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1、定性试验质控定性试验质控临床免疫定性试验临床免疫定性试验室内质控方案室内质控方案江苏省临床检验中心江苏省临床检验中心许斌许斌http:/CUTOFF值的确定和验证+临床化学仪器临床化学仪器精密度精密度分析（分析（ EP5-A2 ）+定量分析方法定量分析方法线性线性评估（评估（EP6-A）+临床化学中临床化学中干扰干扰的测试（的测试（ EP7-A2）+用患者样品进行方法用患者样品进行方法对比对比及偏倚评估（及偏倚评估（EP9-A2）+临床实验室定量分析方法的初步评估（临床实验室定量分析方法的初步评估（EP10-A3）+体外诊断实验室要求的统一（体外诊断实验室要求的统一（EP11-A）+定性分析性
2、能的评价协议（定性分析性能的评价协议（EP12-A2）+实验室统计实验室统计-标准差（标准差（EP13-A）+基质效应基质效应的鉴别和量化（的鉴别和量化（EP14-A2）+体外诊断产品精密度、准确度的使用证实（体外诊断产品精密度、准确度的使用证实（EP15） +定量分析方法的定量分析方法的校准校准确认（确认（EP16）+检测限检测限的评估：评价、确认和论证（的评估：评价、确认和论证（EP17-A）NCCLS（CLSI）方法学性能方法学性能评估方案评估方案一共一共21个文件个文件CLSI免疫专业相关技术标准C28-A3 Defining, Establishing, and Verifying
3、Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guiedline-Third EditionC54-A Verification of Comparability of Patient Results Within One Health Care System; Approved GuidelineGP10-A Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots;
4、Approved GuidelineEP12-A2 User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; ApprovedGuidelineCLSI免疫相关技术标准I/LA2-A2 Quality Assurance of Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens: (1) Indirect Fluorescence Assay for Microscopy and (2)Microtiter Enzyme Immunoassay Methods; App
5、roved Guideline-Second EditionI/LA6-A Detection and Quantitation of Rubella IgG Antibody: Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test Products, Specimen Handling, and Use of Test Products in the Clinical Laboratory; Approved GuidelineI/LA18-A2 Specifications for Immunological Tes
6、ting for Infectious Diseases;Approved Guideline-Second EditionI/LA21-A Clinical Evaluation of Immunoassays; Approved GuidelineI/LA23-A Assessing the Quality of Immunoassay Systems: Radioimmunoassays and Enzyme,Fluorescence, and LuminescenceImmunoassays; Approved GuidelineI/LA30-P Immunoassay Interfe
7、rence by Endogenous Antibodies；Proposed Guideline临床免疫定性试验的性能指标临床免疫定性试验的性能指标灵敏度灵敏度(sensitivity)：（1）分析灵敏度（）分析灵敏度（Analyticalsensitivity）也可用）也可用检测限（检测限（Detectionlimit）表述是指可以将样品中分）表述是指可以将样品中分析物检出的最少分析物的量。析物检出的最少分析物的量。（2)诊断灵敏度诊断灵敏度(Clinicalsensitivity)是指确诊的病是指确诊的病人中检测结果为阳性或超过了检测限的病人的比例或人中检测结果为阳性或超过了检测限的病人
8、的比例或指大量样本中阳性病人的检出能力。指大量样本中阳性病人的检出能力。特异性（特异性（Specificity）：分析特异性指实验方法）：分析特异性指实验方法只检测目的构成物的能力；临床特异性指实验只只检测目的构成物的能力；临床特异性指实验只对样本中的特异的分析物起反应而不对的其它物对样本中的特异的分析物起反应而不对的其它物质有反应的能力。质有反应的能力。阳性预测值阳性预测值（Predictivevalueofapositive）：实际患病的受试者实验结果为）：实际患病的受试者实验结果为阳性的概率。阳性的概率。阴性预测值阴性预测值（Predictivevalueofanegative）：实际未
9、患病的受试者实验结）：实际未患病的受试者实验结果为阴性的概率。果为阴性的概率。符合率符合率（Efficiency）：阳性或阴性结果）：阳性或阴性结果中真实值的比例。中真实值的比例。精密度精密度（Precision）：在规定条件下）：在规定条件下,各各测定值的符合程度。精密度不是作为数值测定值的符合程度。精密度不是作为数值来表示的，而是在数量上以不精密度的方来表示的，而是在数量上以不精密度的方式表示一系列重复检测结果的式表示一系列重复检测结果的s和和cv。分重现性、重复性和总不精密度。分重现性、重复性和总不精密度。定性免疫检测的用途定性免疫检测的用途筛选试验筛选试验用来检测全体人群或人群亚群一个
10、特征的出现用来检测全体人群或人群亚群一个特征的出现（如感染原或相关抗体的出现）。（如感染原或相关抗体的出现）。一般要求趋向二个极端：一般要求趋向二个极端：1）有高的临床敏感性（即超过）有高的临床敏感性（即超过95%的临床检的临床检出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能出率），检测结果保证阴性筛选结果具有高可能性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一性的没有这些特征，而阳性结果可能需要做进一步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。步的确证试验；血站系统的传染病筛查属于此类。2）有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结）有高的特异性，检测结果保证阳性筛选结果具有高可能性的具有这些特征。果具有
11、高可能性的具有这些特征。诊断试验诊断试验用来评价具有可疑给予特征（如一种感染用来评价具有可疑给予特征（如一种感染的特殊类型）的人。的特殊类型）的人。敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。敏感性和特异性应该处于相对平衡状态。如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那如果此特征对治疗或预后考虑很重要，那么敏感性要尽可能的高；而且后续已有准么敏感性要尽可能的高；而且后续已有准确的确证试验，可以不需要高的特异性。确的确证试验，可以不需要高的特异性。感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。感染性疾病的大多数临床试验是用于诊断。确证试验确证试验获得筛选或诊断试验反应性结果后，增加获得筛选或诊断试验反应性结果后，增加
12、的试验用于的试验用于证明和确认证明和确认此前的反应性结果。此前的反应性结果。在这种情况下，主要考虑的在这种情况下，主要考虑的性能性能常常是特常常是特异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性异性和阳性预测值，而不是敏感性和阴性预测值；特异性应该超过预测值；特异性应该超过98到到99%。确证。确证试验可以试验可以是非免疫化学的（如，培养或是非免疫化学的（如，培养或脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的脱氧核糖核酸研究）或免疫化学的（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试（包括免疫印迹和抗原或抗体中和试验）验）。如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和如果筛选和诊断试验已具有高的特异性和阳性预测值，则不需要确证试验。阳性预
13、测值，则不需要确证试验。CUTOFF值的验证方法值的验证方法（1）阴性来源：）阴性来源：选择没有疾病的健康人和非讨论疾病患者选择没有疾病的健康人和非讨论疾病患者的病人的新鲜血清共的病人的新鲜血清共120份，分份，分3-5批批3-5天天进行检测，计算进行检测，计算X、s，CUTOFF验证值为：验证值为：X+3s；（2）阳性来源：）阳性来源：选择弱阳性（选择弱阳性（CUTOFF值值20%）新鲜血）新鲜血清或质控血清共清或质控血清共120份，分份，分3-5批批3-5天进行天进行检测，计算检测，计算X、s，CUTOFF值验证值为值验证值为:X-3s。按照EP12文件找C50会出现给定C50与实测C50
14、的区别应用的前提是以含量为基础，在C5和 C95间有线性关系infection. for many microbiological qualitative tests is no recognized reference material. For many such antigen or antibody tests, Users must then rely on the labeling provided by the manufacturer for specific information on how the cutoff or limit of blank was establi
15、shed; or gain experience with the device in their patient population to correlate test results with clinical findings.CUTOFF验证值用于验证值用于（1）灰区的设定；）灰区的设定；（2）Leuey-Jennings质控框图的控制质控框图的控制限确定。限确定。美国美国CAP要求要求CUTOFF值每六个月验值每六个月验证一次，我们建议更换试剂批号就应证一次，我们建议更换试剂批号就应进行验证。实验室为适应这样的要求进行验证。实验室为适应这样的要求可以调整订购试剂的习惯，尽量在较可以
16、调整订购试剂的习惯，尽量在较长一段时间内使同一批号的试剂。长一段时间内使同一批号的试剂。7/23/2024jsccl-xubin7/23/2024jsccl-xubin质控物的选择质控物的选择 基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或基质：应尽量选择人血清基质，工程菌或动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起非特异或中和反应造成性抗体的存在引起非特异或中和反应造成假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性溶可以使用生理盐水，避免使用动物源性的小牛血清等。的小牛血清等。稳定性：室内质控需
17、要观察一段时间，一稳定性：室内质控需要观察一段时间，一般选择生产者声明在一定保存条件下如般选择生产者声明在一定保存条件下如2-8或或-20以下有效期为以下有效期为6个月以上。要特个月以上。要特别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分别注意开瓶有效期和冻干质控物复溶后分装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通装瓶的有效期与原装瓶有效期的区别，通常前二者的有效期要短许多。实验室应对常前二者的有效期要短许多。实验室应对这些有效期进行验证。这些有效期进行验证。质控物数量、实验位置和频次：质控物数质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少半年的实验量。每量应满足一个批号至少半年的实验量。每分析批至
18、少安排一个弱阳性和一个阴性质分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不能固定而应随机放置。试控，检测位置不能固定而应随机放置。试剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算剂盒所设的阴、阳性内对照是用来计算CUTOFF值或阈值的，也有相应的有效性值或阈值的，也有相应的有效性判断标准，但只能在同批号试剂内使用，判断标准，但只能在同批号试剂内使用，不能作为质控指标，质控必须是可以监控不能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的外对照。到不同批号试剂间的变化的外对照。浓度范围：应围绕该浓度范围：应围绕该CUTOFF值选择。一值选择。一般建议阳性质控物浓度为般建议阳性质控物浓度为2CUT
19、OFF值左值左右，阴性质控物浓度为右，阴性质控物浓度为0.5CUTOFF值左值左右。高值或超高值阳性血清是用来监控右。高值或超高值阳性血清是用来监控“HOOK效应效应”的，应该在引进分析方法或的，应该在引进分析方法或试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其试剂盒时评价，不需要长期监控，同时其测定值远高于测定值远高于CUTOFF值对边缘结果的监值对边缘结果的监控也无任何价值。控也无任何价值。灭活：尽管所有的制造商或生产者均声明对已知的经血灭活：尽管所有的制造商或生产者均声明对已知的经血传播的病原体如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病原体进行传播的病原体如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病原体进行了灭活处理，但应把质
20、控物视为有传染性，因为可能存了灭活处理，但应把质控物视为有传染性，因为可能存在灭活不完全以及其他未知的传染性，实际工作中应按在灭活不完全以及其他未知的传染性，实际工作中应按生物安全防护的规定进行操作。生物安全防护的规定进行操作。冰冻血清的融化和冻干品复溶：免疫活性的质控血清一冰冻血清的融化和冻干品复溶：免疫活性的质控血清一般需在般需在-20以下长期保存，从冰箱取出后建议室温自以下长期保存，从冰箱取出后建议室温自然融化，一次性使用可以然融化，一次性使用可以37水浴或孵箱快速融化，轻水浴或孵箱快速融化，轻柔地颠倒混匀柔地颠倒混匀5次以上；融化的血清置次以上；融化的血清置4-8保存，而不保存，而不应
21、该再次应该再次-20以下保存、反复冻融。冻干质控品用生以下保存、反复冻融。冻干质控品用生理盐水（非蒸馏水，除非有特殊说明）复溶，按规定的理盐水（非蒸馏水，除非有特殊说明）复溶，按规定的量准确（应保证每瓶操作的一致性）加入质控品容器中，量准确（应保证每瓶操作的一致性）加入质控品容器中，盖盖后轻柔地颠倒盖盖后轻柔地颠倒10次以上，保证充分溶解和混匀；安次以上，保证充分溶解和混匀；安琣瓶应先轻敲摇晃使顶部的冻干粉掉入底部，用砂轮划琣瓶应先轻敲摇晃使顶部的冻干粉掉入底部，用砂轮划开颈部轻敲顶部使其掉落在锐器盒中，加样器加生理盐开颈部轻敲顶部使其掉落在锐器盒中，加样器加生理盐水后反复抽吸水后反复抽吸10
22、次以上。所有操作应避免气泡产生。复次以上。所有操作应避免气泡产生。复溶后的质控品置溶后的质控品置4-8保存，也可分装小份置保存，也可分装小份置-20以下以下保存，只允许冻融一次。融化、复溶、分装后的血清均保存，只允许冻融一次。融化、复溶、分装后的血清均在标签上标志操作日期、有效期和操作者。在标签上标志操作日期、有效期和操作者。自制质控品自制质控品大量的临床免疫项目无商品化的质控物供大量的临床免疫项目无商品化的质控物供应，实验室需自制，其步骤为：应，实验室需自制，其步骤为：1收集阳性血清收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清污染血清)到一定量（至少够本室使用到
23、一定量（至少够本室使用6个月以个月以上的量）；上的量）；2传染性病原体需经传染性病原体需经56、10小时灭活后使用；小时灭活后使用；30.2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；菌；4稀释，用正常人血清稀释；稀释，用正常人血清稀释；5测定值，与定值参考品进行对比、求值，无测定值，与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在参考品时选择在2倍倍CutOff值附近的阳性值；值附近的阳性值；6分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20冻存备用；冻存备用；7稳定性及瓶间差评价。稳定性及瓶间差评价。Levey-Jennings质控图质控图
24、横坐标（横坐标（X轴）：轴）：CLIA88493.1218(b)定义定义:测试系统的准确性、测试系统的准确性、精密度保持稳定的一个间隔精密度保持稳定的一个间隔,不超过不超过24小时。小时。每个点表明的是分析批或检测日期，当检每个点表明的是分析批或检测日期，当检测日有多个批次时都应标出。测日有多个批次时都应标出。ELISA等板式试验应把每块板视为一个分等板式试验应把每块板视为一个分析批；发光等均相免疫试验当一个质控失析批；发光等均相免疫试验当一个质控失控，采取了纠偏措施后当天再次做的质控控，采取了纠偏措施后当天再次做的质控应视为另外的一个分析批，需在质控图上应视为另外的一个分析批，需在质控图上标
25、出。标出。纵坐标（纵坐标（Y轴）：轴）：用吸光度值或含量点图，不推荐用用吸光度值或含量点图，不推荐用S/C.O点点图。至少要引出中心线图。至少要引出中心线质控物靶（均）值质控物靶（均）值和和上下失控限三条线。上下失控限三条线。中心线：靶值这个词特别容易造成歧义，实验室中心线：靶值这个词特别容易造成歧义，实验室会误认为定值质控物提供的会误认为定值质控物提供的“靶值靶值”就是绘制质就是绘制质控图中心线的靶值，用质控物均值来表示中心线控图中心线的靶值，用质控物均值来表示中心线更恰当。质控图的更恰当。质控图的Y轴中心线应用实验室测定的质轴中心线应用实验室测定的质控物加权均值作图，无论是定值还是未定值质
26、控控物加权均值作图，无论是定值还是未定值质控物均如此。在启用新批号的质控物时应先与旧批物均如此。在启用新批号的质控物时应先与旧批号质控物平行检测号质控物平行检测3批以上，启动即刻法批以上，启动即刻法（Grubbs法）质控规则，建议使用法）质控规则，建议使用2s规则；至有规则；至有了了20个数据后转入常规的质控方法。个数据后转入常规的质控方法。失控限：失控限：Westgard质控规则并不完质控规则并不完全适合。全适合。1）其方法和试剂由于免疫学的特性、）其方法和试剂由于免疫学的特性、原材料等生产工艺问题使其变异较大，原材料等生产工艺问题使其变异较大，一般批内一般批内cv超过超过15%；2）免疫反
27、应的曲线是非线性的；）免疫反应的曲线是非线性的；3）质控点测定值呈偏态分布。）质控点测定值呈偏态分布。临床免疫检验的质控目的就是保证检临床免疫检验的质控目的就是保证检测结果阳性是阳性、阴性是阴性。测结果阳性是阳性、阴性是阴性。偶然误差的失控规则偶然误差的失控规则不能简单地使用不能简单地使用13s或武断地使用或武断地使用12s判断是否在控。判断是否在控。利用利用cutoff验证值可以直接确定上下失控验证值可以直接确定上下失控限，公式为：限，公式为：例如：某批号的例如：某批号的ELISA乙肝表面抗原试剂乙肝表面抗原试剂的的cutoff值为值为0.105，其验证值为，其验证值为0.067，阳性质控物
28、均值为阳性质控物均值为0.215，则阳性失控上限，则阳性失控上限为：为：0.2151+（0.105-0.067）/0.105=0.292；阳性失控下限为：阳性失控下限为：0.2151-（0.105-0.067）/0.105=0.137。在在Y轴上的三个点为：轴上的三个点为：0.292、0.215、0.137。同样，阴性质控物的均值如为同样，阴性质控物的均值如为0.058，则应，则应用阳性失控限公式得到的用阳性失控限公式得到的cutoff验证值比验证值比例为例为36%，计算得到阴性质控在，计算得到阴性质控在Y轴上的三轴上的三个点为：个点为：0.079、0.058、0.037。系统误差的失控规则系
29、统误差的失控规则可以选用可以选用41s和和/或或10x，也就是要求质控图始终保留，也就是要求质控图始终保留20个个点以上的原因。点以上的原因。阴、阳性质控物的测定值均应在质控阴、阳性质控物的测定值均应在质控图中标出：图中标出：阳性重点是下限，阴性重点是上限，这阳性重点是下限，阴性重点是上限，这样的单个超限判为失控；样的单个超限判为失控；阴、阳性同时上限或同时下限超限判为阴、阳性同时上限或同时下限超限判为失控；失控；阳性上限超限而阴性未超或阴性下限超阳性上限超限而阴性未超或阴性下限超限而阳性未超，可以视为不失控。限而阳性未超，可以视为不失控。纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求 临床免疫纯定
30、性试验大都属于临床免疫纯定性试验大都属于CLIA88豁免豁免的技术（的技术（waivedtestingsites），包括免），包括免疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸疫沉淀、凝集试验、标记免疫的金标试纸和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。和斑点渗滤、免疫荧光印迹法等等。对于对于FDA等批准家庭使用的技术，只要求等批准家庭使用的技术，只要求检测装置有内对照，检测结果满足说明书检测装置有内对照，检测结果满足说明书规定即可；规定即可；对于需要经验来判定结果的技术仍需在实对于需要经验来判定结果的技术仍需在实验室进行，均有质控的要求，但国际上无验室进行，均有质控的要求，但国际上无具体操作的规定和资料。具体
31、操作的规定和资料。根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标根据显色或发光直接判定阴阳性的技术，如金标试纸，美国试纸，美国CDC在在“CLIA88豁免的豁免的HIV抗体快抗体快速检测的质量保证指南速检测的质量保证指南”中要求：除中要求：除检测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使检测装置的内对照外，每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，用弱阳性和阴性外对照作为质控。无判定标准，一般理解为阴、阳性质控的检测结果分别为阴性一般理解为阴、阳性质控的检测结果分别为阴性和阳性即表明在控，相反则为失控。和阳性即表明在控，相反则为失控。根据滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试根据
32、滴度或稀释度判定阴阳性的技术，如凝集试验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结验，使用弱阳性和阴性外对照质控，阳性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果在均值上下一个滴度或稀释度以及阴性质控结果为阴性即为在控，否则视为失控。果为阴性即为在控，否则视为失控。失控原因分析失控原因分析 失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试失控信号的出现受多种因素的影响，包括质控物、试剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出现失剂、仪器、操作以及质控规则本身等等。一旦出现失控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不控信号，实验室应该仔细地分析原因、查找根源，不要拘泥于推荐的程式化的步骤进
33、行，而应该根据误差要拘泥于推荐的程式化的步骤进行，而应该根据误差的来源和当批工作的实际开展排查工作。的来源和当批工作的实际开展排查工作。偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变偶然误差造成的失控，首先考虑有无工作条件的变化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、化，如新的质控物、新的试剂、仪器故障、人员变动、操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素操作程序变化等等；其次查找仪器校准、环境因素（水质、温湿度）等原因。（水质、温湿度）等原因。系统误差造成的失控，首先考虑质控物或试剂原因，系统误差造成的失控，首先考虑质控物或试剂原因，其次查找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因其次查
34、找仪器校准问题，再次分析操作程序、环境因素等原因。素等原因。失控处理失控处理 实验室在确定失控原因后，应有针对性地实验室在确定失控原因后，应有针对性地采取纠正措施；对重复或系统性出现的失采取纠正措施；对重复或系统性出现的失控原因需引入预防措施，必要时还应修改控原因需引入预防措施，必要时还应修改程序文件或作业指导书。程序文件或作业指导书。对于失控批的患者标本应根据不同情况采对于失控批的患者标本应根据不同情况采取相应的重测方案：阳性失控，重测所有取相应的重测方案：阳性失控，重测所有阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。阴性标本；阴性失控，重测所有阳性标本。质控记录质控记录 实验室应详细记录开展室内质控工作的情实验室应详细记录开展室内质控工作的情况，按日志、月累积和质控物批号累积形况，按日志、月累积和质控物批号累积形式，内容包括检测日期、环境状况、质控式，内容包括检测日期、环境状况、质控物批号和效期（开瓶）、试剂厂家批号和物批号和效期（开瓶）、试剂厂家批号和效期、仪器状况、操作者、失控原因分析、效期、仪器状况、操作者、失控原因分析、纠正措施、预防措施、审核人、批准人等。纠正措施、预防措施、审核人、批准人等。道生一，一生道生一，一生二，二生三，二，二生三，三生万物。三生万物。 -老子老子道德经道德经得道多助！得道多助！结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！52
