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1、心血瘀阻证动态演变过程研究n一、目一、目 的的n二、方二、方 法法n三、结三、结 果果n四、讨四、讨 论论内容提要内容提要内容提要内容提要一、目一、目 的的 证并非固定不变，证的发生发展、证与证的演变是动证并非固定不变，证的发生发展、证与证的演变是动态的，构成证的各个要素态的，构成证的各个要素 (病因、病机、病位、病性、病病因、病机、病位、病性、病势等势等)亦是不断变化的，为此有学者提出动态变化是证的基亦是不断变化的，为此有学者提出动态变化是证的基本特征。本项目通过对动脉粥样硬化心肌缺血的过程复制，本特征。本项目通过对动脉粥样硬化心肌缺血的过程复制，模拟心血瘀阻证动态演变实验动物模型，为进一步
2、探索心模拟心血瘀阻证动态演变实验动物模型，为进一步探索心血瘀阻证生物学机制提供有益的帮助。血瘀阻证生物学机制提供有益的帮助。（一）造模（一）造模二、方二、方 法法造模方式及模型评价体系均参照相关文献，分三阶段复制大鼠模型。造模方式及模型评价体系均参照相关文献，分三阶段复制大鼠模型。（一）造模（一）造模二、方二、方 法法第一阶段，第一阶段，“血瘀证前期血瘀证前期”大鼠模型的建立大鼠模型的建立 。高脂血症。高脂血症（一）造模（一）造模二、方二、方 法法第二阶段：第二阶段：“亚血瘀证期亚血瘀证期”大鼠模型的建立：大鼠模型的建立：（一）造模（一）造模二、方二、方 法法第三阶段：第三阶段：第三阶段：第三
3、阶段：“心血瘀阻证期心血瘀阻证期心血瘀阻证期心血瘀阻证期”大鼠模型的建立：大鼠模型的建立：大鼠模型的建立：大鼠模型的建立： （三）代谢组学技术（三）代谢组学技术二、方二、方 法法GC-MS GC-MS GC-MS GC-MS 样本预处理：样本预处理：样本预处理：样本预处理：去蛋白，衍生化去蛋白，衍生化去蛋白，衍生化去蛋白，衍生化GC-MSGC-MSGC-MSGC-MS分析条件色谱条件：分析条件色谱条件：分析条件色谱条件：分析条件色谱条件： AgilentHP-5MSAgilentHP-5MS进样口温度：进样口温度：进样口温度：进样口温度：280280，分流比：，分流比：，分流比：，分流比：10
4、:110:1，程序升温：，程序升温：，程序升温：，程序升温：初始温度初始温度初始温度初始温度100100（保持（保持（保持（保持3min3min），以），以），以），以6/min6/min升至升至升至升至300300（保持（保持（保持（保持8min8min），进样量：），进样量：），进样量：），进样量：1L1L，载气：高纯氦气（，载气：高纯氦气（，载气：高纯氦气（，载气：高纯氦气（99.999%99.999%），柱流速：），柱流速：），柱流速：），柱流速：1.0ml/min1.0ml/min。质谱条件：质谱条件：质谱条件：质谱条件：离子源温度：离子源温度：离子源温度：离子源温度：150150，
5、四级杆温度：，四级杆温度：，四级杆温度：，四级杆温度：230230，接口温，接口温，接口温，接口温度：度：度：度：280280，电离电压：，电离电压：，电离电压：，电离电压：70eV70eV，采用全扫描模式，扫描范围：，采用全扫描模式，扫描范围：，采用全扫描模式，扫描范围：，采用全扫描模式，扫描范围：30-800m/z30-800m/z，溶剂延迟，溶剂延迟，溶剂延迟，溶剂延迟3min3min。 （一）血液流变学比较（一）血液流变学比较 三、结三、结 果果（一）血液流变学比较（一）血液流变学比较 三、结三、结 果果（二）血脂比较（二）血脂比较 三、结三、结 果果（二）血脂比较（二）血脂比较 三、
6、结三、结 果果（三）（三）GC-MS分析结果分析结果 三、结三、结 果果图1 血浆GC-MS分析总离子流图（三）（三）GC-MS分析结果分析结果 三、结三、结 果果 利用安捷伦自带质谱数据库对共有的内源性代利用安捷伦自带质谱数据库对共有的内源性代谢物作鉴定，以通常匹配度大于谢物作鉴定，以通常匹配度大于8080的鉴定结果作的鉴定结果作为较为可信的物质。挑选后共有峰后发现血浆内共为较为可信的物质。挑选后共有峰后发现血浆内共有内源性代谢物有内源性代谢物3232种种。（三）七组大鼠血浆（三）七组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果图1 大鼠血浆7组样本得分图（*第1阶段正常组 +第2阶段正常组 第3
7、阶段正常组 血瘀证前期组 亚血瘀证组 心血瘀阻证组 假手术组）（三）七组大鼠血浆（三）七组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果图3 大鼠血浆7组样本得分图（*第1阶段正常组 +第2阶段正常组 第3阶段正常组 血瘀证前期组 亚血瘀证组 心血瘀阻证组 假手术组）（三）七组大鼠血浆（三）七组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果图2 大鼠血浆7组因子载荷图（三）七组大鼠血浆（三）七组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果图4大鼠血浆自变量VIP图（三）七组大鼠血浆（三）七组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果（三）代谢产物变化趋势（三）代谢产物变化趋势三、结三、结 果果（三）七组大鼠血浆（三）七
8、组大鼠血浆PLS-DA三、结三、结 果果依据依据PCAPCA结论，研究发现影响正常结论，研究发现影响正常血瘀证前期血瘀证前期亚血瘀证期亚血瘀证期心血瘀阻证期心血瘀阻证期变化过程的重要因子依次为变化过程的重要因子依次为柠檬酸、胆固醇、肌醇、鸟氨酸、脯氨酸、异亮柠檬酸、胆固醇、肌醇、鸟氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、硬脂酸、乳酸、尿素、亮氨酸、亚油酸、甘露糖。氨酸、硬脂酸、乳酸、尿素、亮氨酸、亚油酸、甘露糖。血瘀证形成过程中各阶段代谢标志物血瘀证形成过程中各阶段代谢标志物血瘀证前期：血瘀证前期：硬脂酸、乳酸（正相关），甘露糖（负相关）。硬脂酸、乳酸（正相关），甘露糖（负相关）。亚血瘀证期：亚血瘀证期：鸟氨
9、酸、脯氨酸、肌醇（正相关），异亮氨酸（负相关）。鸟氨酸、脯氨酸、肌醇（正相关），异亮氨酸（负相关）。心血瘀阻证：心血瘀阻证：亮氨酸、异亮氨酸、柠檬酸（正相关）、乳酸（负相关）。亮氨酸、异亮氨酸、柠檬酸（正相关）、乳酸（负相关）。四、讨四、讨 论论 阳气运化水湿，阳气不足则水湿内停，凝聚成痰，痰浊入脉；痰浊阳气运化水湿，阳气不足则水湿内停，凝聚成痰，痰浊入脉；痰浊黏滞于血脉之内，留而不去，凝结成块，久病入络，血府枯涩，脂浊胶黏滞于血脉之内，留而不去，凝结成块，久病入络，血府枯涩，脂浊胶结于固涸之脉管，形成坚块，脉络滞塞；血运不畅，瘀血内停，心失所结于固涸之脉管，形成坚块，脉络滞塞；血运不畅，瘀血
10、内停，心失所养，发为心血瘀阻证。因此高脂饲料喂养大鼠，形成痰浊内聚，符合心养，发为心血瘀阻证。因此高脂饲料喂养大鼠，形成痰浊内聚，符合心血瘀阻证的病因，随着动脉粥样硬化的形成则体现出痰结血府的病理特血瘀阻证的病因，随着动脉粥样硬化的形成则体现出痰结血府的病理特点，通过冠状动脉结扎法形成心血瘀阻证。点，通过冠状动脉结扎法形成心血瘀阻证。 （一）中医理论依据（一）中医理论依据阳虚阳虚血瘀血瘀痰浊痰浊。起始起始 转归转归四、讨四、讨 论论血瘀证前期：血瘀证前期：血脂水平显著增高，血液流变学指标中血浆粘度水平显著血脂水平显著增高，血液流变学指标中血浆粘度水平显著增高表明模型复制成功。增高表明模型复制成
11、功。亚血瘀证期：亚血瘀证期：主动脉进行主动脉进行HEHE染色检测，主动脉内膜明显增厚，内皮排列染色检测，主动脉内膜明显增厚，内皮排列不完整，内膜增生显著，伴有大量泡沫细胞，主动脉粥样斑块形成。血不完整，内膜增生显著，伴有大量泡沫细胞，主动脉粥样斑块形成。血流变、血脂指标持续增高表明模型复制成功。流变、血脂指标持续增高表明模型复制成功。心血瘀阻证：心血瘀阻证：结扎冠状动脉左前降支，心电图结扎冠状动脉左前降支，心电图ST-TST-T抬高，呈旗帜样改变，抬高，呈旗帜样改变，血脂水平稳定在一个较高的水平，血流变指标进行一步层高中红细胞聚血脂水平稳定在一个较高的水平，血流变指标进行一步层高中红细胞聚集，
12、中切较心血瘀阻证前期显著增高。表明心血瘀阻证模型复制成功。集，中切较心血瘀阻证前期显著增高。表明心血瘀阻证模型复制成功。（二）确认动物模型（二）确认动物模型。（三）（三）GC-MS分析结果分析结果 三、结三、结 果果为此本课题组设想心血瘀阻证动态演变的特点是：为此本课题组设想心血瘀阻证动态演变的特点是：痰浊内聚，注入血脉，血瘀证前期：痰浊内聚，注入血脉，血瘀证前期：高脂饮食引起体内脂质代谢紊乱，高脂饮食引起体内脂质代谢紊乱，机体启动抗炎。机体启动抗炎。痰结血府，脉络滞塞，亚血瘀证期：痰结血府，脉络滞塞，亚血瘀证期：持续高脂饮食所导致的尿素循环持续高脂饮食所导致的尿素循环紊乱、肠道菌群失调、血管形态改变、肝脏功能障碍。紊乱、肠道菌群失调、血管形态改变、肝脏功能障碍。血行不畅，心失所养，心血瘀阻期：血行不畅，心失所养，心血瘀阻期：急性心肌缺血后引起的糖代谢障急性心肌缺血后引起的糖代谢障碍。碍。
