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1、分分子子克克隆隆南京农业大学南京农业大学动物医学院基础兽医系动物生化教研室动物医学院基础兽医系动物生化教研室医学分子生物学基础医学分子生物学基础1分子克隆第五章第五章 分子克隆分子克隆重组重组DNADNA技术技术（recombinant DNA technology）是按照人的意愿、在体外对是按照人的意愿、在体外对DNADNA分进行重组，再将分进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该以获得该DNADNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。克隆克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代
2、完全相同的子代群体。代完全相同的子代群体。 2分子克隆载体和目的基因的载体和目的基因的分离分离；载体和目的基因的载体和目的基因的切断切断；载体和目的基因的载体和目的基因的重组重组；重组重组DNA的的转化转化和和扩增扩增；重组重组DNA的的筛选筛选和和鉴定鉴定。第一节第一节 基因工程技术路线基因工程技术路线3分子克隆基因重组技术的两个基本目的：基因重组技术的两个基本目的： 1.1.直接利用基因直接利用基因 主导生长的基因、主导生长的基因、 作物的抗性基因、作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。指纹图谱等。 2.2.利用基因的表达产物利用基因的表达产物 疫苗、药物
3、、疫苗、药物、 组织激活物、组织激活物、 生长因子、生长因子、 珍稀蛋白等。珍稀蛋白等。第一节第一节 基因工程技术路线基因工程技术路线4分子克隆工具酶工具酶：指能用于：指能用于DNADNA和和RNARNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 DNADNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶5分子克隆工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶
4、限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶催化催化DNADNA中相邻的中相邻的55磷酸基和磷酸基和33羟基末端之间形成磷酸二酯键，使羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNADNA切口切口封合或使两个封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析填补填补33末端末端KlenowKlenow片段片段又名又名DNADNA聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶I I
5、的的5 53 3 聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNAcDNA替代替代DNADNA聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在33羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第二节第二节
6、分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶6分子克隆一、限制性内切酶一、限制性内切酶 酶有几千种，分为酶有几千种，分为6 6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。裂合酶、异构酶、连接酶。 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶水解酶分为内切酶和外切酶 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释
7、放单核苷酸。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶7分子克隆有特定的识别序列有特定的识别序列但切割位置远离识别位置但切割位置远离识别位置有有的的种种类类可可以以在在同同识识别别序序列列相相距距1000bp1000bp的的位位置置上上随随机机切切割割DNADNA分子分子在基因工程中没有什么用途在基因工程中没有什么用途型限制酶型限制酶第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶8分子克隆型限制酶型限制酶有特定的识别序列有特定的识别序列切切割割位位置置在在识识别别序序列列33端端相相距距20bp20bp处处，可可以以产产生生各各种种类类型型的的单链末端。单链末端。型型限限制
8、制酶酶在在基基因因工工程程中中有有特特定定的的用用途途，但但总总体体来来说说，用用途途不不大。大。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶9分子克隆型限制酶型限制酶在在DNADNA上有特定的识别序列上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广基因工程中用途最广识识别别序序列列是是对对称称的的，在在一一条条链链中中从从55到到33方方向向的的序序列列与与其其互互补补链链从从55到到33方方向向的的序序列列完完全全相相同同，称称为为回回纹纹对对称称序序列列(palindrome)(palindrome)。 第二节第二节 分子克隆常用
9、的工具酶分子克隆常用的工具酶10分子克隆限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名属名种名菌株类型发现的顺序属名种名菌株类型发现的顺序第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶11分子克隆限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 具有具有内切内切和和甲基化甲基化两种功能两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的有特异的识别位点识别位点，通常为，通常为4-64-6对碱基的对碱基的旋转对称结构旋转对称结构在其切口处留下黏性在其切口处留下黏性末端末端（sticky end）具有互补序列的单股链，或者平头末端具有互补序列的单股链，或者平头末端（blunt end） 有有
10、3 3种类型，种类型，IIII型为主型为主。 第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶12分子克隆第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶13分子克隆EcoRIEcoRI酶切不同来源酶切不同来源的的DNADNA及退火重组及退火重组第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶14分子克隆第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶15分子克隆第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶16分子克隆同尾酶同尾酶：即识别序列不同，但酶切后产生同样的黏性末端的两种酶。：即识别序列不同，但酶切后产生同样的黏性末端的两种酶。同裂酶同裂酶：来源不同，
11、：来源不同，但能识别和切割同一但能识别和切割同一位点，但在切点位置位点，但在切点位置上对甲基化碱基的敏上对甲基化碱基的敏感性不同。感性不同。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶17分子克隆第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶18分子克隆限制性内切酶的主要用途限制性内切酶的主要用途 重组重组DNADNA分子分子 匹配末端的连接：同一种酶切割不同匹配末端的连接：同一种酶切割不同DNADNA分子产生相同的突出分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同末端；或不同酶切割不同DNADNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组
12、作用下连接为重组DNADNA分子。分子。 平端连接：可直接连接，但效率较低。平端连接：可直接连接，但效率较低。 不匹配黏端的连接：先补平不匹配黏端的连接：先补平(Klenow)(Klenow)或修平或修平(S1)(S1)后再连接。后再连接。 绘制物理图谱绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）（限制性内切酶图谱）第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶19分子克隆影响限制性核酸内切酶活性的因素：影响限制性核酸内切酶活性的因素： DNA的纯度。的纯度。 DNA的甲基化程度。的甲基化程度。 酶切消化反应的温度。酶切消化反应的温度。 DNA的分子结构。的分子结构。 限制性核酸内切酶的缓冲液。限
13、制性核酸内切酶的缓冲液。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶20分子克隆DNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌 NADT4噬菌体噬菌体 ATP来源 辅基第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶21分子克隆DNA连接酶功能连接酶功能1.1.修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二上缺口处的磷酸二酯键。酯键。2.2.修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上链上缺缺口处的磷酸二酯键。口处的磷酸二酯键。3. 3. 连接多个平头连接多个平头DNADNA双链分子。双链分子。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶22分子克隆 从分子动力学的角底
14、讲，由从分子动力学的角底讲，由限制性内切酶创造的粘性末端的限制性内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平连接属于分子内部的连接，而平头末瑞则属于分子间的连接，因头末瑞则属于分子间的连接，因此后者速度要慢的多。此后者速度要慢的多。第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶23分子克隆DNA聚合酶聚合酶 基本性质基本性质 5-3 5-3、DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 5-3 5-3核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3-5 3-5核酸外切酶活性核酸外切酶活性第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶24分子克隆 缺口前移标记法制备缺口前移标记法制备3232P P标记
15、的探针标记的探针 Nick translation Nick translationDNA聚合酶功能聚合酶功能第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶25分子克隆DNA聚合酶聚合酶大片段大片段 基本性质基本性质 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N N端三分之二的大端三分之二的大肽段，即为肽段，即为KlenowKlenow酶。酶。 具有：具有： 5-3DNA 5-3DNA聚合酶活性聚合酶活性 3-5 3-5核酸外切酶活性核酸外切酶活性失去失去 5-3 5-3核酸外切酶活性核酸外切酶活性第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子
16、克隆常用的工具酶26分子克隆DNA聚合酶聚合酶大片段功能大片段功能 补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的55粘性末端粘性末端 DNA DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记 cDNA cDNA第二链的合成第二链的合成 双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列 第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶27分子克隆T4-DNA聚合酶聚合酶 基本性质基本性质 5-3DNA 5-3DNA聚合酶活性和聚合酶活性和3-53-5的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH3-OH端外切端外切 在只有一种在只有
17、一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷暴露时为止时，外切至互补核苷暴露时为止 在有四种在有四种dNTPdNTP均存在时，聚合酶活性占主导地位均存在时，聚合酶活性占主导地位第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶28分子克隆T4-DNA聚合酶功能聚合酶功能 切平由核酸内切酶产的的切平由核酸内切酶产的的33粘性末端粘性末端 DNA DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记 第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶29分子克隆反转录酶反转录酶reverse transcriptasereverse transcriptase1.1.以以RNARNA为模板，聚合形成为
18、模板，聚合形成cDNAcDNA链。链。2.2.2. 2. 双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶30分子克隆核酸酶核酸酶S1l 可以降解单链可以降解单链DNA和和RNA。l 降解降解单链单链DNA比降解双链比降解双链DNA快快75000倍。倍。l 降解单链降解单链DNA比降解单链比降解单链RNA快快7倍。倍。l 反应最适反应最适pH范围为范围为4.0-4.3.第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶31分子克隆核酸酶核酸酶S1功能功能 内切单链内切单链DNADNA或或RNARNA 内切
19、带缺口或裂口的双链内切带缺口或裂口的双链DNADNA或或RNARNA第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶32分子克隆末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶 来自小牛胸腺来自小牛胸腺 不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，随机掺入聚合酶，随机掺入dNTPdNTP第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具酶33分子克隆碱性磷酸酶碱性磷酸酶 来自小牛胸腺（来自小牛胸腺（CAPCAP） 来自大肠杆菌（来自大肠杆菌（BAPBAP）功能：功能：将将DNADNA或或RNARNA片段的片段的55端的磷酸基切除端的磷酸基切除第二节第二节 分子克隆常用的工具酶分子克隆常用的工具
20、酶34分子克隆第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体 为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNADNA片段连接到一种特定的、具有自片段连接到一种特定的、具有自我复制能力的我复制能力的DNA分子上。这种分子上。这种DNA分子就是基因工程分子就是基因工程载体载体（vector）。载体的载体的本质是本质是DNA（少数为（少数为RNA）。）。 质粒质粒（plasmid） 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 动物病毒动物病毒 细菌人工染色体细菌人工染色体 酵母人工染色体酵母人工染色体35分子克隆载体应具备的条件载体应具备的条件n 能在宿主细胞中大量复制，得到大量
21、的重组能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNADNA分子分子n 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）片段的两侧各有一个内切酶位点）n 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子n 载体上要有报告基因或选择标记基因载体上要有报告基因或选择标记基因n 在不影响载体复制和表达的在不影响载体复制和表达的DNADNA序列上有内切酶酶切位点序列上有内切酶酶切位点n 具有较高的外源具有较高的外源DNADNA装载能力。装载能力。第三节第三节 分子克隆常
22、用的载体分子克隆常用的载体36分子克隆克隆载体克隆载体 克隆了外源克隆了外源DNADNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使后，转入宿主细胞中进行繁殖，使 克隆的克隆的DNADNA片段数量大大增加片段数量大大增加表达载体表达载体 将外源基因或将外源基因或DNADNA片段在宿主细胞中表达蛋白质片段在宿主细胞中表达蛋白质插入型载体插入型载体 将外源基因或将外源基因或DNADNA插入其中插入其中置换型载体置换型载体 切除载体部分切除载体部分DNADNA，代之以外源基因或，代之以外源基因或DNADNA。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体37分子克隆质粒质粒质粒质粒是生物细胞内固有的、能独立于
23、寄主细胞染色体外而自主复制、并被是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数质粒是绝大多数质粒是DNA型的，天然型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒基因克隆的载体质粒DNADNA分子都具有复制子、选分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。择性标记、克隆位点。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体38分子克隆质粒的命名质粒的命名小写小写p代表质粒代表质粒（plasmid），），后接两个大写字母代表发现者或实后接两个大写字母代表
24、发现者或实验室，字母右方数字代表质粒的编号。验室，字母右方数字代表质粒的编号。pBR322质粒质粒 F. Bovlivar R.L.Rodriguez 编号编号第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体39分子克隆质粒与宿主细胞的关系质粒与宿主细胞的关系（1 1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好友好”的的“借居借居”宿主细胞中，宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。（2 2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的）质粒离开宿主就无法生
25、存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。才能完成自身的复制（扩增）、转录。（3 3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿作为对宿主细胞的补偿（“交房租交房租”）。）。（4 4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体40分子克隆质粒发
26、现和研究意义质粒发现和研究意义1 1）理论意义）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要是生命起源研究的起一块体重要是生命起源研究的起一块体重要是生命起源研究的起一块体重要基石。基石。基石。基石。 2 2 2 2）实践意义）实践意义）实践意义）实践意义 是基因工程的重要载体（是基因工程的重要载体（是基因工程的重要载体（是基因工程的重要载体（vectorvectorvectorvector），能把外源基因（目的基
27、），能把外源基因（目的基），能把外源基因（目的基），能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。 质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。是。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体41分子克隆质粒的分类质粒的分类1.1.1
28、.1.按质粒的复制机理按质粒的复制机理按质粒的复制机理按质粒的复制机理，分为，分为，分为，分为2 2 2 2类：类：类：类：1 1）严谨控制型（）严谨控制型（stringent contrd typestringent contrd type） 2 2）松弛控制型（）松弛控制型（relaxed control typerelaxed control type） (1) (1)拷贝数少，一般拷贝数少，一般1010个，分子量大；个，分子量大； (1) (1)拷贝数多，拷贝数多，10-20010-200个，分子量小；个，分子量小； (2) (2)复制受限，受细菌宿主复制受限，受细菌宿主DNADNA复
29、制系复制系 (2) (2)复制不受细菌复制不受细菌DNADNA复制系统限制，复制系统限制， 统的控制；统的控制； 当宿主蛋白质合成受抑制当宿主蛋白质合成受抑制 (3) (3) 特点是这类质粒可以自传递；特点是这类质粒可以自传递； 时（如培养中加入氯霉素时），其拷贝时（如培养中加入氯霉素时），其拷贝 (4) (4)严谨控制机理（低拷贝原因），认严谨控制机理（低拷贝原因），认 数可猛增至数可猛增至1000-30001000-3000之多，该性质对之多，该性质对 为是该质粒可以产生阻逼蛋白，反馈为是该质粒可以产生阻逼蛋白，反馈 基因工程技术十分有利。基因工程技术十分有利。 抑制自身抑制自身DNADN
30、A合成。合成。 3 3）分子量小，不具备自传递能力；）分子量小，不具备自传递能力； 4 4）基因工程使用松弛型（高拷贝数）基因工程使用松弛型（高拷贝数） 质粒，以获得列多的基因产物。质粒，以获得列多的基因产物。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体42分子克隆2.2.2.2.按分子量大小，分为按分子量大小，分为按分子量大小，分为按分子量大小，分为2 2 2 2类类类类1 1 1 1）小型质粒，）小型质粒，）小型质粒，）小型质粒，15kb 2)15kb 2)15kb 2)15kb15kb15kb15kb小型质粒，无接合和自传递能力，在接小型质粒，无接合和自传递能力，在接 多属接合型或
31、自传递型，大型质粒只多属接合型或自传递型，大型质粒只合质粒协助也能转移，也可心通过转化合质粒协助也能转移，也可心通过转化 能通过细菌的接合作用由一个细菌能通过细菌的接合作用由一个细菌作用进入受体细胞，这类质粒种类较多，作用进入受体细胞，这类质粒种类较多， 传到另一个细菌。（如传到另一个细菌。（如F F质粒）。质粒）。几乎每种细菌都可以含有几乎每种细菌都可以含有2 2种以上，种以上，基因基因基因基因工程一般用小型质粒。工程一般用小型质粒。工程一般用小型质粒。工程一般用小型质粒。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体43分子克隆3.3.3.3.按质粒转移方式，分为按质粒转移方式，分为按
32、质粒转移方式，分为按质粒转移方式，分为3 3 3 3类类类类1 1）接合型质粒（）接合型质粒（conjugaative plasmidconjugaative plasmid）带有效接触基因质粒，只能使细菌接）带有效接触基因质粒，只能使细菌接 合，本身不被传递合，本身不被传递. .2 2）可移动质粒（）可移动质粒（mobiliableplasmidmobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。）可以被传递，但不能使细菌接合。3)3)自传递质粒（自传递质粒（selftran missible plasmidselftran missible plasmid）兼具）兼具1 1）
33、2 2）两种功能因而可以自）两种功能因而可以自 传递，如传递，如F F质粒。质粒。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体44分子克隆质粒的功能质粒的功能 质粒的功能主要通过质粒本身携带的基因编码蛋白质表现出来。携带质粒的宿质粒的功能主要通过质粒本身携带的基因编码蛋白质表现出来。携带质粒的宿主细胞可表现出相应表型。主细胞可表现出相应表型。1.1.1.1.性质粒性质粒性质粒性质粒 即细菌即细菌F F质粒，它本身转到质粒，它本身转到F F- -宿主细胞时，使后者变成宿主细胞时，使后者变成F F+ +，改变宿主细，改变宿主细菌性别。菌性别。2.2.2.2.抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗
34、生素抗性 抗药性（抗药性（R R）质粒使细菌产生抗生素抗性，这种抗药性抗性基因也）质粒使细菌产生抗生素抗性，这种抗药性抗性基因也可以转移到缺乏这种抗药基因的细菌体内，使之产生抗药性。可以转移到缺乏这种抗药基因的细菌体内，使之产生抗药性。3.3.3.3.产生毒素的质粒产生毒素的质粒产生毒素的质粒产生毒素的质粒 如如colcol质粒能产生大肠杆菌素因子（质粒能产生大肠杆菌素因子（colicincolicin），杀死不含该），杀死不含该毒素的亲缘细菌。毒素的亲缘细菌。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体45分子克隆质粒的基本特性质粒的基本特性 1.1.1.1.自主复制自主复制自主复制自
35、主复制 质粒的复制是自主调节的，不受染色体复制调节因素的影响质粒的复制是自主调节的，不受染色体复制调节因素的影响质粒的复制是自主调节的，不受染色体复制调节因素的影响质粒的复制是自主调节的，不受染色体复制调节因素的影响。 复制调控系统由质粒上的复制起点（复制调控系统由质粒上的复制起点（oriori），质粒的），质粒的reprep基因和基因和copcop基因组成。基因组成。 Rep Rep蛋白启动质粒的复制，蛋白启动质粒的复制，copcop基因本身或其表达产物可抑制复制作用，从基因本身或其表达产物可抑制复制作用，从而控制质的拷贝数。而控制质的拷贝数。 2.2.2.2.质粒的不相容性质粒的不相容性质
36、粒的不相容性质粒的不相容性 利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内利用相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内。 PMB PMB和和COLEICOLEI是两个密切相关的复制调控系统，带有是两个密切相关的复制调控系统，带有PMBPMB和和COLEICOLEI复制调控系统复制调控系统的质粒是不相容的。但它们与带有的质粒是不相容的。但它们与带有PSC101PSC101或或P15AP15A复制调控系统是完全相容的，复制调控系统是完全相容的，可以共存于一个细胞内。不相容性使质粒能够很容易被克隆。可以共存于一个细
37、胞内。不相容性使质粒能够很容易被克隆。 3.3.3.3.质粒的转移性质粒的转移性质粒的转移性质粒的转移性 在自然条件下，在些质粒可以通过细菌接合作用在细菌在自然条件下，在些质粒可以通过细菌接合作用在细菌细胞间传递。基因工程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因（细胞间传递。基因工程中常用的质粒载体缺乏转移所需的基因（mobmob基因），基因），不能通过接合作用在细胞间传递，但可采用人工方法转化到细菌细胞中。不能通过接合作用在细胞间传递，但可采用人工方法转化到细菌细胞中。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体46分子克隆质粒的构建质粒的构建 天然存在的质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切
38、位点小、遗传标记天然存在的质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点小、遗传标记不理想等缺点，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒不理想等缺点，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。为基础进行人工构建。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体47分子克隆pSC 101 一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝个拷贝,编码编码有一个四环素抗性基因（有一个四环素抗性基因（tetr）。）。 pSC101质粒不仅具有可插入外源质粒不仅具有可
39、插入外源DNA的多个的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，其产量就要比其它质粒载体低，其产量就要比其它质粒载体低得多。得多。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体48分子克隆ColE1属于松
40、弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到
41、质粒拷贝数增加到10003000个之多。个之多。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。片段的产量也就得到相应的提高。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体49分子克隆pBR322pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于第一部分来源于pSF2124质粒转座子的氨苄青霉素抗性基因（质粒转座子的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；）；第二部分来源于第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（质粒的四环素抗性基因（tertr）；）；第三部分则来源于第三部分则来源于
42、ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori）。）。第一个优点：具有较小的分子量，不仅易于纯化，而且第一个优点：具有较小的分子量，不仅易于纯化，而且即使携带上一段即使携带上一段6-8kb的外源的外源DNA片段，操作起来仍较片段，操作起来仍较为便利。为便利。第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。选择记号。第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体个拷贝，为重组体DNA的的制备提供了极大的
43、方便。制备提供了极大的方便。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体50分子克隆pUCpUC系列质粒载体包括如下四个部分：系列质粒载体包括如下四个部分： 来自来自pBR322质粒的复制起点；氨苄青霉素抗性基因质粒的复制起点；氨苄青霉素抗性基因; 大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖半乳糖酶基因（酶基因（lacZ）的启动子及其编码）的启动子及其编码-肽链的肽链的DNA序列序列; 位于位于lacZ基因中基因中的一段多克隆位点（的一段多克隆位点（MCS）区段，它并不破坏该基因的功能。）区段，它并不破坏该基因的功能。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体51分子克隆pGEM-3ZpGEM-3
44、Z是一种与是一种与pUC系列十分类似的小分系列十分类似的小分子质粒载体，总长度为子质粒载体，总长度为2,743bp，编码有一个，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。基因。pGEM-3Z具有两个来自噬菌体的启动子，即具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和启动子和SP6启动子，它们为启动子，它们为RNA聚合酶的聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于个启动子分别位于lacZ基因中多克隆位点区的基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应试管中加入纯化的两侧，故若在反应试管中加入纯化的T7或或SP6 RN
45、A聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的应的mRNA。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体52分子克隆大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复含有两种分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记。它使研究工作者可以自制起点与选择标记。它使研究工作者可以自如地在这两种不同的寄主细胞之间来回转移如地在这两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种寄主细胞中研究基因，并单独或同时在两种寄主细胞中研究目的基因的表达活性及其它调节功能。例如，目的基因的表达活性及其它调节功能。例如，可将
46、酵母的某种基因亚克隆到穿梭质粒载体可将酵母的某种基因亚克隆到穿梭质粒载体上，置于大肠杆菌中进行定点突变处理后，上，置于大肠杆菌中进行定点突变处理后，再把突变体基因返回到酵母细胞，以便在天再把突变体基因返回到酵母细胞，以便在天然寄主中观察研究此种突变的功能效应。然寄主中观察研究此种突变的功能效应。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体53分子克隆噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效特异性地转染宿主细物，能高效特异性地转染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而合入宿主基因组中
47、潜伏起来，而且在一定条件下上述两种状还会且在一定条件下上述两种状还会相互转化。相互转化。噬菌体（噬菌体（20面体型）面体型） 噬菌体噬菌体M13（线状体型）（线状体型）第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体54分子克隆噬菌体噬菌体 噬菌体基因组全长噬菌体基因组全长49kb49kb。噬菌体噬菌体DNADNA中间约三分之二的序列为中间基因簇中间约三分之二的序列为中间基因簇(central gene cluster)(central gene cluster)，位于两端的，位于两端的为为DNADNA左、右臂。左、右臂。基因组的中间基因簇基因组的中间基因簇序列可被外源序列可被外源DNADN
48、A片段取代片段取代, , 而不影响噬而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。 噬菌体载体可接受噬菌体载体可接受15 kb-23 kb15 kb-23 kb的的外源外源DNADNA片段，它既可作为克隆载体，也片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，可作为表达载体，在基因库筛选中，噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。于各类基因库的构建。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体55分子克隆噬菌体的生命周期噬菌体的生命
49、周期溶菌周期溶菌周期：是指噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入是指噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNADNA进行复制及进行复制及蛋白质的合成，并组装成子代噬菌体颗粒，最后使寄主细胞破裂，释放蛋白质的合成，并组装成子代噬菌体颗粒，最后使寄主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒。出子代噬菌体颗粒。溶原周期溶原周期：是指在感染过程中没有产生子代噬菌体颗粒，噬菌体是指在感染过程中没有产生子代噬菌体颗粒，噬菌体DNADNA是整合到寄主细胞染色体是整合到寄主细胞染色体DNADNA上，成为它的一个组成部分。上，成为它的一个组成部分。DNADNA重组技术一般要使噬菌体进入溶菌周期重组技术一般要使噬菌体进入溶菌周期。第
50、三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体56分子克隆-DNA-DNA载体的构建载体的构建野生型野生型-DNA包装的上限为包装的上限为51kb，本身长度为，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源只有当插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb时，才能包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野时，才能包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型生型-DNA的长度，可以提高其装载量。其实野生型的长度，可以提高其装载量。其实野生型-DNA上约有上约有40-50%的的片段是复制和裂解所必需的，片段是复制和裂解所必需的，要据切除的多少，可分为要据切除的多少，可分为插入型载体插入型载体和和取代型载体
51、取代型载体两大类。两大类。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体57分子克隆插入型载体插入型载体免疫失活型免疫失活型imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止-噬菌进入溶噬菌进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记的基因菌循环的阻遏物。含有完整标记的基因-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插插入到标记基因中，基因灭活，入到标记基因中，基因灭活，-重组分子重组分子进入溶菌循环，形成透明斑。进入溶菌循环，形成透明斑。-半乳糖苷酶失活型半乳糖苷酶失活型LacZ基因编码基因编码-半乳糖苷酶，
52、能催化无色半乳糖苷酶，能催化无色的的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入生成蓝色化合物。当外源基因插入到到LacZ基因中，基因灭活，不能生成蓝色基因中，基因灭活，不能生成蓝色化合物，而空载体裁化合物，而空载体裁-DNA则产生蓝色透则产生蓝色透明斑。明斑。58分子克隆第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体替换型载体中具有可取代的替换型载体中具有可取代的EcoRI片段，内编码有片段，内编码有SupE基因。这个噬菌体能校正寄主细胞的基因。这个噬菌体能校正寄主细胞的LacZLacZ基基因的琥珀突变。由于这种噬菌体的感染，寄主细胞因的琥珀突变。由于这种噬菌体的感染，寄主细胞LacZ基因的
53、琥珀突变被抑制，所以能在乳糖麦康基因的琥珀突变被抑制，所以能在乳糖麦康基氏琼脂培养基上产生红色的噬菌斑，或是在基氏琼脂培养基上产生红色的噬菌斑，或是在X-ga1琼脂培基上产生蓝色的噬菌斑。但如果具有琼脂培基上产生蓝色的噬菌斑。但如果具有SupE基因的基因的EcoRI片段被外源片段被外源DNA所取代，那么形所取代，那么形成的重组体噬菌体在上述的两种指示培养基中都只成的重组体噬菌体在上述的两种指示培养基中都只能产生出无色的噬菌斑。能产生出无色的噬菌斑。 取代型载体取代型载体59分子克隆CosmidCosmid质粒质粒黏性质粒黏性质粒（CosmidCosmid）：）：一种用基因工程技一种用基因工程技
54、术组建的特殊的大肠杆菌质粒，包含噬菌体的术组建的特殊的大肠杆菌质粒，包含噬菌体的Cos位点和整个位点和整个质粒的质粒的DNA顺序。顺序。 抗药性标记抗药性标记 复制原点复制原点 限制性内切酶酶位点限制性内切酶酶位点 Cos位点位点第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体60分子克隆柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)(cosmid)是利用部分是利用部分噬菌体噬菌体DNADNA与部分细菌质粒与部分细菌质粒DNADNA序列组建而成的。柯斯质序列组建而成的。柯斯质粒具有粒具有噬菌体的噬菌体的coscos序列序列(12bp) (12bp) 和细菌质和细菌质粒的复制原点。粒的复制原点。coscos
55、序列是噬菌体序列是噬菌体DNADNA包装成包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因可接受长达可接受长达50kb50kb的外源的外源DNADNA片段，这在克隆片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个真核生物基因中十分有用，因为一个DNADNA片段片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。还与调控序列。还与YACYAC克隆系统结合，用于基因克隆系统结合，
56、用于基因作图分析。作图分析。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体61分子克隆第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体用限制性内切酶处理质粒和噬菌体，再将cos位点拼接到质粒上再酶切位点将重组质粒线形化，再插入相应的基因组DNA 通过含有氨苄青霉素的选择性培通过含有氨苄青霉素的选择性培养平板筛选养平板筛选存活的细胞可能含有相应的重组质粒62分子克隆应用Cosmid作载体进行基因克隆的一般程序 穿梭载体穿梭载体(shuttle vectors )(shuttle vectors )是指能在两是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如种不同的生物中复制的载体。例如既能在既能在
57、原核生物原核生物( (如大肠杆菌如大肠杆菌) )中复制，又能在真中复制，又能在真核细胞核细胞( (如酵母如酵母) )中复制的载体。中复制的载体。因此，这因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序择标记基因，还有真核生物的自主复制序列列(Autonomously replicating (Autonomously replicating sequence, ARS)sequence, ARS)以及选择标记性状，具有以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的
58、基因，在酵母菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。基因表达分析。 穿梭载体穿梭载体第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体63分子克隆BACBAC载体是基于细菌的载体是基于细菌的性因子性因子(F(F因子因子) )质粒的一些特点构质粒的一些特点构建的。建的。F F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb100kb，它能在细菌接合时转移，它能在细菌接合时转移1000kb1000kb的细菌染色体片段。将的细菌染色体片段。将F F因子经基因工程改良构成的因子经基因工程改良构成的BACBAC载体，可用于克隆载体，可用于克隆100 k
59、b100 kb以上的以上的DNADNA片段。片段。带有外源片段的带有外源片段的BACBAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持这一特点有利于保持DNADNA大分子，尤其是重复序列多的大分子，尤其是重复序列多的DNADNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BACBAC载体载体本身分子量小本身分子量小，如由小，如由小F F质粒构建的载体质粒构建的载体pBeloBAC11pBeloBAC11全长全长7.4kb7.4kb，仅带有自我复制、控制拷贝数，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)(repE)及质粒分配及质粒
60、分配(par E(par E，par A, par B )par A, par B )所必须的最少序列。所必须的最少序列。BACBAC载体还载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点在多克隆位点两侧，还有两侧，还有T7T7及及SP6SP6启动子位点，用于制备启动子位点，用于制备RNARNA分子，进分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。及序列测定克隆的片段。 细菌人工染色体细菌人工染色体第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体64分子克隆酵母人工染色体
61、酵母人工染色体酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial chromosomechromosome，YACYAC）是另一类酵母穿梭载体。同）是另一类酵母穿梭载体。同YEpYEp载体一样具有自主复制序列、克隆位点以及载体一样具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YACYAC还具有酵母菌染色体的一些特点。还具有酵母菌染色体的一些特点。YACYAC可以可以接受接受100-1000 kb100-1000 kb的外源的外源DNADNA片段，这一特点使片段，这一特点使YACYAC成为人类基因
62、组计划及图位克隆分离基因的成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体重要工具，并促进了发展人类人工染色体( (human artificial chromosome，HAC)HAC)的研究。的研究。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体65分子克隆原核表达载体的构建原核表达载体的构建为了使克隆基因获得正确表达，转译功能性蛋白，在目的基因与载体重组为了使克隆基因获得正确表达，转译功能性蛋白，在目的基因与载体重组连接时，连接时，目的基因编码的方向必须与载体目的基因编码的方向必须与载体DNADNA启动子方向相同启动子方向相同，并要保持，并要保持目的基因转
63、译的相位不产生错误，保持原有的目的基因转译的相位不产生错误，保持原有的阅读框架阅读框架，才能正确转译成，才能正确转译成氨基酸序列正确的功能蛋白。氨基酸序列正确的功能蛋白。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体66分子克隆为确保原核细胞可识别被克隆的真为确保原核细胞可识别被克隆的真核基因，应采用核基因，应采用原核细胞的强启动原核细胞的强启动子和核糖体结合位点子和核糖体结合位点，且必须置于，且必须置于该基因的上游邻近处，于该基因的该基因的上游邻近处，于该基因的下游还应设置强终止子，基因的两下游还应设置强终止子，基因的两侧应有不同的侧应有不同的限制性酶切位点限制性酶切位点，以，以便定向
64、插入，同时还应具有便定向插入，同时还应具有标记基标记基因因以便克隆选择以便克隆选择 。表达载体在E.coli表达动物或植物基因 P 起动子 R 核糖体结合位点 T 终止子 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体67分子克隆原核细胞表达载体的类型原核细胞表达载体的类型非融合型pKK223-3结构 分泌型PIN-ompA1结构 融合蛋白表达载体pGEX结构 包涵体型pBV220结构 融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体 非融合型表达载体非融合型表达载体 分泌型表达载体分泌型表达载体 包涵体型表达载体包涵体型表达载体第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体68分子克隆真核细胞表达载
65、体的种类真核细胞表达载体的种类载体的类型载体的类型 质粒型载体质粒型载体 病毒载体病毒载体 整合型表达载体整合型表达载体 游离型表达载体游离型表达载体 瞬时表达载体瞬时表达载体 稳定性表达稳定性表达 非复制型表达载体非复制型表达载体 细胞裂解型表达载体细胞裂解型表达载体 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体69分子克隆几种常用的真核表达载体几种常用的真核表达载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体 逆转录病毒逆转录病毒（retrovirus，RV）载体是目前唯一的载体是目前唯一的RNARNA病毒载体，在鸟类和哺病毒载体，在鸟类和哺乳动物中现已发现许多逆转录病毒，如鸟类的脾坏死病毒乳动物中
66、现已发现许多逆转录病毒，如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、劳氏肉瘤病、劳氏肉瘤病毒毒(RSV)、鼠类的乳腺瘤病毒、鼠类的乳腺瘤病毒(MMTV)等。等。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体70分子克隆痘类病毒载体痘类病毒载体 痘苗病毒可不依赖宿主细胞，痘苗病毒可不依赖宿主细胞，独立于细胞质中（而不在核独立于细胞质中（而不在核中）进行复制和转录，无致中）进行复制和转录，无致癌性。癌性。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体71分子克隆HSV-IHSV-I单纯疮疹病毒载体单纯疮疹病毒载体 是一类双链是一类双链DNADNA病毒，有病毒，有8080个以上基因，其中以个以上基因，
67、其中以HSV-IHSV-I型备受关注。型备受关注。HSV-IHSV-I基基因组较大，可达因组较大，可达150kb150kb，许多基因均可缺失，但病毒仍有复制能力，因此为，许多基因均可缺失，但病毒仍有复制能力，因此为大片段外源基因大片段外源基因的插入提供了条件，且插入容量大，至少可插入的插入提供了条件，且插入容量大，至少可插入30kb30kb的外的外源基因。源基因。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体72分子克隆真核细胞中的克隆载体真核细胞中的克隆载体在酵母细胞中常用的克隆载体在酵母细胞中常用的克隆载体在大肠杆菌中表达，具有较高的拷在大肠杆菌中表达，具有较高的拷贝数贝数具有遗传标
68、记具有遗传标记具有限制酶切位点具有限制酶切位点根据复制方式不同：整合型根据复制方式不同：整合型（YIP）、复制型（、复制型（YRP） 、附加体型（、附加体型（YEP） 。第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体73分子克隆动物细胞基因克隆载体动物细胞基因克隆载体SV40SV40病毒是一种小型病毒是一种小型2020面体的面体的蛋白质颗粒，由蛋白质颗粒，由VPlVPl、VP2VP2、vP3vP3三种病毒外壳蛋白构成，中间三种病毒外壳蛋白构成，中间包装着一条环形的病毒基因组包装着一条环形的病毒基因组DNADNA。 第三节第三节 分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体74分子克隆第三节第三节
69、分子克隆常用的载体分子克隆常用的载体取代型的重组病毒载体 重组的病毒质粒载体 75分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆 目的基因的应用：目的基因的应用：v 研究基因的全貌和内涵。研究基因的全貌和内涵。v 探索疾病发生的分子生物学机制。探索疾病发生的分子生物学机制。v 研究生物物种的进化与相关同源性分析。研究生物物种的进化与相关同源性分析。v 利用基因重组技术制备基因药物。利用基因重组技术制备基因药物。v 改良品种，生产新型生物活性物质。改良品种，生产新型生物活性物质。v 基因诊断和基因治疗。基因诊断和基因治疗。 基因工程或基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基
70、因组中重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。分离克隆目的基因。76分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆获取外源目的基因的途径：获取外源目的基因的途径：直接分离目的基因直接分离目的基因通过化学合成法和通过化学合成法和PCR（聚合酶链式反应）扩增法（又称酶促聚合酶链式反应）扩增法（又称酶促 合成法）获得基因。合成法）获得基因。 通过构建通过构建cDNA文库或基因组文库，从中筛选目的基因。文库或基因组文库，从中筛选目的基因。77分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆用限制酶切用限制酶切断成许多片段断成许多片段直接分离基因直接分离基因鸟
71、枪法鸟枪法将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶切割为用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中将真核生物的基因转移到原核生物中去。去。78分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆化学合成法化
72、学合成法根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNARNA核苷酸顺序，再据此推算出基因核苷酸顺序，再据此推算出基因DNADNA的脱氧核的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。的基因。79分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆小片段粘接法小片段粘接法：分别合成碱基：分别合成碱基12-1512-15的单链的单链DNADNA小片小片 段，再通过段，再通过T4-DNAT4-DNA连接酶连接。连接酶连接。补钉延长法补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分：根据目的基因两条互补链全序列，分 另合成另合
73、成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段 及及20-3020-30碱基长的单链中片段，再通碱基长的单链中片段，再通 过过KlenowKlenow聚合酶及链接酶合成。聚合酶及链接酶合成。大片段酶促法大片段酶促法：根据目的基因的全序列，分别合成：根据目的基因的全序列，分别合成 40-50 40-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段，再通片段，再通 过过KlenowKlenow聚合酶及链接酶合成。聚合酶及链接酶合成。80分子克隆以以DNADNA变性复制的某些特性为原理，以目的变性复制的某些特性为原理，以目的DNADNA片段为模板片段为模板, , 利用酶促反应（利
74、用酶促反应（TaqTaq酶），酶），在特定引物的引导下，将加入的在特定引物的引导下，将加入的4 4种种dNTPdNTP由引由引物沿模板从物沿模板从5353按碱基配对原则按碱基配对原则, , 形成形成与模板与模板DNADNA互补的半保留复制链互补的半保留复制链, , 新合成的链新合成的链又可作为下一轮循环的模板。经又可作为下一轮循环的模板。经25-3025-30个循环个循环产物呈产物呈 2n 2n指数扩增，由指数扩增，由pggpgg（紫外可见）（紫外可见），可获得基因片段。，可获得基因片段。第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆酶促合成法（酶促合成法（PCRPCR扩增法）扩增法）
75、81分子克隆由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33端总是会带有一个非模板依赖端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为，因为Taq DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对dATPdATP具具有优先聚合活性。由于该突出碱基存，克隆时即可采取有优先聚合活性。由于该突出碱基存，克隆时即可采取TdTTdT末端同聚尾末端同聚尾的方法与载体连接，也可使用专门的的方法与载体连接，也可使用专门的T T载体克隆载体克隆。第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆82分子克隆从生物组织细
76、胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNA DNA ，用物理方法或酶法将，用物理方法或酶法将DNADNA降解降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNADNA片段片段与载体连接的重组与载体连接的重组DNADNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各组成一个含有基因组各DNADNA片段克隆的集合体，就称为基因组片段克隆的集合体，就称为基因组DNADNA文库。如果这个文库足
77、够大，能包含该生物基因组文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNADNA全部的序全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或全部基因或DNADNA序列。序列。基因组文库基因组文库（Genomic DNA Library）第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆83分子克隆基因组文库基因组文库构建过程构建过程第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆 分离纯化基因组分离纯化基因组DNADNA：提取哺乳动物细胞染色体：提取哺乳动物细胞染色体DNA DNA 制备全部基因组的制备全部
78、基因组的DNADNA片断片断 机械断裂法：用超声波或高速搅拌机械断裂法：用超声波或高速搅拌DNADNA溶液，断裂片段两端没溶液，断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端有与克隆载体匹配的粘末端, , 因此插入载体之前还需要进行修饰加因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用工，少用 限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoR,EcoR,现在用现在用Sau3ASau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。体连接。84分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆 DN
79、A DNA片断与载体的连接包装片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒、常用载体：粘性质粒、噬菌体、酵母人工染色体噬菌体、酵母人工染色体基因组基因组DNA +DNA +粘性质粒粘性质粒重组重组DNADNA转化细菌转化细菌 菌落菌落 基因组基因组DNA +DNA +噬菌体噬菌体 重组重组DNADNA包装成噬菌体包装成噬菌体感染细菌感染细菌 噬菌斑噬菌斑 1 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。全部基因片段总和。（4 4）目的基因的筛选）目的基因的筛选 特殊蛋白的编码基因（抗药性基因、结合蛋白编码基因等）特殊
80、蛋白的编码基因（抗药性基因、结合蛋白编码基因等） 正选择筛选（抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）正选择筛选（抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）85分子克隆cDNAcDNA是指以是指以mRNAmRNA为模板为模板, ,经反转录酶催化合成经反转录酶催化合成DNADNA，则此，则此DNADNA序列序列与与mRNAmRNA互补，称为互补互补，称为互补DNADNA或或cDNAcDNA。cDNAcDNA文库：文库：提取出组织细胞的全部提取出组织细胞的全部mRNAmRNA，在体外反转录成，在体外反转录成cDNAcDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后
81、转化受体菌，则每个细菌含有一段每个细菌含有一段cDNAcDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNAmRNA信息的信息的cDNAcDNA克隆集合称为该组织细胞的克隆集合称为该组织细胞的cDNAcDNA文库。文库。实际为不包含内含子的基因组文库。实际为不包含内含子的基因组文库。cDNAcDNA文库文库第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆86分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆cDNAcDNA文库的优点文库的优点以成熟以成熟mRNAmRNA为模板合成的为模板合成的cDNAcDNA无内含子，每个基因的无内含子，每个基因
82、的cDNAcDNA长度较基因组长度较基因组基因大为减小，使操作更为方便。基因大为减小，使操作更为方便。从从cDNAcDNA文库中筛选某一特定功能基因工作量较小。文库中筛选某一特定功能基因工作量较小。某一特定功能基因在某一特定功能基因在mRNAmRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数，利于获得较中拷贝数大于基因组中的拷贝数，利于获得较多的模板。多的模板。 可从全长可从全长cDNAcDNA序列中直接找到基因编码区，推测蛋白质的氨基因顺序，序列中直接找到基因编码区，推测蛋白质的氨基因顺序，分析其性质及功能等。分析其性质及功能等。基因克隆后可在原核细胞（大肠杆菌）中表达有生物活性的蛋白。基因克隆后可在原核
83、细胞（大肠杆菌）中表达有生物活性的蛋白。87分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆cDNAcDNA文库的构建程序文库的构建程序1.1.制备制备mRNAmRNA 1)1)取材：取材：mRNAmRNA约占总约占总RNARNA的的1 15 5，所以应选用，所以应选用目的基因目的基因mRNAmRNA表达最丰富的组织细胞为材料来表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2)2)从总的从
84、总的RNARNA中分离中分离mRNA mRNA 将提取的将提取的mRNAmRNA在寡聚在寡聚脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 oligo(dT) oligo(dT) 纤维素中进行纤维素中进行亲和亲和层析层析 88分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆2.2.第一股第一股 cDNA cDNA合成合成 以以Oligo(dT) Oligo(dT) 为引物：从模板为引物：从模板33末端开始，沿模板的末端开始，沿模板的3535方向合方向合成成, , 对于较长的对于较长的mRNAmRNA分子很难得到全长分子很难得到全长cDNAcDNA2 2）随机引物：以）随机引物：以6 68 8个核苷酸为随机
85、引物，从个核苷酸为随机引物，从mRNAmRNA的不同结合点合成全长的不同结合点合成全长cDNAcDNA第一链（第一链（RNA-DNARNA-DNA） 89分子克隆第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆3.3.第二股第二股cDNAcDNA的合成的合成 自身引导法：获得的自身引导法：获得的cDNA 5cDNA 5端会有几对碱基丢失。端会有几对碱基丢失。置换合成法：获得的置换合成法：获得的cDNA 5cDNA 5端会也会有几对碱基丢失。端会也会有几对碱基丢失。引导合成法：获得的引导合成法：获得的cDNA 5cDNA 5端能保留完整的序列。端能保留完整的序列。 自身引导法自身引导法置换
86、合成法置换合成法 引导合成法引导合成法90分子克隆4. 4. 构建构建cDNAcDNA文库文库cDNAcDNA加接头或衔接头（加尾反应）加接头或衔接头（加尾反应）双链双链cDNAcDNA与载体连接和导入宿主细胞与载体连接和导入宿主细胞 5.5.筛选目的基因筛选目的基因核酸杂交法核酸杂交法免疫结合法免疫结合法第四节第四节 目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆91分子克隆第五节第五节 基因工程受体基因工程受体目的基因能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用目的基因能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用合适的受体细胞合适的受体细胞、合适的合适的克隆载体克隆载体和和合适的基因转移方法合适的基因转移方
87、法受体细胞受体细胞从实验技术上讲是能摄取外源基因并使其稳定维持的细胞；从实验技术上讲是能摄取外源基因并使其稳定维持的细胞； 从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。以作为受体细胞。92分子克隆第五节第五节 基因工程受体基因工程受体经过适当处理后易接纳重组经过适当处理后易接纳重组DNA分子分子对载体的复制、扩增、表达无严格限制对载体的复制、扩增、表达无严格限制无特异性降解外源无特异性降解外源DN
88、A的酶系统的酶系统不会对外源不会对外源DNA分子进行修饰分子进行修饰能表达由重组子提供的某种表型特征能表达由重组子提供的某种表型特征利于转化子的筛选和鉴定利于转化子的筛选和鉴定受体细胞应具备的条件：受体细胞应具备的条件：93分子克隆感受态细胞感受态细胞：指具备接受外源：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞。能力的宿主细胞。大肠杆菌大肠杆菌：生长迅速，培养简单，重组子稳定。适用于外源生长迅速，培养简单，重组子稳定。适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的建立，是基因的高效表达、基因文库的建立，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。重组实验和基因工程的
89、主要受体菌。酵母菌酵母菌：具有真核生物的特征生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定。适具有真核生物的特征生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定。适用于外源用于外源DNA的扩增和克隆、真核生物基因的高效表达、基因文库的建立、真核生物基因表的扩增和克隆、真核生物基因的高效表达、基因文库的建立、真核生物基因表达的研究，是达的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。哺乳动物细胞哺乳动物细胞：与人的亲缘关系近，分子重组表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统，与人的亲缘关系近，分子重组表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统，生长缓慢
90、，培养条件苛刻。适用于哺乳动物和人的基因表达调控研究、基因药物生产，是生长缓慢，培养条件苛刻。适用于哺乳动物和人的基因表达调控研究、基因药物生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。第五节第五节 基因工程受体基因工程受体 在基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、在基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、动植物细胞等，且受体细胞常常应处于感受态的细胞。动植物细胞等，且受体细胞常常应处于感受态的细胞。94分子克隆DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）重组重组DNA分子的转化和筛选（转、增）分子的转化和筛选
91、（转、增）转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程95分子克隆一、一、DNA分子的体外连接分子的体外连接黏性末端黏性末端DNA片段的连接片段的连接 DNADNA连接酶能够催化外源连接酶能够催化外源DNADNA和载体和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子之间发生连接作用，形成重组的的DNADNA分子。应用分子。应用DNADNA连接酶可在体连接酶可在体外将具有黏性末端的外将具有黏性末端的DNADNA限制片段，限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可插入到适当的载体分子上，从而可能按照人们的意图构建出新的能按照人们的意图构建出新
92、的DNADNA杂杂种分子。种分子。 EcoR IEcoR I消化质粒和消化质粒和外源外源DNADNA形成的重组体形成的重组体 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程96分子克隆同种限制性内切酶产生的粘性末端的连接同种限制性内切酶产生的粘性末端的连接第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程同尾酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换粘性末端的更换97分子克隆平末端平末端DNA片段的连接片段的连接 T4DNA连接酶法连接酶法 同聚物加尾法同聚物加尾法 化学合成的衔接物连接化学合成的衔接物连接DN
93、A分子分子 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程98分子克隆同聚物加尾法同聚物加尾法 应用末端脱氧核苷酸转移酶，能够将应用末端脱氧核苷酸转移酶，能够将核苷酸加到核苷酸加到DNADNA分子单链延伸末端的分子单链延伸末端的3-OH3-OH基团上，它并不需要模板链的基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴。由核苷酸组成的尾巴。需用需用55特异的核酸外切酶处理平末端特异的核酸外切酶处理平末端的的DNADNA分子上产生带分子上产生带3-OH3-OH的单链延伸。的单链延伸。 第六节第六节 重组重组DNADNA分子
94、的操作过程分子的操作过程99分子克隆用化学合成的衔接物连接用化学合成的衔接物连接DNADNA分子分子 衔接物衔接物(1inker)，是指用化学方是指用化学方法合成的一段由法合成的一段由10-12个核苷酸组成个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的，具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。的寡核苷酸片段。 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程100分子克隆二、重组二、重组DNA分子的转化分子的转化转化转化（transformation）作用就是一种基因型细胞从周围介质中吸收来自）作用就是一种基因型细胞从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的另一种基因型细胞的DN
95、ADNA，进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变，进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。化的现象。现已发现多种细胞具有转化能力，但只有当细胞生长到一定的生理状态，一现已发现多种细胞具有转化能力，但只有当细胞生长到一定的生理状态，一般称之为感受态细胞时，菌体细胞才具备摄取外源般称之为感受态细胞时，菌体细胞才具备摄取外源DNA的能力。细菌处于的能力。细菌处于容易吸收外源容易吸收外源DNA的状态叫的状态叫感受态细菌感受态细菌。第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程101分子克隆原生质体转化法原生质体转化法革兰氏阳性菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性
96、菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细的主要屏障是细胞壁，因而这类细胞通常采用胞壁，因而这类细胞通常采用原生质原生质（细胞去壁以后的形态）转化的方（细胞去壁以后的形态）转化的方法转移质粒或重组法转移质粒或重组DNA分子。分子。原生质体转化法的原理是：先除去细胞壁，待外源原生质体转化法的原理是：先除去细胞壁，待外源DNADNA进入细胞后放在有进入细胞后放在有利于再生细胞壁的培养基中培养。利于再生细胞壁的培养基中培养。 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程102分子克隆化学转化法化学转化法Ca 2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌等），诱
97、导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌等），1970年建立此项技术，其原理是年建立此项技术，其原理是Ca 2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经脉冲收缩作用，使细胞膜出与空隙（此时细菌称为感受晶结构，后者经脉冲收缩作用，使细胞膜出与空隙（此时细菌称为感受态细菌态细菌 ），有利于外源），有利于外源DNA或重组或重组DNA分子的进入分子的进入 。第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程103分子克隆电穿孔转化法电穿孔转化法其基本原理是利用高压脉冲电场，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，其基本原理是利用高压脉冲电场，在宿主细胞表面形成
98、暂时性的微孔，质粒质粒DNA可乘隙而入，在脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数可乘隙而入，在脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，质粒复制。小时后，细胞增殖，质粒复制。 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程104分子克隆通过接合作用传递质粒通过接合作用传递质粒DNADNA 质粒由质粒由F+向向F-菌的转移过程叫接合作用传递质粒，又称质粒的接合传递菌的转移过程叫接合作用传递质粒，又称质粒的接合传递 通过转染通过转染/ /转导作用传递遗传物质转导作用传递遗传物质 转染转染：病毒（含噬菌体）及其重组子：病毒（含噬菌体）及其重组子DNA导入宿主细胞称转
99、染。导入宿主细胞称转染。转导转导：以噬菌体为媒介，将外源：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。导入细菌的过程称转导。 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程105分子克隆三、转化子的筛选和鉴定三、转化子的筛选和鉴定直接筛选法直接筛选法 抗药性标记选择抗药性标记选择 插入失活法插入失活法 标志补救法标志补救法 分子杂交法分子杂交法 原位杂交、原位杂交、Southern印迹印迹非直接筛选法非直接筛选法 免疫学方法免疫学方法 酶免检测法酶免检测法 第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程106分子克隆大多数克隆载体均带有抗生素抗性基大多数克
100、隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因、抗因，常见的有抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因、抗卡那霉素基因等。如四环素基因、抗卡那霉素基因等。如果外源果外源DNA片段插入载体的位点在片段插入载体的位点在抗抗药性基因之外药性基因之外，不导致抗药性基因的，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。相应药物的琼脂平板上生长成菌落。抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程107分子克隆抗药性标记插入失活型筛选抗
101、药性标记插入失活型筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程大多数克隆载体均带有抗生素抗性基大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因、抗因，常见的有抗氨苄青霉素基因、抗四环素基因、抗卡那霉素基因等。如四环素基因、抗卡那霉素基因等。如果外源果外源DNA片段插入载体的位点在某片段插入载体的位点在某个个抗药性基因之内抗药性基因之内，导致抗药性基因，导致抗药性基因失活，这种含有重组子的转化细胞能失活，这种含有重组子的转化细胞能够在此种药物的琼脂平板上不能生长够在此种药物的琼脂平板上不能生长成菌落。成菌落。108分子克隆载体分子上携带某种显色酶载体分子上携带某
102、种显色酶基因，其表达产物能使细胞基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨产生颜色反应，从而易于辨认和筛选，当有外源基因插认和筛选，当有外源基因插入该显色基因后，其显色反入该显色基因后，其显色反应消失。应消失。-半乳糖苷酶插入失活型筛选半乳糖苷酶插入失活型筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程109分子克隆载体分子上携带某种营养组载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此分将转化细胞涂布在不含此分的培养基上，长出的便是转的培养基上，长出的便是转化子（即阳性克
103、隆）。化子（即阳性克隆）。营养缺陷型筛选营养缺陷型筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程110分子克隆先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移至另一硝膜或琼脂平板上，再转移至另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异异DNA或或RNA探针进行分子杂交，探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。本方法能然后挑选阳性克隆菌落。本方法能进行大规模操作，一次可筛选多个进行大规模操作，一次可筛选多个菌落或噬菌斑，对于从基因文库中菌落或噬菌斑，对于从基因文库中挑选目的重组子，是一项首选的方挑选目的重组子，是一项首
104、选的方法。法。原位杂交法筛选原位杂交法筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程111分子克隆为为了了进进一一步步确确定定DNA插插入入片片段段的的正正确确性性，在在内内切切酶酶消消化化重重组组子子凝凝胶胶电电泳泳分分离离后后，通通过过Southern印印迹迹转转移移将将DNA移移至至硝硝酸酸纤纤维维膜膜上上，再再用用放放射射性性核核素素或或非非放放射射性性标标记记的的相相应应外外源源DNA片片段段作作为为探探针针，进进行行分分子子杂杂交交，鉴鉴定定重重组组于于中中的的插插入入片段是否是所需的靶基因片段。片段是否是所需的靶基因片段。Southern 法筛选法筛选第六节第
105、六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程112分子克隆对对于于初初步步筛筛选选鉴鉴定定具具有有重重组组子子的的菌菌落落，应应小小量量培培养养后后，再再分分离离出出重重组组质质粒粒或或重重组组噬噬菌菌体体DNA，用用相相应应的的内内切切酶酶(1种种或或2种种)切切割割重重组组子子释释放放出出插插入入片片段段，对对于于可可能能存存在在双双向向插插入入的的重重组组子子还还要要内内切切酶酶消消化化鉴鉴定定插插入入方方向向，然然后后凝凝胶胶电电泳泳检检测测插插入入片段和载体的大小。片段和载体的大小。 限制性酶切限制性酶切法筛选法筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作
106、过程1.Marker DNA 2.空载体单酶切3.重组质粒单酶切4.重组质粒双酶切5.以重组质粒为模板的PCR（目的片段） 113分子克隆检检测测阳阳性性的的重重组组质质粒粒送送出出测测序序； 序列比对。序列比对。 DNA序列分析序列分析法筛选法筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程114分子克隆 淀淀粉粉酶酶能能将将难难溶溶的的淀淀粉粉水水解解成成多多糖糖或或单单糖糖，将将难难溶溶的的淀淀粉粉加加入入固固体体培培养养基基中中，培培养养基基呈呈混混浊浊状状。将将待待鉴鉴定定的的重重组组克克隆隆涂涂布布在在此此培培养养基基上上，含含有有目目的的基基因因的的重重组组子子
107、周周围围会会形形成成透透明明斑斑。如如透透明明斑斑不不明明显显，还还可可以以向向培培养养板板上上喷喷碘碘，使使淀淀粉粉所所在区域呈蓝色本底，易于辨认。在区域呈蓝色本底，易于辨认。 蛋蛋白白酶酶、脂脂肪肪酶酶等等目目的的基基因因也也可可采采用用类类似似的的方方法法进进行行鉴鉴定。定。 蛋白质生物学功能法蛋白质生物学功能法筛选筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程115分子克隆 在在琼琼脂脂糖糖培培养养基基中中加加入入目目标标蛋蛋白白的的特特性性抗抗体体，然然后后涂涂布布转转化化液液，经经培培养养后后目目的的重重组组子子菌菌落落会会分分泌泌出出目目标标蛋蛋白白，后后者者
108、与与特特异异性性抗抗体体发发生生免免疫疫沉沉淀淀，在在菌菌落落周周围围形形成成白色的圆斑。白色的圆斑。免疫沉淀法免疫沉淀法筛选筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程116分子克隆 如如果果待待筛筛选选的的蛋蛋白白即即不不能能测测定定生生物物活活性性，又又无无现现成成的的抗抗体体使使用用，则则可可采采用用聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法进行粗略的筛选。进行粗略的筛选。聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选筛选第六节第六节 重组重组DNADNA分子的操作过程分子的操作过程117分子克隆限制性内切酶限制性内切酶DNADNA连接酶连接酶基因载体基因载体目的基因
109、目的基因 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成 基因文库基因文库有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因 重组体重组体 转化转化 转染转染 体外包装体外包装带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 表型筛选表型筛选 电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交 免疫学方法免疫学方法目的基因的表达目的基因的表达118分子克隆农业应用农业应用获得高产、稳产和具有优良品质的农作物（获得高产、稳产和具有优良品质的农作物（“向日葵豆向日葵豆”）培育具有抗逆性的作物新品种（抗虫、抗病毒、抗除草剂、培育具有抗逆性的作物新品种（抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗高温、抗干旱）抗盐碱、抗高温、抗干旱）第七节第七节 基因工程的应用基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物（超级小鼠、超级绵羊、超培育体形巨大品质优良的动物（超级小鼠、超级绵羊、超级鱼）级鱼）利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达，获得人们需要的利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达，获得人们需要的物质（激素、抗体、酶）物质（激素、抗体、酶）食品工业食品工业-开辟新是食品来源（鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中）开辟新是食品来源（鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中）畜牧养殖业畜牧养殖业119分子克隆世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼（上面）120分子克隆本章结束121分子克隆
