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1、课题1 微生物的实验室培养专题2 微生物的培养与应用1.提供合适的营养和环境条件2.防止其他微生物其他微生物污染2 2. .基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐3 3. .特殊营养：特殊营养：（有些微生（有些微生物需要）物需要）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）4 4.pH.pH、氧气、二氧化碳、渗透压的需求：、氧气、二氧化碳、渗透压的需求：一、培养基一、培养基如如: :生长因子生长因子(即细菌生长必需，即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物而自身不能合成的化合物,如维生如维生素、某些氨基酸、碱基等素、某些氨基酸、碱基等) ) 按照微生
2、物对按照微生物对营养物质营养物质的不同需求，配制出的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。供其生长繁殖的营养基质。1.1.概念：概念：不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方营养物质营养物质定义定义作用作用主要来源主要来源碳源碳源凡能提供凡能提供所需碳元所需碳元素的物质素的物质合成生物体的合成生物体的细胞物质和一细胞物质和一些代谢产物；些代谢产物；有些是异养生有些是异养生物的能源物质物的能源物质氮源氮源凡能提供凡能提供所需氮元所需氮元素的物质素的物质合成蛋白质、合成蛋白质、核酸以及含氮核酸以及含氮的代谢产物的代谢产物无机无机化合物：化合物：CO2、Na
3、HCO3 等。等。有机有机化合化合物：糖类、物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、脂肪酸、花生粉饼、石油、石油、牛肉膏、蛋白牛肉膏、蛋白胨胨等等无机化合物：无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐。、铵盐、硝酸盐。有机有机化合物：化合物：尿素、尿素、牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、酵酵母膏母膏等等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物注：含注：含C C、H H、O O、N N的的有机物有机物是是异异养型微养型微生物的生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源，如牛肉膏如牛肉膏硝化细菌硝化细菌营养物质营养物质定义定义作用作用主要来源主要来源生长因子生长因子生长必不生长必不可少的微可少的微量有机物量有机物酶和核酸的
4、组成成酶和核酸的组成成分分无机盐无机盐矿物质矿物质参与酶的组成；调参与酶的组成；调节渗透压节渗透压水水作为溶剂和运输的作为溶剂和运输的介质；参与生化反介质；参与生化反应应牛肉膏、酵母膏、牛肉膏、酵母膏、动物组织提取液等动物组织提取液等备注：备注：(1)不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。(2)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。的氮源是铵盐、硝酸盐。(3)对异养微生物来说，含对异养微生物来说，含 C、H、O、N 的化合物既是碳源又的化合物既是碳源又是氮源和能量来源。
5、是氮源和能量来源。(4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。些物质所需要的酶或合成能力有限。划分划分标准准培养基种培养基种类特点特点用途用途物理性物理性质化学成分化学成分天然天然培养基培养基合成合成培养基培养基用途用途或或功能功能鉴别培养基培养基培养基的种类培养基的种类不加凝固不加凝固剂加凝固加凝固剂，如，如琼脂脂工工业生生产，增加某，增加某某菌的某菌的浓度或度或产物物微生物微生物分离、分离、鉴定、定、活菌活菌计数、保藏菌数、保藏菌种种含化学成分不明确含化学成分不明确的天然物的天然物质工工业生生产培
6、养基成分明确培养基成分明确分分类、鉴定定在培养基中加入某种化在培养基中加入某种化学物学物质, ,以抑制不需要的以抑制不需要的微生物的生微生物的生长, ,促促进所需所需要的微生物的生要的微生物的生长培养、培养、分离出分离出特定微生物特定微生物在培养基中加入某种指在培养基中加入某种指示示剂或化学或化学药品品, ,用以用以鉴别不同种不同种类的微生物的微生物鉴别不同种不同种类微生物微生物选择培养基培养基液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基划分划分标准准培养基种培养基种类特点特点用途用途物理性物理性质培养基的种类培养基的种类不加凝固不加凝固剂加凝固加凝固剂，如如琼脂脂工工业生生产，有利于微生物，有利
7、于微生物的大量繁殖，从而的大量繁殖，从而增加某增加某某菌的某菌的浓度度或或产物、物、显微微直接直接计数法数法微生物微生物分离、分离、鉴定、定、培养菌培养菌落，进行落，进行活菌活菌计数、保藏菌数、保藏菌种、种、动植物的组织动植物的组织液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基平板平板划线法，用于微生物的分离（简单）划线法，用于微生物的分离（简单）稀释涂布稀释涂布平板平板法，用于微生物的分离法，用于微生物的分离(复杂复杂),活菌计数活菌计数在固体培养基上的接种方法？在固体培养基上的接种方法？加入青霉素加入青霉素( (是抗生素，杀细菌是抗生素，杀细菌) )的培养基的培养基: :不加氮源的无氮培养基不加
8、氮源的无氮培养基: : 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基: : 几种选择培养基举例：几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离固氮菌 分离自养型微生物分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌分解纤维素的细菌1 1. .无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程2 2. .消毒与灭菌消毒与灭菌? ?酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台关键是防止外来杂菌的污染关键是防止外来杂菌的污染二、无菌技术二、
9、无菌技术耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基
10、，100KPa、121、1530min关键是防止外来杂菌的污染关键是防止外来杂菌的污染2 2. .消毒与灭菌：消毒与灭菌：二、无菌技术二、无菌技术四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化培养分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形成单个菌落3.3.功能：功能：单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体(菌落菌落)1.1.定义：定义：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培
11、养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿倒平板倒平板约约50倒置：防止皿盖上的水珠倒置：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培
12、养基防止瓶口的微生物污染培养基倒置倒置1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝
13、后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。落入培养基，造成污染。思考讨论思考讨论 （课（课P17P17）4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？吗？为什么？答：空气中的
14、微生物可能在皿盖与皿底之间的培养答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。学生看课学生看课P18平板划线法的操作平板划线法的操作在给学生看平板划线法的视频在给学生看平板划线法的视频制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：接种方法接种方法: :平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基？防止划破培养基？（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化
15、培养平板划线时不能划破培养基，为什么？平板划线时不能划破培养基，为什么？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。状的菌落。1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？吗？为什么？是为了避免接种环上可能是为了避免
16、接种环上可能存在的微生物污染培养物存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。避免细菌污染环境和感染操作者。操作的第一步灼烧接种环：操作的第一步灼烧接种环：每次划线之每次划线之前都要灼烧前都要灼烧接种环接种环：在划线操作结束在划线操作结束时，仍然需要灼时，
17、仍然需要灼烧接种环烧接种环：2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？上一次划线的末端开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌划线次数的增加而逐
18、步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。繁殖而来的菌落。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106接种方法接种方法 : :稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移液器移液器稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼冷冷涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平
19、板(重复组，取平均值重复组，取平均值)平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法：涂布平板的所有操作都应该在火焰附近进行。结涂布平板的所有操作都应该在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第第2 2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证答：应从操作的各个细节保证“无菌无菌”，例如，酒，例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等平板划线法：平板划线法：制备牛肉膏蛋白
20、胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱恒温箱中培养中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录四、大肠杆菌的纯化培养四、大肠杆菌的纯化培养接种接种方法方法下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( )( ) A. A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.消灭杂菌消灭杂菌 C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须在接种前灭菌
21、必须在接种前B B灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。菌种也杀死。菌种也杀死。菌种也杀死。灭菌的目的灭菌的目的灭菌的目的灭菌的目的发酵所用的微生
22、物是灭菌后专门接种的发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的五、课题成果评价五、课题成果评价 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同同，及时观察记录的同学会发现这一点。，及时观察记录的同学会发现这一点。（一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格如果如果未接种的未接种的培养基在恒温箱中保温培养基在恒温箱中保温12 d后后无菌落生无菌落生长，长，说明培养基的制备说明培养基的制备是成功的是成功的，否则需要重新制备。，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无
23、菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求接种操作是符合要求的的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录1.1.临时保藏：临时保藏： 试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：
24、菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020六、课题延伸（菌种的保藏）六、课题延伸（菌种的保藏）本课题知识小结本课题知识小结微微生生物物的的实实验验室室培培养养培养基培养基无菌技术无菌技术制备牛肉蛋白胨固制备牛肉蛋白胨固体培养基体培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌结果分析与评价结果分析与评价培养基的类型培养基的类型培养基的营养物质培养基的营养物质避免杂菌污染的方法避免杂菌污染的方法实验室常用的消毒方法实验室常用的消毒方法实验室常用的灭菌方法实验室常用的灭菌方法平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法（步骤）（步骤）编号编号成分成分含量含量粉状
25、硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gH H2 2O O100ml100ml例例3 3右表是某微生物右表是某微生物培养基成分，请据此回培养基成分，请据此回答：答：（1 1）表中营养成分共）表中营养成分共有有 类。类。（2 2）右表培养基可培）右表培养基可培养的微生物类型是养的微生物类型是 。 自养型微生物自养型微生物 3 （3 3）若除去成分）若除去成分 （NHNH4 4) )2 2SOSO4 4
26、，加（，加（CHCH2 2O O），该培养基可用于培养），该培养基可用于培养 。（5 5）不论何种培养基，在各种成分都）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是溶化后分装前，要进行是 。（6 6）右表中各成分重量确定的原则是）右表中各成分重量确定的原则是 。（7 7）若右表培养基用于菌种鉴定，应）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是该增加的成分是 。固氮微生物固氮微生物 调整调整pHpH 依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂） 课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿
27、素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能不能直接直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分分解成氨解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ CO+ CO2 22NH2NH3 3+ H+ H2 2O O尿素是尿素是培养基中的培养基中的唯一氮源唯一氮源， 只有能合成只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素，的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生
28、长。以尿素作为氮源，才能生长。 缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5 5、该培养基选择分解尿素的微生物的原理、该培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将在微生物学中，将允许允许特定种类的微生物生长，同时特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血
29、球计数板，在显微镜下计算一定容积，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。. .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表
30、原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加到到三个或三个以上三个或三个以上的
31、平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。( (即设置重复组求平即设置重复组求平均数均数) )统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。（一）土壤取样（一）土壤取样（二）制备培养基（二）制备培养基（三）土壤样品的稀释（三）土壤样品的稀释（四）取样涂布（四）取样涂布（五）微生物的培养与观察（五）微生物的培养与观察（八）鉴定（八）鉴定（七）细菌的计数（七）细菌的计数二二. .实验的操作流程实验的操作流程 选择培养基（尿素培养基）选择培养基（尿素培养基）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基(作对照作对照)（六）鉴定（六）鉴定：筛选后必鉴定：筛
32、选后必鉴定 鉴别培养基鉴别培养基：加入某种指示剂或化学加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存药品，不影响微生物的生存1 1、酚红培养基：、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。原理：原理：脲酶催化尿素分解成氨脲酶催化尿素分解成氨培养培养基碱性增强基碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性2 2、伊红、伊红美蓝培养基：美蓝培养基：鉴定大肠杆菌鉴定大肠杆菌原理：原理：代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合 菌落呈黑色并带有金属光泽。菌落呈黑色并带有金属光泽。CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O属鉴别培养基，它
33、并没有促进大肠杆属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长菌的生长和抑制其他微生物的生长操作实验组对照组判断培养基判断培养基中是否有杂中是否有杂菌污染菌污染判断选择培判断选择培养基是否具养基是否具有筛选作用有筛选作用选择培养基选择培养基接种接种选择培养基选择培养基不接不接种种选择培养基选择培养基接种接种牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨培养基胨培养基接种接种需将需将未接种的未接种的选择培养基选择培养基同同时进行培养时进行培养需设立牛肉膏蛋需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行白胨培养基进行接种后培养，观接种后培养，观察两种培养基上察两种培养基上菌落数目、进行菌落数目、进行对比得出结对比得出结金版
34、金版P21 实验设计原则实验设计原则(1)设立重复组：设立重复组：统统计计某某一一稀稀释释度度下下平平板板上上的的菌菌落落数数时时，要要至至少少涂涂布布三三个个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组：设立两种对照组：栏栏目目链链接接四四. .结果分析与评价结果分析与评价222.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即包括三种组分，即C C1 1酶酶( (外切酶外切酶) )、C CX X酶酶( (内切酶内切酶) )和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分
35、解成，前两种酶使纤维素分解成纤维纤维二糖二糖，第三种酶将，第三种酶将纤维二糖纤维二糖分解成分解成葡萄糖葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素3.3.纤维素的分解：纤维素的分解： 土壤中某些微生物土壤中某些微生物( (真菌、放线菌及细菌真菌、放线菌及细菌) )能够产生能够产生纤维素酶纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，把纤维素分解为葡萄糖，后再利用后再利用。( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样? 培养
36、的目的培养的目的? ? 选择培养基的选择培养基的特点特点? ?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应红进行颜色反应方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时
37、就加入刚果红漂洗作用漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这这样就留下大大小小的透明圈样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解大的透明圈当然分解纤维素的能就强。纤维素的能就强。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？染色法染色法优点点缺点缺点颜色反应基颜色反应基本上是纤维本上是纤维素分解菌的素分解菌的作用作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发刚果红会使菌落之间发生混杂生混杂操作简便操作简便不存在菌落不存在菌落混杂问题混杂问题 产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，产生模糊透明圈， 有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，
38、形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足思考：这两种方法各有哪些优点与不足方法一：方法一：先先培养微生物，培养微生物，再加入刚果再加入刚果红进行颜色红进行颜色反应反应方法二：方法二：在在倒平板时就倒平板时就加入刚果红加入刚果红比较项目比较项目 分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培
39、养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养,浓缩所需微生物浓缩所需微生物比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合
40、物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法酚红培养基酚红培养基刚果红染色法刚果红染色法可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌透明圈大的，透明圈大的，分解纤维素分解纤维素的的能力就强啦能力就强啦刚果红染色法刚果红染色法
