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1、 电子显微镜及其技术在生物电子显微镜及其技术在生物医学中的应用医学中的应用概概 论论 吴晓英吴晓英 教授教授中南大学湘雅病理系中南大学湘雅病理系1严选课件超微结构超微结构与超与超微病理学微病理学电镜2严选课件一、基本技术平台一、基本技术平台1.1.仪仪器器:电电子子显显微微镜镜( (electron microscope, ,简简称称电电镜镜或或EMEM) )及制样设备:及制样设备: 透射电镜透射电镜(Transmisson EM, TEM):内部结构内部结构 扫描电镜扫描电镜(Scanning EM, SEM):表面超微结构表面超微结构2. 样样品品制制备备技技术术或或电电镜镜技技术术(el
2、ectron microscopy):超薄切片技术等超薄切片技术等 3.图像识别和处理技术图像识别和处理技术 :诊断医师及技术员:诊断医师及技术员3严选课件1. 何为电镜?何为电镜?何为电镜?何为电镜? 电电镜镜是是使使用用电电子子来来展展示示物物件件的的内内部部或或表表面面结结构构的的显显微镜微镜。观察对象:观察对象:无机材料:材料、化工、采矿无机材料:材料、化工、采矿 有机材料:生物、医学、农学有机材料:生物、医学、农学电电镜镜:实实质质上上是是一一类类工工具具,是是显显微微镜镜的的一一种种!但但系系系系大大型型、贵重贵重、精密精密仪器仪器仪器仪器, , , ,其原理、结构与光镜显著不同!
3、其原理、结构与光镜显著不同!其原理、结构与光镜显著不同!其原理、结构与光镜显著不同!4严选课件2.2.电镜基本原理电镜基本原理电镜基本原理电镜基本原理 电电子子具具有有波波粒粒二二像像性性且且其其波波长长比比可可见见光光的的波波长长短短( (1924年年) ,短短波波长长能能极极大大地地提提高高分分辨辨率率(光光镜镜受可见光的波长限制,其分辨率约受可见光的波长限制,其分辨率约200200纳米纳米) )。 高高速速运运动动的的电电子子在在电电场场或或磁磁场场的的作作用用下下,会会发生折射,并且能被聚焦,聚焦即能成像。发生折射,并且能被聚焦,聚焦即能成像。 电电子子射射束束取取代代可可见见光光成成
4、为为可可能能19321932年年电电镜镜诞诞生!生!5严选课件3.3.电子显微镜术的发展史电子显微镜术的发展史a.a.电子显微镜学电子显微镜学: :仪器仪器: elcctron microscope : elcctron microscope 电子显微镜电子显微镜制样技术制样技术: elcctron microscopy : elcctron microscopy 电镜技术电镜技术图象识别和分析、处理技术图象识别和分析、处理技术6严选课件3.3.电子显微镜术的发展史电子显微镜术的发展史b. 电子显微镜学的发展:电子显微镜学的发展:1933-目前分三个阶段目前分三个阶段实验阶段实验阶段 应用阶段
5、应用阶段 普及阶段普及阶段 提高完善发展阶提高完善发展阶段段 30-50年代年代 50-60年代年代 60-70年代年代 70-目前目前7严选课件5858年我国生产了第一台电镜(南京光学仪器厂)年我国生产了第一台电镜(南京光学仪器厂)19791979年我校电镜室成立,购买年我校电镜室成立,购买H H600600透射电镜透射电镜8严选课件4. 电镜种类电镜种类电镜种类电镜种类 按使用目的分按使用目的分: 透射电镜(波谱仪、能谱仪、三维重构等)透射电镜(波谱仪、能谱仪、三维重构等) 扫描电镜(波谱仪、能谱仪)扫描电镜(波谱仪、能谱仪) 超高压电镜超高压电镜 分析电镜分析电镜 扫描隧道显微镜扫描隧道
6、显微镜 原子间力电子显微镜原子间力电子显微镜9严选课件按用途分:按用途分: 生物医学用电子显微镜生物医学用电子显微镜 非生物医学用电子显微镜非生物医学用电子显微镜按电子束发射方式分:按电子束发射方式分: 非场发射:电子枪非场发射:电子枪 场发射:场发射:10严选课件5. 电镜与光镜电镜与光镜电镜与光镜电镜与光镜的比较的比较的比较的比较 类别 成像成像成像部件成像部件 图像像LM光子玻璃透镜 虚象(彩色像)EM电子电磁透镜 实像,荧光屏、CCD(黑白像)几百万倍,能看到原子的振动11严选课件 由由于于光光的的衍衍射射,LM LM 放放大大倍倍数数到到一一定定程程度度时时就就图图像像模模糊糊,而而
7、电电镜镜用用电电子子照照明明,可可更更清清晰晰。分分辨辨率率是是衡衡量量电电镜镜性性能能的的重重要要指指标标。人人眼眼分分辨辨率率:约约0.20.2毫毫米米(mm) (mm) , ,光光镜镜分分辨辨率率:0.2 0.2 微微米米(m) (m) , ,电电镜镜分分辨辨率率:0.20.2毫毫微微米米(nm)(nm)。光光镜镜的的计计量量单单位位是是微微米米(mm), ,电电镜镜的的计计量量单单位位为为毫毫微微米米(nmnm)和和埃埃。如如人人体体红红细细胞胞的的直直径径约约为为7m7m;人体细胞膜的厚度约为;人体细胞膜的厚度约为7 710 nm10 nm。 12严选课件细胞基本超微结构细胞基本超微
8、结构13严选课件14严选课件5.主要主要电镜技术电镜技术电镜技术电镜技术超薄切片技术超薄切片技术; 负染色技术;负染色技术;SEMSEM电镜样品制备技术;电镜样品制备技术;冷冻超薄切片技术;冷冻超薄切片技术;电电镜镜酶酶细细胞胞化化学学技技术术;免免疫疫电电子子显显微微镜镜技技术术; 电镜放射自显影技术;电镜放射自显影技术;核酸大分子电镜样品制备技术;核酸大分子电镜样品制备技术;电子探针;电子探针; 电镜原位杂交技术。电镜原位杂交技术。15严选课件6.透射电镜基本构成透射电镜基本构成透射电镜基本构成透射电镜基本构成真空系统真空系统机械泵油扩散泵 真空管道、阀门供电系统供电系统电子枪电源透镜电源
9、偏转器电路真空自动电路计算机控制电路采图统采图统:CCD成象系统照明系统观察记录系统镜筒镜筒16严选课件1979年湘雅电镜室成立,购买年湘雅电镜室成立,购买H600透射电镜透射电镜17严选课件18严选课件Hitachi HT7700 Hitachi HT7700 外观外观- -20122012年病理学新购年病理学新购19严选课件20Features of HT7700 (Screen Camera)HT7700 New operation environment20严选课件21不同级别操作权限不同级别操作权限21严选课件22严选课件23IDB(Image Data Base)功能23严选课件2
10、4IDB(Image Data Base)功能雪旺氏瘤A型:长间距胶原(Laso体)H-7650方便的直接测量HT 770024严选课件25HT7700 Features and Benefits“Integrated” High sensitivity/Resol. CCDNewNewReal time screen camera(fluorescent screen free)NewNewStandard Clean TMP VacuumNewNew“EMIP-SP”For image data managementNewNewKey designKey design25严选课件26Fea
11、tures of HT7700 (Double-gap Obj. Lens双狭缝物镜,可以得到独有的低倍大视野、高对比度成像的特点 )Double-gap objective lensDouble-gap objective lensPole pieceMain coilMini lens coilYoke1st Gap2nd Gap1st Gap2nd GapB. Mini lens coil: Opposite polarityMagnetic fieldMagnetic fieldA. Mini lens coil: Same polarity1st Gap2nd GapLonger f
12、ocal lengthLonger focal lengthShorter focal length* Higher contrast* Higher contrast* Lower Magnification* Lower Magnification* Higher resolution* Higher MagnificationHC and HR in One TEM26严选课件拍照CCD相机的灵敏度约比通常的光学相机高40倍。 具有更多的自动化功能,如自动聚焦、自动消像散、自动拍照等 标准就具有图像数据库功能,测长、图像过滤功能等 具有较强的扩展功能,如三维重构等由于CCD相机是和电镜是
13、一体,因此可以通过手动控制板或PC机来控制CCD相机。在显示器上显示的图像 27严选课件Features of HT7700 (Double-gap Obj. Lens)80m dia50m dia20m dia10m dia28Obj. lens aperture size and contrast28严选课件染色的影响染色的影响铀污染染铅污染染29严选课件30Features of HT7700 (Double-gap Obj. Lens)Digital image at the Digital image at the lowest HC mode lowest HC mode magn
14、ification of magnification of x 200x 200Specimen area Specimen area 9090 mm2 2 (Bottom mounted camera(Bottom mounted camera 1k x 1k pixel) 1k x 1k pixel)Specimen: Thin section of Specimen: Thin section of human kidneyhuman kidneyDirect TEM Mag.: x 200Direct TEM Mag.: x 20090m90m90m90m30严选课件31Feature
15、s of HT7700 (Double-gap Obj. Lens)1mMagnificationMagnification:5,000x5,000xMagnificationMagnification:500x500x10 mSpecimen: Human kidney, Acc.Volt.:80 kVSpecimen: Human kidney, Acc.Volt.:80 kVApplications: High contrast viewing of unstained sections31严选课件Pharmaceuticals and Cosmetics人皮肤 100kV, 70,00
16、0X鼠肠细胞刷状缘 100kV, 52,000XApplications32严选课件 髓神髓神经Applications33严选课件Biofuels/Plant Science玉米叶片叶绿体, 100kV, 27,000XApplications34严选课件35Features of HT7700 (Double-gap Obj. Lens)35严选课件36Features of HT7700 (Double-gap Obj. Lens)36严选课件37Tiling : Continuous image data acquisitionAuto Multi-Frame Auto Panoram
17、ic ImageFeature of HT7700 (Integration CCD Camera)Using both stage and image shift an 8K x8K image is seamlessly capturedAuto multi-frame & Auto panoramic image functionHighly accurate alignment is realized by cross correlation image processing and automatic contrast correction37严选课件Montage constitu
18、tedMontage constitutedby 64 images (8x8) by 64 images (8x8) Rat kidney Rat kidney Direct Mag.:700xDirect Mag.:700xAcc. Volt.Acc. Volt.:80 kV80 kV10 mm120 mm388k pixel8k pixel8k pixel8k pixelAuto Multi-frame panoramic image functionHT7700 Characteristics (Auto Panoramic Image)38严选课件三、电镜及其技术在医学中的应用39严
19、选课件 基础医学基础医学 临床诊断临床诊断 发展趋势、新应用(纳米材料检测、发展趋势、新应用(纳米材料检测、DNADNA构象构象) ) 1 1、EMEM在医学中的应用在医学中的应用40严选课件在基础医学方面a. .观察细胞的亚微结构:线粒体、内质网、高尔观察细胞的亚微结构:线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。b.b.观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。c. c. 研究病毒的作用机理及作用靶。研究病毒的作用机理及作用靶。d.d.探讨分子病理学的发生机制。探讨分子病理学的发生机制。e.e.研究大分子
20、在生理和病理条件下的作用方式。研究大分子在生理和病理条件下的作用方式。 f.f.其它:如功能蛋白质组的亚细胞定位,纳米药其它:如功能蛋白质组的亚细胞定位,纳米药物的研制等物的研制等概述:概述:在基础医学方面在基础医学方面:细胞生物学、组织:细胞生物学、组织学、病毒学、病理学、分子生物学的发展中学、病毒学、病理学、分子生物学的发展中作出了巨大贡献并在继续应用中作出了巨大贡献并在继续应用中41严选课件 EMEM及其技术在临床诊断中的应用:及其技术在临床诊断中的应用: 临床方面:已广泛应用于临床各种疑难临床方面:已广泛应用于临床各种疑难病的诊断,如肿瘤病的诊断,如肿瘤cell来源的鉴别,血液病来源的
21、鉴别,血液病和肾脏病的分型诊断,病毒性疾病因诊断,和肾脏病的分型诊断,病毒性疾病因诊断,支原体、衣原体的鉴别,神经系统疑难病和支原体、衣原体的鉴别,神经系统疑难病和各种代谢性疾病的诊断。各种代谢性疾病的诊断。42严选课件三、EM及其技术在临床诊断中的具体应用1、电镜在肾脏疾病诊断及鉴别诊断中的应用、电镜在肾脏疾病诊断及鉴别诊断中的应用 a、原发性肾小球肾炎的分型:毛细血管内增生性、原发性肾小球肾炎的分型:毛细血管内增生性 系膜增身生性系膜增身生性 膜性肾病膜性肾病 膜增生性膜增生性 微小病变型、轻微病变型微小病变型、轻微病变型 b、继发性肾病:狼疮性肾炎、继发性肾病:狼疮性肾炎 糖尿病性肾病糖
22、尿病性肾病 乙肝相关性肾炎乙肝相关性肾炎 高血压肾病高血压肾病 43严选课件c、遗传性肾病:薄基底膜病、Alport 综合症 Barter综合症d、鉴别诊断方面的应用:分型(原发性)、 鉴别:肺出血综合症电镜观察最好每例2个以上不同病变的肾小球,还可以观察肾小管、内皮细胞、系膜细胞及上皮细胞的变化。44严选课件d. EMd. EM在肾活检诊断中的应用在肾活检诊断中的应用微小病变肾病、遗传性进行性肾炎(微小病变肾病、遗传性进行性肾炎(Alport SyndromAlport Syndrom)、良性家族)、良性家族性血尿(薄基底膜病)性血尿(薄基底膜病) 纤维样肾小球病:纤维样纤维样肾小球病:纤维
23、样oror微管样物质微管样物质e eEMEM在肝活检诊断中的应用在肝活检诊断中的应用: WilsonWilson病病抗胰蛋白酶缺乏症抗胰蛋白酶缺乏症胆色素代谢障碍:胆色素代谢障碍:G ilbeit S. Dubin-Johnson S,Rotor.SG ilbeit S. Dubin-Johnson S,Rotor.S卟林代谢疾病卟林代谢疾病45严选课件IgA肾病BM 46严选课件紫殿性肾炎47严选课件淀粉样变48严选课件Cap内增生性肾炎49严选课件2、电镜在肝脏疾病诊断方面的应用a、肝脏代谢性疾病的诊断 电镜用于肝脏疾病诊断已有30年,某些肝 脏疾病的确诊必须依赖电镜。糖原累积症鞘脂处积病
24、:Farbry :L ysosomal storage disease Niemann-Pick Gaucher脂代谢性疾病铜代谢障碍:铜代谢障碍:Wilson 病病 肝淀粉样变性肝淀粉样变性体质性黄胆:体质性黄胆:Gilbert Dubin-Johson ROtor50严选课件51严选课件b、病毒性肝炎的分类、病毒性肝炎的分类52严选课件53严选课件3、电镜在神经、肌肉 疾病诊断方面的应用1、中枢神经疾病:如 2、周围神经系统3、肌肉54严选课件55严选课件56严选课件2010年2-5肌肉活检:肖美云57严选课件4、电镜在血液系统 疾病诊断方面的应用1、白血病: 如毛细胞性白血病2、海蓝氏细
25、胞增多症58严选课件59严选课件60严选课件5、电镜在病原微生物学中的应用1、细菌、寄生虫2、病毒:SARS virus3、弓形体4、衣原体61严选课件a. EM在在Virus性、细菌性疾病诊断中的应用:性、细菌性疾病诊断中的应用:Virus是讫是讫 今为止人类今为止人类认识的最小生命形态。由于很小,只能认识的最小生命形态。由于很小,只能 EM才能对他们进行直接才能对他们进行直接 而病毒性疾病的诊断往往离不开而病毒性疾病的诊断往往离不开EM。优点:很多病毒对长时间。优点:很多病毒对长时间缺血和福尔马林固定的影响有较较强抵抗力。其结构可以不被破缺血和福尔马林固定的影响有较较强抵抗力。其结构可以不
26、被破坏,故尸检取得已石蜡包埋的材料,也可方便应用坏,故尸检取得已石蜡包埋的材料,也可方便应用EM找找Virus。方法:方法: 活检和活检和biopsy组织、培养组织、培养cell等等超薄切片超薄切片观察。观察。 血液,体液血液,体液EM负染色技术。负染色技术。可观察的内容:可观察的内容:Virus大小、形状、排列、复制、成熟过程、大小、形状、排列、复制、成熟过程、芽生部位、病毒包含体的特征等。芽生部位、病毒包含体的特征等。62严选课件63严选课件64严选课件65严选课件粪便中的甲肝病毒负染色66严选课件67严选课件6、EM在肿瘤诊断中的应用 1、区别区别 癌与肉瘤:基板、细胞连接等癌与肉瘤:基
27、板、细胞连接等2、区别连接复合体:、区别连接复合体:Ca与间皮瘤鉴别与间皮瘤鉴别3、区别大细胞肿瘤:鳞、区别大细胞肿瘤:鳞Ca、腺、腺Ca、神经内分必、神经内分必 Ca、恶性黑色素瘤、组织细胞增生、恶性黑色素瘤、组织细胞增生X症:症:Birbck body68严选课件69严选课件lysosomal storage disease:lysosomal storage disease: 淀粉样变性淀粉样变性 糖原累积病:肌肉糖原累积病:肌肉 酶缺乏酶缺乏 7、 EM在代谢性疾病诊断中的应用在代谢性疾病诊断中的应用70严选课件8、其它新应用1、医用纳米材料的检测2、DNA、蛋白质生物大分子的观察 3
28、、细胞鉴定71严选课件72严选课件73严选课件 当前形态学已由当前形态学已由cellcell和亚和亚cellcell水平发展为分子水平,水平发展为分子水平,电子显微学已向更细微结构电子显微学已向更细微结构生物分子和原子水平发展。生物分子和原子水平发展。EMEM正成为分子生物学,基因分子遗传学的重要研究工具。正成为分子生物学,基因分子遗传学的重要研究工具。电镜应用于细胞生物学、分子生物学的分子结构与功能电镜应用于细胞生物学、分子生物学的分子结构与功能关系。蛋白质及关系。蛋白质及DNADNA的定位已成为当前总趋势。举例:人的定位已成为当前总趋势。举例:人类后基因组计划。研究类后基因组计划。研究ProPro,EMEM可用来定位,观察。纳米可用来定位,观察。纳米时代:纳米材料检测、鉴别。时代:纳米材料检测、鉴别。四、 发展趋势:74严选课件75严选课件7610 mm120 mm10 mm120 mm76严选课件