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1、流式细胞仪(流式细胞仪(Flow Cytometer)基础基础(jch)简介简介中科院生物物理研究所中国科学院蛋白质科学研究平台(pngti)2005年3月 刘春春第一页,共二十六页。主要主要(zhyo)内容内容l流式细胞仪概要(giyo)l流式细胞仪的工作原理l流式细胞仪测量的对象第二页,共二十六页。什么什么(shn me)是流式细胞仪是流式细胞仪流式细胞仪实物流式细胞仪实物(shw)(shw)BD FACSVantageBD-Calibur 第三页,共二十六页。l流式细胞仪基本(jbn)结构第四页,共二十六页。FCMFCM的定义的定义(dngy)(dngy) 流式细胞仪是指,使细胞(或其他
2、粒子)以单个方式依次高速通过激发光束,采集细胞被光照时产生的各种信号(xnho),对信号(xnho)进行处理,并对各参数进行关联分析的一种仪器。第五页,共二十六页。l对比 流式细胞仪是一种(y zhn)特殊的显微镜 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息第六页,共二十六页。流式细胞仪 蛋白胶 多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易第七页,共二十六页。l功能特点 (1)多参数定量分析每一个(y )细胞; (2)细胞分选; 高纯度:99%以上; 可分析小于1/10000比例
3、的稀有细胞群; 单细胞克隆等。 (3)高通量(分析(fnx)分选) 分析150,000个/ 秒 分选100,000个/秒 第八页,共二十六页。l应用领域 疾病诊断生物学基础研究环境监测(hun jn jin c)海洋微生物研究农业领域应用等等 70年代美国为攻克癌症而建造。厂商(chngshng):Becton-DicksonCoulter-BeckmanDOCytomation 已成为一个几十亿美金的产业第九页,共二十六页。流式细胞仪工作流式细胞仪工作(gngzu)原原理理流体(lit)动力学聚焦流动(lidng)室激光聚焦液流与光源第十页,共二十六页。探测(tnc)光路聚焦第十一页,共二十
4、六页。二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光,荧光 光信号(xnho)分离,导向,各探测通道PMT接收并转化为电信号(xnho)。光信号(xnho)收集第十二页,共二十六页。数据处理数据处理FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数(du sh) 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲(michng)处理,模数转换光信号(xnho)电信号记录数据,显示结果(面积,峰高,宽度)第十三页,共二十六页。流式细胞仪产生流式细胞仪产生(chnshng)的信号的信号l非荧光(ynggung)信号颗粒(kl)度细胞大小第十四页,共二十六页。散射光信号区分裂解(l
5、i ji)后的外周血细胞群第十五页,共二十六页。l荧光(ynggung)信号 荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量(hnling)的定量多荧光标记胞内多种组分,实现多参数测量第十六页,共二十六页。PIAnnexinV细胞(xbo)凋亡检测DNA含量(hnling)-PIAnnexin-V第十七页,共二十六页。CD45 FITC (log)R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45单核细胞)R3=中性粒细胞 (CD45单核细胞) CD14 PE (log)前向散射光 (linear)侧向(c xin)散射光(linear)PEFITC荧光标记
6、检测(jin c)外周血裂解后细胞群第十八页,共二十六页。细胞(xbo)分选第十九页,共二十六页。流式细胞仪的测量流式细胞仪的测量(cling)对象对象l大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围:0.2uM-300uM。l对象类型 细胞类型: (1) 高等真核细胞; (2)酵母; (3)细菌(xjn); (4)多细胞的聚集体,如胰岛等。 非生命颗粒: 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。第二十页,共二十六页。l流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例 1)不需染色: 大小,胞浆颗粒度,细胞自发荧光,色素,细胞精确计数。 2)需染色或标记: 细胞组分: 细胞膜:流动性,通透性,膜电位
7、细胞内离子:H+(可检测PH值),Na+,K+,Ca2+(结合的和 自由 的)。 核酸:DNA含量,DNA成分,DNA合成,RNA,染色质结构等 总蛋白质 蛋白质分子(fnz)间相互作用 抗原 细胞骨架成分 受体第二十一页,共二十六页。功能属性:酶活性细胞凋亡(dio wn)细胞坏死细胞活性氢硫基凝血素结合位点药物动力学.经验之谈:凡细胞内能进行荧光标记的成分或者(huzh)某种变化,都可用流式细胞仪进行检测。第二十二页,共二十六页。G1S phaseG2MG112 1DNA含量(hnling) DNA 含量(hnling)细胞周期时相G0/1G2/MS细胞(xbo)数细胞周期分析第二十三页,
8、共二十六页。Hoechst33258(AT)Chromomycin A3 (GC)白血病患者(hunzh)2456X89-127recip 9-221314151617Y 1820192221Ph1 / 3染色体组型测定(cdng)13第二十四页,共二十六页。生物物理所现有生物物理所现有(xin yu)流式细胞仪流式细胞仪l型号:BD FACSVantage SEl参数(cnsh):分析10,000个/秒,分选7,000个/秒;激光:488nm,UV;四色荧光通道。l地点:1406l联系方式:电话64839306 或 :64862503 电子邮件第二十五页,共二十六页。内容(nirng)总结流式细胞仪(Flow Cytometer)基础简介。2005年3月 刘春春。容易检测各个参数间的相关性 不容易。(3)高通量(分析分选)。光信号分离,导向,各探测通道PMT接收并转化为电信号。多荧光标记(bioj)胞内多种组分,实现多参数测量。CD14 PE (log)。经验之谈:凡细胞内能进行荧光标记(bioj)的成分或者某种变化,都可用流式细胞仪进行检测。2 1。Y 18。1 / 3第二十六页,共二十六页。