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1、红霉素的发酵工艺及提取工艺 报告人赵训平小组成员：陈云、杜婧文，李安、陈哲红霉素的产生菌及育种 1950年，Lily研究室首次从菲律宾的一个土样中筛选到了一株产红霉素的红色链霉素现称为红色糖多胞菌。该菌在合成培养基上生长时，气生菌丝为白色，孢子丝呈不紧密的螺旋状，35圈，孢子呈球状 我国20世纪60年代以红色糖多胞菌P32103为菌种开始红霉素的工业生产，该菌发酵效价低，且易染噬菌体。随后，国内学者不断以该菌为原始菌进行了传统的诱变育种，获得许多生产性能良好的菌株。红霉素的发酵工艺 孢子培养 孢子培养 沙土孢子 母瓶斜面培养 37 7 10 h 37 7 10 h 种子罐培养 子瓶斜面培 34
2、 35 60 70h 种子罐培养 发酵 一级种子液 二级种子液 32 35 3032h 31 150160h 发酵液 红霉素的发酵工艺 1种子培养： 1生产孢子的制备：红色糖多胞菌斜面孢子培养基由淀粉、玉米浆、硫酸铵等组成，孢子培养的温度为37，湿度50左右。母瓶斜面培养9d，子瓶斜面培养7d。成熟的孢子呈深米黄色，色泽鲜艳、均匀、无黑点，孢子瓶背面有红色色素。 2生产种子的制备：种子罐及繁殖罐的培养基由淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵和碳酸钙等组成，灭菌后将子瓶斜面孢子制成孢子悬液，用微控注射的方式接 入种子罐。种子培养温度为35，培养时间为65h，繁殖罐培养温度为33，培养时间为30
3、32h左右。种子培养成熟并经检验合格后以10的接种量移入发酵罐。红霉素的发酵工艺 2培养基 发酵培养基最适合的碳源为蔗糖、其次为葡萄糖、淀粉、糊精。生产上常用葡萄糖和淀粉为混合碳源，效果与使用葡萄糖相似。 氮源的代谢对红霉素合成影响很大，当适于菌体生长的氮源耗尽时，菌体才停止生长并迅速合成红霉素。红霉素生产中一般都用有机氮源，其中以黄豆饼粉、玉米浆为最佳。由于黄豆饼粉菌时泡沫较多，故一、二级种子罐及后期补料用部分花生饼粉代替，但全用花生饼粉则最终产品会出现带会现象。在发酵培养基中加少量硫酸铵，可促进菌丝生长。 丙酸是红霉内脂合成红霉素的三中产物之一合成的前体物质，但丙酸对菌丝生长有抑制作用，所
4、以发酵时以丙醇为发酵前体物质，丙醇在发酵时对菌丝的毒性作用相对较小，对pH的影响也较小，代谢稳定，发酵单位和产品质量都较高。此外，正丙醇除了起前体作用外，还对红色糖多孢菌中乙酰CoA合成的诱导物。 在无机元素中，铁离子抑制红霉素的合成。红霉素的发酵工艺 3）培养条件： （1） 温度：红霉素发酵采用31恒温培养。温度过高时，会产生红霉素C，红霉素C与红霉素A结构相似，但毒性却是红霉素A的两倍， （2）pH：整个发酵过程中pH维持在6.67.2，菌丝生长良好，发酵水平稳定。红色糖多孢菌最适生长pH为6.77.0，而红霉素合成的最适 pH为6.7 6.9。 （3）通气和搅拌：红霉素发酵为好氧发酵。一
5、般地，发酵最初12h，通气量保持在0.4vvm（每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值），12h后到放罐可控制在0.81.0vvm。搅拌速度不宜太快，容易损伤菌丝，不利于发酵红霉素的发酵工艺（4）补料：发酵过程中还原糖浓度控制在1.01.4范围内，每隔6补加葡萄糖一次，直到放罐前1218停止补糖。40后补加有机氮源，每日34次，若发酵罐的黏度上升则增加补料量，反之则减少，放罐前24停止补氮。发酵后期添加氨水可以提高发酵单位，减少脱水红霉素的形成，改善产品质量，补加硫酸镁可以改善菌丝生长状况，提高发酵单位。前提一般在24后补加（5）发酵黏度的控制：发酵液的黏度一定程度上反映了菌丝生长浓度，并对红霉
6、素A.B.C组分的比例有直接的影响接种 发酵菌种接种菌龄必须掌握恰当时机，接种过早或过晚都将不利于发酵的进行。发酵接入菌种太年轻，前期生长缓慢，产物开始形成时间推迟，整个发酵周期延长；如果太老，菌量虽多，却导致生产能力下降，菌体过早自溶。菌体浓度对发酵的影响及控制 发酵接种量较大且保持在合适的浓度，则缩短细菌生长期，使产物合成时间提前；但是如果接种量过大，超出适宜值，则生长过快，物料黏度增加，导致溶氧不足，最终影响产物合成 碳源对发酵的影响及其控制按菌体利用快慢而言，分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解代谢产物，因此有利于菌体生
7、长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用；后者(如乳糖)为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的生产期，也为许多微生物药物的发酵所采用。氮源对发酵的影响及其控制氮源有无机氮源和有机氮源两类。如谷氨酸发酵，当NH4+供应不足时，就促使形成-酮戊二酸；过量的NH4+，反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液、玉米浆。补加有机氮源根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法
8、。氨水既可作为无机氮源，又可调节pH值。在抗生素发酵工业中，通氨是提高发酵产量的有效措施。当pH值偏高而又需补氮时，就可补加生理酸性物质的硫酸铵，以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的。磷酸盐对发酵的影响及其控制磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的，磷酸盐浓度的控制，对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那么严格。对抗生素发酵来说，常常是采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度，其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素。工艺控制比如溶氧控制结合，发酵时，在数1之前我们控制比较小的通气量（目前我们的发酵控制点在发酵6小时为延迟期）
9、，一来节约成本，二来适应地衣芽孢杆菌的发酵需要；而到了数1-3的时期我们采取高通气量来配合地衣的生产，数3以后又要降低通风量。在发酵地衣芽孢杆菌时，形成芽孢期对整个的发酵生产至关重要，很大程度上决定了产量和收率，经过多次实验和总结我们找出了依pH为指标的关键控制点。应该说这个小小的细节对我们整个产品的提高起到了很好的保障作用 红霉素的提取工艺 在碱性条件下，红霉素一游离碱的形式存在，可容于有机溶剂中。在碱性的条件下，可与一些酸形成盐。目前，国内外主要采用有机溶剂萃取或大孔树脂吸附进行提取。 1）发酵液的预处理：向发酵液中加入碱式氯化铝沉淀蛋白质，促进菌丝结团加快过滤。 2）有机溶剂萃取： （1
10、）防止和去乳化：用酸性的十二烷基磺酸钠，在碱性条件下留在水相中，使产品色泽有所改进。 （2）pH：发酵液碱化时控制pH在100.4的范围内。 （3）温度：控制提取过程的温度有利于提高萃取收率。红霉素的提取工艺 预处理过滤 提取离心分离 发酵液 滤洗液 BA萃取液 甩滤、洗涤、干燥 红霉素乳酸盐湿晶体 干晶体 溶解 碱化转化 红霉素溶液 红霉素碱湿晶体 分离、洗涤、干燥、 红霉素碱成品红霉素的提炼与精制利用红霉素不同酸碱度下溶解于不同溶剂特性，发酵液转移到有机溶剂中，再在适当酸性条件下使红霉素从溶剂中转移到酸性缓冲液中，后在适当碱性条件下，使红霉素再一次转移到溶剂中。溶剂反复萃取，达浓缩去杂之目
11、的。发酵液处理：加0.1-0.2%甲醛溶液、4-6%的ZnSO4，用15-20%的碱液调pH至8.2-8.8，过滤。滤液处理：算好醋酸丁酯加入量，碱液调pH至10-10.5，边加边搅拌。加适量消乳剂。 保温30-32醋酸丁酯提取液处理：加适量磷酸盐缓冲液，10%醋酸调pH至5-5.5，分层，去废醋酸丁酯，10%NaOH 调pH到7-8，同时加适量醋酸丁酯。酸化缓冲液的处理：经中和的酸性缓冲提取液保温35-45，加醋酸丁酸酯萃取，用10%NaOH碱化，调pH至10-10.3，二次分级萃取，静置分层，得醋酸丁酯萃取液。经冷冻干燥，分装。红霉素【别名】威霉素;福爱力；新红康；【外文名】Erythro
12、mycin, EM, EMU-V, Eryc, Ethryn, E-Mycin, Gluceptate, Ilotycin红霉素适应症:红霉素在临床上可作为下列感染的选用药物:1.溶血性链球菌、肺炎链球菌等所致的急性扁桃体炎、急性咽炎、鼻窦炎。2.溶血性链球菌所致猩红热、蜂窝织炎。3.肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎。4.气性坏疽、炭疽、破伤风。5.白喉(辅助治疗)及白喉带菌者。6.沙眼衣原体结膜炎。7.衣原体属、支原体属所致泌尿生殖系感染。8.李斯特菌病。9.军团菌病。10.淋球菌感染。11.空肠弯曲菌肠炎。12.厌氧菌所致口腔感染。13.百日咳。14.放线菌病。15.皮肤科主要用于非淋菌性尿
13、道炎(宫颈炎)、淋病、梅毒、软下疳、衣原体淋巴肉芽肿(性病性淋巴肉芽肿)、痤疮以及金黄色葡萄球菌性皮肤感染、猩红热等红霉素药理学作用:红霉素是由链球菌Streptomyces erythreus所产生的一种碱性抗生素，属大环内酯类。本药系抑菌剂，但在高浓度时对高度敏感的细菌也具杀菌作用。其作用机制是可透过细菌细胞膜，在接近供位(“P”位)与细菌核糖体的50S亚基成可逆性结合，阻断转移核糖核酸(tRNA)结合至“P”位上，同时也阻断多肽链自受位(“A”位)至“P”位的位移，使细菌蛋白质合成受到抑制，从而起抗菌作用。红霉素仅对分裂活跃的细菌有效。红霉素抗菌谱广，对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及
14、一些非典型致病菌有效。本药对葡萄球菌属(包括产酶菌株)、各组链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、破伤风梭杆菌、白喉杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、空肠弯曲菌属、军团菌属、李斯特菌、伊斯雷尔放线菌具有较强的抗菌活性；对梅毒螺旋体、肺炎支原体、钩端螺旋体、立克次体；衣原体等也有较好的抑制作用。乳糖酸红霉素为红霉素的乳糖醛酸盐(lactobionate)。乳糖酸红霉素吸收后，水解释放出活性成分红霉素。红霉素可透过细菌细胞膜，在接近供位(“P”位)与细菌核糖体成可逆性结合，阻断转移核糖核酸(tRNA)结合至“P”位上，同时也阻断多肽链自受位(“A”位)至“P”位的位移，使细菌细胞蛋白合成受到
15、抑制，从而起抗菌作用。乳糖酸红霉素对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌有效。本药对葡萄球菌属(包括产酶菌株)、各组链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、破伤风梭杆菌、白喉杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、空肠弯曲菌属、军团菌属、李斯特菌、伊斯雷尔放线菌具有较强的抗菌活性；对梅毒螺旋体、肺炎支原体、钩端螺旋体、立克次体、衣原体等也有较好的抑制作用。 红霉素的分类名称 ： 一级分类：皮肤科用药 二级分类：抗生素类药物 三级分类：大环内酯类抗生素 药品英文名 ：Erythromycin 药品别名： 艾狄密新、福爱力、红丝霉素、红霉素碱、阿达霉素、Eritromicina、Erm
16、ycin、Eryc、Erythromycin Base、Erythromycinum、Paedlathrocin 药物剂型 1.肠溶片:0.125g，0.25g；2.眼膏:0.5%；3.软膏:1%；4.栓剂:0.1g，0.2g。5.注射剂(粉)：0.25g，药物0.3g。 药理作用 红霉素是由链球菌Streptomyces erythreus所产生的一种碱性抗生素，属大环内酯类。本药系抑菌剂，但在高浓度时对高度敏感的细菌也具杀菌作用。其作用机制是可透过细菌细胞膜，在接近供位(“P”位)与细菌核糖体的50S亚基成可逆性结合，阻断转移核糖核酸(tRNA)结合至“P”位上，同时也阻断多肽链自受位(“
17、A”位)至“P”位的位移，使细菌蛋白质合成受到抑制，从而起抗菌作用。红霉素仅对分裂活跃的细菌有效。红霉素抗菌谱广，对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌有效。本药对葡萄球菌属(包括产酶菌株)、各组链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、破伤风梭杆菌、白喉杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、空肠弯曲菌属、军团菌属、李斯特菌、伊斯雷尔放线菌具有较强的抗菌活性；对梅毒螺旋体、肺炎支原体、钩端螺旋体、立克次体；衣原体等也有较好的抑制作用。乳糖酸红霉素为红霉素的乳糖醛酸盐(lactobionate)。 乳糖酸红霉素吸收后，水解释放出活性成分红霉素。红霉素可透过细菌细胞膜，在接近供位(“P
18、”位)与细菌核糖体成可逆性结合，阻断转移核糖核酸(tRNA)结合至“P”位上，同时也阻断多肽链自受位(“A”位)至“P”位的位移，使细菌细胞蛋白合成受到抑制，从而起抗菌作用。乳糖酸红霉素对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌有效。本药对葡萄球菌属(包括产酶菌株)、各组链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、破伤风梭杆菌、白喉杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、空肠弯曲菌属、军团菌属、李斯特菌、伊斯雷尔放线菌具有较强的抗菌活性；对梅毒螺旋体、肺炎支原体、钩端螺旋体、立克次体、衣原体等也有较好的抑制作用适应证 红霉素在临床上可作为下列感染的选用药物:1.溶血性链球菌、肺炎链球菌等所
19、致的急性扁桃体炎、急性咽炎、鼻窦炎。2.溶血性链球菌所致猩红热、蜂窝织炎。3.肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎。4.气性坏疽、炭疽、破伤风。5.白喉(辅助治疗)及白喉带菌者。6.沙眼衣原体结膜炎。7.衣原体属、支原体属所致泌尿生殖系感染。8.李斯特菌病。9.军团菌病。10.淋球菌感染。11.空肠弯曲菌肠炎。12.厌氧菌所致口腔感染。13.百日咳。14.放线菌病。15.皮肤科主要用于非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、淋病、梅毒、软下疳、衣原体淋巴肉芽肿(性病性淋巴肉芽肿)、痤疮以及金黄色葡萄球菌性皮肤感染、猩红热等。 禁忌证 本品可透过胎盘屏障和进入母乳，孕妇和哺乳妇女宜慎用。对大环内酯类药过敏者。 注意
20、事项 1.交叉过敏:患者对一种大环内酯类药过敏时，对其他大环内酯类药也可过敏。2.慎用:(1)哺乳期妇女；(2)肝功能不全者。3.药物对检验值或诊断的影响:(1)红霉素可干扰Higerty法的荧光测定，使尿儿茶酚胺的测定值出现假性升高；(2)少数患者用药后可出现血清碱性磷酸酶、胆红素、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的测定值升高。4.用药前后及用药时应当检查或监测:(1)长期用药时应常规监测肝功能；(2)大剂量用药时应监测心电图；(3)红霉素在肝功能损害时可以蓄积，因此大剂量用药时应监测血药浓度水平。 不良反应 1.用药后可出现腹泻、恶心、呕吐、中上腹痛、食欲减退等胃肠道症状，其发生率与
21、剂量大小有关。2.用药后偶可出现乏力、黄疸及肝功能异常等肝毒性。3.大剂量(每天4g)给药或肝、肾疾病患者、老年患者用药后可能引起耳毒性。主要表现为听力减退。医学全/在线可能与血药浓度过高(12mg/L)有关，停药后大多可以恢复正常。4.用药后偶可出现药物热、皮疹、嗜酸粒细胞增多等过敏反应，发生率约为0.5%1%。5.少数患者用药后偶有心律不齐，口腔或阴道念珠菌感染等。6.部分患者静脉给药后偶可出现静脉刺激或静脉炎。 用法用量 1.成人:(1)口服给药：常用口服剂量:每天12g，分34次服用。军团菌病:每天剂量可增至24g，分4次服用。(2)局部给药：治疗沙眼、结膜炎、角膜炎，用适量眼膏涂于眼
22、睑内，每天数次。(3)肾功能不全时剂量:肾功能减退患者一般勿需减少用量。2.儿童:(1)口服给药：每天3050mg/kg，分34次服用。(2)局部给药：沙眼、结膜炎、角膜炎，用适量眼膏涂于眼睑内，每天数次。3.静脉滴注：1.成人：(1)一般用量:每天12g，分24次。(2)军团病:每天34g，分次给药。高剂量不能超过4g。2.儿童：每天按2040mg/kg，分24次给药。 药物相应作用 1.红霉素与卡马西平、丙戊酸等抗癫痫药同用，可抑制卡马西平和丙戊酸的代谢，导致后者的血药浓度升高而发生毒性反应。并且卡马西平又能通过肝脏微粒体氧化酶降低本药药效。2.红霉素与环孢素合用可促进环孢素的吸收并干扰其
23、代谢，临床表现为腹痛、高血压及肝功能障碍。3.红霉素与黄嘌呤类(二羟丙茶碱除外)同用可使氨茶碱的肝清除减少，导致血清氨茶碱浓度升高和(或)毒性反应增加。这一现象在同用6天后较易发生，氨茶碱清除的减少幅度与红霉素血清峰值成正比。4.红霉素与地高辛合用，可清除肠道中能灭活地高辛的菌群，因而导致地高辛肠肝循环，使地高辛血药浓度升高而发生毒性反应。5.红霉素与洛伐他丁合用时可抑制洛伐他丁代谢而增加其血药浓度，可能引起横纹肌溶解。6.红霉素与咪达唑仑、三唑仑合用时可降低咪达唑仑、三唑仑的清除率而增强其作用。7.红霉素与阿芬太尼合用可抑制阿芬太尼的代谢，延长其作用时间。8.红霉素与其他肝毒性药物合用可能增强肝毒性。9.大剂量红霉素与耳毒性药物合用，可能增加耳毒性；肾功能减退患者尤易发生。10.红霉素与阿司咪唑.特非那定等抗组胺药合用可增加心脏毒性，引起心律失常。11.红霉素与酒石酸麦角胺合用可致急性麦角中毒(如末梢血管痉挛)。12.长期服用 谢谢
