冷冻储存运输冷冻储存运输 充液法充液法5050优质课件优质课件细胞的运输细胞的运
48、输- - 冷冻储存运输冷冻储存运输利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。保存效果较好，但缺点是比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。5151优质课件优质课件细胞的运输细胞的运输-充液法充液法一般选择生长良好的细胞，以生长一般选择生长良好的细胞，以生长1/31/31/21/2瓶底壁为宜，瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉花等做防震防压处理。运输时间需花等做防震防压处理。运输时间需4-5d4-5d，一般放在贴身，一般放在贴
49、身口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留维持生长所需的培养液置维持生长所需的培养液置3737培养，次日传代。培养，次日传代。如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。 5252优质课件优质课件2、细胞系的建立、细胞系的建立正常细胞系正常细胞系癌细胞系癌细胞系转化细胞系转化细胞系细胞克隆细胞克隆535
50、3优质课件优质课件正常细胞系建立的程序：正常细胞系建立的程序：原代培养原代培养第一次传代第一次传代常规传代常规传代冻存和复苏冻存和复苏5454优质课件优质课件癌细胞系建立的程序：癌细胞系建立的程序：步骤类似正常细胞系建立步骤类似正常细胞系建立注意：注意：取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织去除癌组织中的间质细胞去除癌组织中的间质细胞-胶原酶法胶原酶法5555优质课件优质课件细胞系的维持细胞系的维持细胞系档案要记录好：细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；组织来源、培养基要求、传代时间等；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；传代换液有规律，否则会
51、引起生物学特性改变；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。5656优质课件优质课件证明细胞系的种系证明细胞系的种系证明细胞系的种系证明细胞系的种系：人源、鼠源或其他，染色体分析、人源、鼠源或其他，染色体分析、人源、鼠源或其他，染色体分析、人源、鼠源或其他，染色体分析、同工酶分析、同工酶分析、同工酶分析、同工酶分析、DNADNADNADNA指纹技术指纹技术指纹技术指纹技术明确细胞系的组织来源明确细胞系
52、的组织来源明确细胞系的组织来源明确细胞系的组织来源：检测细胞抗原标记的方法检测细胞抗原标记的方法检测细胞抗原标记的方法检测细胞抗原标记的方法细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：正常细正常细正常细正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体细胞有无交叉污染：细胞有无交叉污染：细胞有无交叉污染：细胞有无交叉污染：同工酶方法，同工酶方法，同工酶方法，同工酶方法，DNADNADNADNA指纹
53、技术也可以鉴指纹技术也可以鉴指纹技术也可以鉴指纹技术也可以鉴定定定定鉴定细胞系的内容鉴定细胞系的内容5757优质课件优质课件3、细胞培养物的固定、染色、细胞培养物的固定、染色培养物的常用固定方法染色方法5858优质课件优质课件2.1常用固定方法常用固定方法 固定细胞的目的：固定细胞的目的： 把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞的化学物质和酶能准确定位，变形等，使细胞的化学物质和酶能准确定位，使细胞的各部分易于着色、适于观察、长期保使细胞的各部分易于着色、适于
54、观察、长期保存和分析。存和分析。5959优质课件优质课件2.1常用固定方法常用固定方法 固定细胞的原则：固定细胞的原则： 尽可能选用新鲜培养物，根据检测工具、对象、目的和要求选择固尽可能选用新鲜培养物，根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。定剂和固定方法。 培养物的准备和固定前处理培养物的准备和固定前处理 各种细胞培养物。双盖片悬滴和悬液培养物：离心各种细胞培养物。双盖片悬滴和悬液培养物：离心-PBS-PBS漂洗漂洗2-32-3次，次，固定制片；盖片单层培养物：盖片从培养器中取出固定制片；盖片单层培养物：盖片从培养器中取出-PBS-PBS漂洗漂洗2-32-3次，次，固定固定606
55、0优质课件优质课件常用固定液常用固定液简单简单固定液：固定液：固定液：固定液： 甲醇、乙醇、醋酸、甲甲醇、乙醇、醋酸、甲醛醛、戊二、戊二醛醛、丙、丙酮酮、苦味酸、苦味酸、铬铬酸、重酸、重铬铬酸酸钾钾、氯氯化汞、化汞、氯氯化化镉镉、锇锇酸酸混合固定液：混合固定液：混合固定液：混合固定液：MuellerMueller固定液、固定液、FlernmingFlernming固定液、固定液、FAAFAA固定液、固定液、CarnoyCarnoy固定液、固定液、RossmanRossman固定液、固定液、AltmannAltmann固定液、固定液、BouingBouing固定液固定液6161优质课件优质课件常
56、用固定液常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS (1:9)大标本、染色体、线粒体、高尔基体戊二醛蛋白质、微管和膜性结构丙酮纯冷丙酮固定细胞内酶甲醇/醋酸(3:1)培养细胞、染色体，现用现配乙醇 (70-100%)血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞FAA固定液盖片单层培养的细胞醋酸(0.3-5%)减少其它固定剂引起的细胞收缩Carnoy固定液单层细胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸Bouing固定液双盖片培养细胞的糖原锇酸(1-2%)结膜、细胞结构4%多聚甲醛-PBS肾纤维蛋白、细胞骨架蛋白6262优质课件优质课件FAAFAA固定液固定液固定液固定液：90ml80%9
57、0ml80%的酒精中加入冰乙酸和的酒精中加入冰乙酸和40%40%甲甲醛醛各各5ml5mlCarnoyCarnoy固定液：固定液：固定液：固定液：60ml60ml纯纯乙醇中加入乙醇中加入氯氯仿仿30ml30ml及冰乙酸及冰乙酸10ml10mlBouingBouing固定液：固定液：固定液：固定液：75ml75ml饱饱和苦味酸（和苦味酸（100ml100ml水中加入水中加入1.2-1.4g1.2-1.4g）过滤过滤，加入，加入2525mlml福福尔尔马马林（林（40%40%甲甲醛醛，有沉淀，有沉淀时时禁用），再加入禁用），再加入5ml5ml冰醋酸（最好用前加）冰醋酸（最好用前加）4%4%多聚甲多聚
58、甲多聚甲多聚甲醛醛-PBS-PBS： 50ml50ml蒸蒸馏馏水中加入水中加入4g4g多聚甲多聚甲醛醛，加，加热热至至60-70oC60-70oC，边搅边搅拌拌边边逐滴加入逐滴加入2M2M的的NaOHNaOH至液体清澈透明；用至液体清澈透明；用1M1M的的HClHCl调调pHpH至至7.47.4，冷却后加入，冷却后加入10mM10mM的的PBSPBS至至100ml100ml锇锇酸：酸：酸：酸：在棕色在棕色试剂试剂瓶中加入瓶中加入50-100ml50-100ml的的0.1MPBS0.1MPBS（pH7.0-7.4pH7.0-7.4），再将装有），再将装有1g1g锇锇酸的安培瓶放入，酸的安培瓶放入
59、，击击碎安培瓶，碎安培瓶，摇摇晃使晃使锇锇酸溶解酸溶解6363优质课件优质课件2.2 染色方法染色方法 染色是利用化学染料与染色是利用化学染料与细细胞及各种胞及各种细细胞器胞器发发生化学作用和生化学作用和/ /或吸或吸附作用，使各种附作用，使各种细细胞胞结结构能构能够够通通过过染色而改染色而改变变其折射率，从而其折射率，从而清晰的清晰的显现显现出来。出来。影响因素：影响因素：影响因素：影响因素：所用的固定液所用的固定液染液的染液的pHpH值值：组织组织的酸性成分用的酸性成分用pHpH偏高的染液，碱性成分用偏偏高的染液，碱性成分用偏酸染液酸染液6464优质课件优质课件1）Giemsa染色染色简简
60、便、快速，适用于多种便、快速，适用于多种细细胞和染色体染色胞和染色体染色染色液现用现配，保存时间最好不超过染色液现用现配，保存时间最好不超过48h48h；GiemsaGiemsa液液对对pHpH敏感。敏感。母液制母液制母液制母液制备备：GiemsaGiemsa粉粉0.5g0.5g，甘油，甘油22ml22ml，在研，在研钵钵内将少量甘油和内将少量甘油和GiemsaGiemsa粉混合粉混合研磨至无研磨至无颗颗粒，加入剩余甘油，粒，加入剩余甘油，5656o oC C保温保温2h2h，加入，加入33ml33ml甲醇，棕甲醇，棕色瓶保存。色瓶保存。6565优质课件优质课件1）Giemsa染色染色染色步染
61、色步染色步染色步骤骤 （盖片培养或涂片法）：（盖片培养或涂片法）：（盖片培养或涂片法）：（盖片培养或涂片法）：1 1）Sorensen bufSorensen buf和和GiemsaGiemsa染液染液9:19:1体积比混合即得到染色液体积比混合即得到染色液2 2）用甲醇固定细胞标本）用甲醇固定细胞标本10 min10 min，或醋酸，或醋酸/ /甲醇甲醇(1:3)(1:3)固定固定30 min30 min3 3）用滴管将染色液布满材料面（不要有气泡）用滴管将染色液布满材料面（不要有气泡）4 4）染色）染色10-15 min10-15 min，用自来水将玻片冲洗干净，空气干燥，二甲，用自来水将
62、玻片冲洗干净，空气干燥，二甲苯透明苯透明5 5）光学树脂胶封片后观察）光学树脂胶封片后观察结果：果：细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色6666优质课件优质课件2）苏木精）苏木精-伊红染色伊红染色染液制染液制染液制染液制备备：1 1）苏苏木精染液木精染液(20):(20):苏苏木精木精0.5g0.5g，铵矾铵矾(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4AlAl2 2(SO(SO4 4) )3 324g24g，H H2 2O50O50mlml，NaIONaIO3 30.5g0.5g，甘油，甘油30ml30ml，冰醋酸，冰醋酸2ml2ml。22）1%1
63、%伊伊红红染液：染液：1g1g伊伊红红溶于溶于100ml100ml蒸蒸馏馏水。水。6767优质课件优质课件2）苏木精）苏木精-伊红染色伊红染色染色步染色步染色步染色步骤骤 （盖片培养法）：（盖片培养法）：（盖片培养法）：（盖片培养法）：1 1）37 37 o oC C温温PBSPBS中漂洗中漂洗3 3次，每次次，每次20-60 sec20-60 sec，中性福尔马林固定，中性福尔马林固定30 min30 min2 2）蒸馏水漂洗）蒸馏水漂洗1 1次，用蒸馏水稀释的次，用蒸馏水稀释的11苏木精染液染色苏木精染液染色10 min10 min，自来水，自来水洗后置入洗后置入1%NaHCO31%NaH
64、CO3中漂洗至蓝紫色中漂洗至蓝紫色3 3）伊红水溶液中染）伊红水溶液中染0.5-1 min0.5-1 min，蒸馏水洗后迅速通过丙酮，蒸馏水洗后迅速通过丙酮2 2次，每次次，每次3-5 3-5 minmin4 4）通过）通过2:12:1和和1:21:2丙酮丙酮/ /二甲苯各二甲苯各3 3次，每次次，每次1-2 min1-2 min；纯二甲苯；纯二甲苯5-10 min5-10 min5 5）用光学树胶封片（注意勿将盖片的细胞面放反）后观察）用光学树胶封片（注意勿将盖片的细胞面放反）后观察结结果：果：果：果：细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色6868优质课件优质课件3）吖
65、啶橙染色）吖啶橙染色吖啶吖啶橙橙橙橙(acridine roange, AO)(acridine roange, AO)：常用常用荧荧光染料，可用于活光染料，可用于活细细胞、固定胞、固定细细胞染色，可与胞染色，可与细细胞中胞中DNADNA和和RNARNA结结合而合而发发出不同出不同颜颜色的色的荧荧光，光，DNADNA亮亮绿绿色，色，RNARNA橘橘红红色至火色至火红红色。快速、色。快速、简简便、并有一便、并有一定特异性。定特异性。染液配制：染液配制：染液配制：染液配制： 用生理用生理盐盐水将水将AOAO配成配成1%1%的母液，冰箱保存，用的母液，冰箱保存，用时则时则0.1M0.1M的的PBSP
66、BS（pH4.8pH4.8）稀）稀释释成成0.01%0.01%工作液。工作液。6969优质课件优质课件3）吖啶橙染色）吖啶橙染色染色步染色步染色步染色步骤骤 （盖片培养）：（盖片培养）：（盖片培养）：（盖片培养）：1 1）HankHank s s液洗盖玻片上的贴壁细胞液洗盖玻片上的贴壁细胞3 3次次2 2）用）用95%95%乙醇固定细胞标本乙醇固定细胞标本15-30 min15-30 min，滤纸吸干，滤纸吸干3 3）1%1%醋酸作用醋酸作用30 sec30 sec，PBSPBS清洗清洗1 min1 min4 4）用）用0.01%0.01%的的AOAO染液染色染液染色1-5 min1-5 mi
67、n，PBSPBS清洗清洗1 min1 min5 5）0.1 MCaCl20.1 MCaCl2分色分色0.5-2 min0.5-2 min，PBSPBS清洗清洗3 3次，每次数秒次，每次数秒6 6）1:11:1的甘油的甘油:PBS:PBS封片，立刻观察封片，立刻观察( (用激发波用激发波405405的滤光片的滤光片) )7070优质课件优质课件4）免疫荧光染色）免疫荧光染色 原理：原理：原理：原理：用用荧荧光素光素标记标记已知抗体或抗原，已知抗体或抗原，检查细检查细胞或胞或组织标组织标本中相本中相应应的抗原或抗体。在的抗原或抗体。在荧荧光光显显微微镜镜下，抗原抗体特异性下，抗原抗体特异性结结合部
68、位合部位的的荧荧光素受激光素受激发发光照射而光照射而发发出明亮的出明亮的荧荧光。光。 荧荧光素：光素：光素：光素： 异硫异硫氰氰酸酸荧荧光素（光素（FITCFITC）：）：发发射射荧荧光波光波长为长为490-619nm490-619nm（黄（黄绿绿色色荧荧光）光）四乙基四乙基罗罗丹明（丹明（RB200RB200）：）：发发射射荧荧光波光波长为长为540-660nm540-660nm（橙（橙红红色色荧荧光）光）7171优质课件优质课件4）免疫荧光染色）免疫荧光染色染色步染色步染色步染色步骤骤 （间间接接接接荧荧光染色法）：光染色法）：光染色法）：光染色法）：1 1）用）用95%95%乙醇固定单层
69、细胞标本乙醇固定单层细胞标本10-30 min10-30 min，或冷丙酮固定，或冷丙酮固定5-10 5-10 minmin， PBSPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 min5 min，边洗边震荡，边洗边震荡2 2）滴加未标记的一抗液，）滴加未标记的一抗液，37 37 o oC C湿盒中湿盒中30 min30 min， PBSPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 5 minmin，边洗边震荡，边洗边震荡3 3）滴加荧光标记二抗，）滴加荧光标记二抗， 37 37 o oC C湿盒中湿盒中30 min30 min，PBSPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 5 minmin，边洗边震荡，边洗边震荡4
70、 4）去除玻片周围及材料上的水分）去除玻片周围及材料上的水分5 5）荧光显微镜下观察）荧光显微镜下观察7272优质课件优质课件5）细胞活体染色）细胞活体染色台盼蓝台盼蓝用用HanksHanks液配制液配制0.1%0.1%台盼台盼蓝蓝溶液溶液用等比的用等比的0.5%0.5%胰胰酶酶和和0.2%EDTA0.2%EDTA混合液消化混合液消化贴贴壁壁细细胞胞加入适量加入适量HanksHanks液制成液制成细细胞胞悬悬液，每液，每mlml悬悬液中加液中加入入0.1%0.1%的台盼的台盼蓝蓝溶液溶液10ul10ul并混匀并混匀细细胞胞计计数板数板计计数数10001000个个细细胞中的活胞中的活细细胞（折光
71、性胞（折光性强强且不着色）和死且不着色）和死细细胞（染胞（染为蓝为蓝色）数目色）数目7373优质课件优质课件6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微微微微丝丝： PBSPBS洗盖片培养的洗盖片培养的细细胞胞3 3次，每次次，每次0.5min0.5min 2%2%的甲的甲醛醛/PBS/PBS液固定液固定3min3min 0.5%0.5%的三硝基甲苯的三硝基甲苯/PBS/PBS处处理理3 3次，每次次，每次10min10min， PBSPBS漂洗漂洗3 3次次 用用罗罗丹明（丹明（rhodaminerhodamine）标记标记的鬼笔的鬼笔环肽环肽（phalloidinphalloidin）（）（1:101
72、:10）室）室温中反温中反应应15min15min， PBSPBS漂洗漂洗3 3次次 60%60%甘油甘油+ +荧荧光防淬光防淬剂剂封片后封片后荧荧光光显显微微镜观镜观察察7474优质课件优质课件6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微管：微管：微管：微管：PBSPBS洗盖片培养的洗盖片培养的细细胞胞3 3次，每次次，每次0.5min0.5min3%3%的甲的甲醛醛/PBS/PBS液室温固定液室温固定20min20min0.5%0.5%的三硝基甲苯的三硝基甲苯/PBS/PBS处处理理3 3次，每次次，每次10min10min， PBSPBS漂洗漂洗3 3次，最后用次，最后用滤纸滤纸吸干多余的吸干多余的
73、PBSPBS投入冷丙投入冷丙酮酮中（中（-1020-1020o oC C）7min7min， PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，最后用最后用滤纸滤纸吸干多余的吸干多余的PBSPBS7575优质课件优质课件6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微管：微管：微管：微管：向一干向一干净净平皿中央滴一滴平皿中央滴一滴浓浓度度为为0.1-0.2mg/ml0.1-0.2mg/ml的一的一级级抗微管蛋白抗抗微管蛋白抗体，令小盖片体，令小盖片细细胞面向下扣在抗体液上，将平皿置胞面向下扣在抗体液上，将平皿置3737o oC C温箱中温箱中45-45-60min60min（加水盒）（加水盒）向平皿中向平皿中缓缓缓缓加入加
74、入PBSPBS，浮起盖片并用，浮起盖片并用镊镊子子夹夹出，出，PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，最后用最后用滤纸滤纸吸干多余的吸干多余的PBSPBS向另一干向另一干净净平皿中央滴一滴平皿中央滴一滴荧荧光光标记标记的二抗（的二抗（0.1-0.2mg/ml0.1-0.2mg/ml），然），然后同操作后同操作和和滴甘油滴甘油/PBS/PBS（1:91:9，pH8.5pH8.5）少）少许许于于载载物片上，把小盖片的物片上，把小盖片的细细胞面覆胞面覆以大盖片上，并以大盖片上，并荧荧光光显显微微镜观镜观察察7676优质课件优质课件4、显微镜观察、显微镜观察7777优质课件优质课件3.1 光学显微镜光学显微
75、镜成像原理：成像原理：成像原理：成像原理：光光线线自反射自反射镜镜折射入聚光器折射入聚光器F1F1增增强强后照射在后照射在标标本上；本上；标标本的像本的像经经物物镜镜放大成倒像放大成倒像F2F2；目；目镜镜将此物象将此物象进进一一步放大在人眼步放大在人眼视视网膜上成正像网膜上成正像F3F3。构造：构造：构造：构造：机械部分机械部分/ /照明部分照明部分/ /光学部分光学部分7878优质课件优质课件光学显微镜的种类光学显微镜的种类反差方式反差方式反差方式反差方式机制机制机制机制说明说明说明说明亮视野亮视野反差取决于光吸收常结合组织染色技术来提高反差相差相差将相位差转变为振幅差反差与局部的相密度成
76、正比，包括线粒体、染色体、溶酶体等分光干涉分光干涉相差相差转换通过样品的光程相位差的变化率光经过细胞和细胞器边缘时光程突然变化形成强烈反差暗视野暗视野散射光观察产生细胞和细胞器边缘的轮廓图像干涉反射干涉反射反差取决于相互靠近的空间表面之间发生的衍射用于观察细胞培养中细胞与基底间的接触带偏振光偏振光在低于光学分辨率的情况下检测具有双折射性的超分子组织结构用于定性排列结构的研究，如细胞骨架、有丝分裂的微管以及强韧纤维、膜的观察荧光荧光反差取决于荧光基团的光吸收及光衍射仅限于适当的自发荧光和荧光标记7979优质课件优质课件光学显微镜观察的一般过程光学显微镜观察的一般过程普通光学显微镜相差显微镜荧光显
77、微镜暗视野显微镜偏振光显微镜干涉显微镜扫描隧道显微镜原子力显微镜视频显微镜共聚焦显微镜8080优质课件优质课件1）相差显微镜）相差显微镜调节调节：1 1）将）将显显微微镜镜合合轴轴，并把，并把视视野圈开大至与聚光器光野圈开大至与聚光器光阑边缘阑边缘一致一致2 2）将与物）将与物镜镜放大倍数一致的相板放入聚光器中放大倍数一致的相板放入聚光器中3 3）把）把调调中目中目镜换镜换到目到目镜镜筒中，旋筒中，旋动调动调中目中目镜镜上的上的调调焦焦环环至相板相至相板相环环的的图图像清晰（分像清晰（分别别是两个明暗不同的是两个明暗不同的圆圆形形图图像）像）4 4）调节调节聚光器上的相聚光器上的相环调环调中旋
78、中旋钮钮（注意不要旋（注意不要旋动动聚光器的聚光器的调调中中纽纽），），使两个使两个圆环图圆环图像重叠成同心像重叠成同心圆圆5 5）用普通目）用普通目镜换镜换下下调调中目中目镜镜并并观观察察8181优质课件优质课件1）相差显微镜）相差显微镜注意事注意事注意事注意事项项：1 1）换换不同倍率的物不同倍率的物镜时镜时，要，要选选用一致的相板和相用一致的相板和相环环，并重新，并重新调调中中2 2）载载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净净，标标本不能太厚，以免本不能太厚，以免影响影响观观察效果察效果3 3）标标本要在有水的本要在有水的环环境中（如培养瓶的培养液、水封
79、片等）成像效果境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像效果才明才明显显4 4）光路上最好加）光路上最好加单单色（如黄色（如黄绿绿色）色）滤滤光片，使其分辨率达到最高光片，使其分辨率达到最高8282优质课件优质课件2）荧光显微镜）荧光显微镜调节调节：1 1）打开）打开电电源开关，当源开关，当电压电压表的指表的指针稳针稳定在定在220V220V时时，打开高，打开高压压汞灯开汞灯开关，关，预热预热10min10min，移开光帘，光，移开光帘，光线进线进入光路入光路2 2）将灯前）将灯前镜摆镜摆出光路，插入合适出光路，插入合适滤滤光片；把光片；把标标本放在本放在载载物台上，物台上，选选2525物物镜镜，
80、调调焦到成像；焦到成像；调节调节聚光器聚光器调调中中钮钮使光圈使光圈图图像居中，然后像居中，然后恢复光圈到与恢复光圈到与视视野等大野等大3 3）将灯前）将灯前镜摆镜摆入光路，入光路，拨动拨动灯前灯前镜调镜调焦杆，使灯影光斑清晰；焦杆，使灯影光斑清晰；调节调节灯灯泡泡调调中中钮钮使灯影光斑居中，然后使灯影光斑居中，然后调节调节反射反射镜调镜调中中钮钮，使反射影光，使反射影光斑居中；最后将灯前斑居中；最后将灯前镜摆镜摆出光路，即可出光路，即可观观察察样样品品8383优质课件优质课件2）荧光显微镜）荧光显微镜注意事注意事注意事注意事项项：1 1）观观察察对对象必象必须须是自是自发荧发荧光或已被光或已
81、被荧荧光染料染色的光染料染色的标标本本2 2）载载物片、盖玻片及物片、盖玻片及镜镜油油应应不含自不含自发荧发荧光光杂质杂质3 3）选选用效果好的用效果好的滤滤光片光片4 4）荧荧光光标标本很易褪色，操作、本很易褪色，操作、观观察要迅速察要迅速5 5）启）启动动高高压压汞灯后，不得在汞灯后，不得在15min15min内将其关内将其关闭闭；关；关闭闭后，必后，必须须待汞灯待汞灯冷却后方可再次打开冷却后方可再次打开6 6）若）若暂暂不不观观察察标标本，可用阻光光帘阻本，可用阻光光帘阻挡挡光光线线，以保，以保护标护标本本7 7）若常）若常时间观时间观察察荧荧光光标标本最好戴本最好戴护护目目镜镜8484
82、优质课件优质课件3）暗视野显微镜）暗视野显微镜调节调节：1 1）按）按调节调节普通普通显显微微镜镜方法方法调节调节好后，好后，换换上暗上暗视视野聚光器和野聚光器和被被检标检标本片本片2 2）调节调节聚光器和物聚光器和物镜镜的上下工作距离，看到的上下工作距离，看到标标本的本的图图像像3 3）调节调节聚光器的上下聚光器的上下轴轴和中和中轴轴，在，在视视野清晰的前提下，背野清晰的前提下，背景越暗越好景越暗越好4 4）把灯泡亮度、）把灯泡亮度、视视野光圈和聚光器的孔径光圈开到最大，野光圈和聚光器的孔径光圈开到最大，此此时时暗暗视视野效果最佳野效果最佳8585优质课件优质课件3）暗视野显微镜）暗视野显微
83、镜注意事注意事注意事注意事项项：1 1）聚光器与物）聚光器与物镜镜的数的数值值孔径孔径应应合理匹配，物合理匹配，物镜镜的数的数值值孔孔径必径必须须小于聚光器的数小于聚光器的数值值孔径孔径2 2）盖玻片和）盖玻片和载载物片物片应应清清洁洁无痕，否无痕，否则则，会出，会出现现明亮的散明亮的散射光影响射光影响观观察察3 3）必）必须须在聚光在聚光镜镜和和载载片之片之间间加香柏油，以加香柏油，以维维持暗持暗视视野和野和保保证观证观察效果察效果8686优质课件优质课件4）激光共聚焦扫描显微镜）激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦激光共聚焦扫扫描描显显微系微系统统由一个激光由一个激光扫扫描描显显微微镜镜在物在物
84、镜镜的成像面上加一个的成像面上加一个针针孔孔组组成。成。只有被照亮点只有被照亮点发发出的光才能通出的光才能通过过共焦孔，偏离的无用共焦孔，偏离的无用荧荧光被光被挡挡去，极大的增加了去，极大的增加了对对比度，可看到比度，可看到样样品的品的细细微微结结构。构。输输出信息通常是一叠光学切片，通出信息通常是一叠光学切片，通过过定量定量调调焦焦获获得每得每一个一个图图像。像。8787优质课件优质课件3.2 电子显微镜电子显微镜透射透射电电子子显显微微镜镜 (transmissionelectronmicroscope,TEM)(transmissionelectronmicroscope,TEM)扫扫描
85、描电电子子显显微微镜镜 (scanningelectronmicroscope,SEM)(scanningelectronmicroscope,SEM)超高超高压电压电子子显显微微镜镜 (ultra-high-voltageelectronmicroscope,(ultra-high-voltageelectronmicroscope,UHVEM)UHVEM)扫扫描式透射描式透射电电子子显显微微镜镜 (scanningtransmissionelectron(scanningtransmissionelectronmicroscope,STEM)microscope,STEM)8888优质课件优质课件
