动物细胞与组织培养技术课件

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1、第三章第三章动物细胞与组织培养技术动物细胞与组织培养技术第一节第一节概述概述一、动物细胞与组织培养的基本概念一、动物细胞与组织培养的基本概念二、动物细胞体外培养的特点二、动物细胞体外培养的特点三、发展历史三、发展历史四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件(掌握）掌握）五、体外培养细胞生物学特性五、体外培养细胞生物学特性(掌握）掌握）第二节第二节动物细胞、组织培养的基本方法动物细胞、组织培养的基本方法(掌握）掌握）第三节第三节培养细胞的检测和特性鉴定培养细胞的检测和特性鉴定(掌握）掌握）第四节第四节动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例 第五节第五节细胞同步化（了解）细胞

2、同步化（了解）第六节第六节组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）动物细胞与组织培养技术课件第一节第一节概述概述一、基本概念一、基本概念1动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养(CellandTissueCulture)：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。l 是动物细胞工程的基础。是动物细胞工程的基础。 动物细胞与组

3、织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件 v分类： 细胞培养 组织培养 器官培养动物细胞与组织培养技术课件2 2、原代培养、原代培养(Primary Culture)(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3 3继代培养（继代培养（ Secondary CultureSecondary Culture ）：亦称传代培：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养. .4 4、细胞系细胞系(cell line)(cell line)：由

4、原代细胞培养后经初步纯由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。5 5、细胞株、细胞株(cell strain)(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。法而得的单一类型的细胞群体。动物细胞与组织培养技术课件有限细胞系有限细胞系(infinitedcellline)：不能连续培养的细胞株。不能连续培养的细胞株。无限细胞系无限细胞系(finitedcellline)：能够连续培养的细胞株，能够连续

5、培养的细胞株，也称无限系。也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。可能已成为恶性细胞。动物细胞与组织培养技术课件细胞株、细胞系的命名：细胞株、细胞系的命名：l 以组织来源定名，如以组织来源定名，如BHK(BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞) )l 以人名定名，如以人名定名，如HeLaHeLa细胞细胞l 以时间地点来定名，如以时间地点来定名，如S7811S7811细胞系细胞系l 以临床疾病类型定名，如以临床疾病类型定名，如BALL-1BALL-1细胞系细胞系( (来来自自B B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性

6、白血病人白细胞) ) )动物细胞与组织培养技术课件用于生产的用于生产的动物细胞株动物细胞株原代细胞原代细胞二倍体细胞二倍体细胞融合细胞融合细胞基因工程细胞基因工程细胞转化细胞转化细胞常用细胞株：常用细胞株：CHO细胞、细胞、Vero细胞、细胞、BHK-21细胞、细胞、WI-38细胞细胞动物细胞与组织培养技术课件二、动物细胞体外培养特点二、动物细胞体外培养特点v动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，培养时间长。，培养时间长。v更易受微生物污染更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体），（包括细菌、真菌、病毒、支原体）， 需要需要防治污染问题防治污染问题。v对培养环境的适应性差，对环境极其敏感

7、。包括对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PHPH值、温值、温度、剪切力度、剪切力v对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。乳糖外，一般还需要血清。 v原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代左右退化死亡。代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件平滑肌细胞平滑肌细胞神经元细胞神经元细胞血红细胞血红细胞形态上表现为形态上表现为多种多样，如多种多样，如圆形、椭圆形、圆形、椭圆形

8、、正方形、柱形、正方形、柱形、扁平形、梭形、扁平形、梭形、星形和多边形星形和多边形等等动物细胞与组织培养技术课件三、动物细胞培养的发展历史三、动物细胞培养的发展历史v1885年，年，Wilhelm Roux （劳斯，德国）最先尝试离体培（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了“组组织培养织培养”一词。一词。 v1907年，美国胚胎学家年，美国胚胎学家Ross Harrison （哈里森）培养蛙（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认

9、为动物组织培养的开山鼻祖。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。 v1912年年,法国学者法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。年，他设计了卡氏培养瓶。动物细胞与组织培养技术课件v1913年，年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。建立了单盖片悬滴培养法。 v1925年，年，Maximow采用双盖片法。采用双盖片法。 v193

10、4年，年，Gey和和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。了多种类型的培养瓶。 v1948年，年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。创建了单个细胞培养方法。 v1951年，年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究v1951年，年，厄尔厄尔（Earle）发明了体外培养动

11、物细胞的人工合成培养发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。基。动物细胞与组织培养技术课件v1952年年Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌颈癌Hela细胞系。细胞系。 v1960年，年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。培养物中发现有自发的融合细胞。 v1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制

12、。动物细胞与组织培养技术课件四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件1、恒定的温度恒定的温度:37v维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；v人体细胞在人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可

13、能恢复；小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；v在在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；v41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；复可能；v当温度在当温度在43以上以上1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低低温下会使细胞代谢速率降低动物细胞与组织培养技术课件2、pH：最适为：最适为7.27.4v大多数细胞的适宜大多数细胞的适宜pH为为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影

14、响产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境在偏酸环境中更利于细胞生长中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如如成纤维细胞最适合成纤维细胞最适合pH是是7.4-7.6，每种细胞都有其最适，每种细胞都有其最适pH值值.v当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，甚至死亡。时的生长会受到影响，甚至死亡。动物细胞与组织培养技术课件3、气体气体v气体：需要气体：需要O2、CO2（95%空气、空气、5%CO2）v气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需

15、气体主要所需气体主要有氧气和二氧化碳有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时开放培养时一般把细胞置于一般把细胞置于95%空气加空气加5%二氧化碳混合气体环境中二氧化碳混合气体环境中.v二氧化碳既是细胞代谢产物二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分也是细胞生长繁殖所需成分,它它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值值.动物细胞与组织培养技术课件4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、营养：要求高，需

16、要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。核酸、激素、生长因子等。动物细胞与组织培养技术课件5、无菌、无菌v培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。细胞生

17、存的基本条件。动物细胞与组织培养技术课件（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 （二）培养细胞的生长特点（二）培养细胞的生长特点（三）（三）培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖过程五、五、动物细胞的体外培养生物学特性动物细胞的体外培养生物学特性动物细胞与组织培养技术课件贴壁依赖型细胞贴壁依赖型细胞 非贴壁依赖型非贴壁依赖型成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 于悬浮状态下于悬浮状态下即可生长即可生长贴附于支持物表面贴附于支持物表面才能生长的细胞才能生长的细胞动物

18、细胞与组织培养技术课件1、贴壁依赖型细胞、贴壁依赖型细胞v含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。基质结合。v 单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。长。动物细胞与组织培养技术课件v在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1 1）成纤维细胞

19、型：）成纤维细胞型：本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞；本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞； 长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出位于中央，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突起，个长短不同的突起，生长时呈放射生长时呈放射状、漩涡状走向状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。，细胞间间隙较大。其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。 动物细胞与组织培养技术课件人

20、的成纤维细胞人的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞人骨髓间充质细人骨髓间充质细胞（胞（MSCMSC）动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件大鼠血管平滑肌细胞大鼠血管平滑肌细胞成纤维细胞型成纤维细胞型动物细胞与组织培养技术课件v成纤维型细胞成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名纤维细胞的形态相似而得名.除真正的成纤维细胞除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态外，凡由中胚层间质起源的组织细

21、胞常呈本类形态生长。生长。v人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。动物细胞与组织培养技术课件（2 2）上皮型细胞上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁扁圆形核，细胞彼此圆形核，细胞彼此紧密相连成单层紧密相连成单层细胞，呈现细胞，呈现“铺路石状铺路石状”。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。单独行动。内胚层和外胚层细胞体外培养时都

22、可能呈现上皮型。如皮内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。细胞等。vHela细胞呈现为典型的上皮细胞型细胞呈现为典型的上皮细胞型。动物细胞与组织培养技术课件单层扁平上皮细胞单层扁平上皮细胞人口腔皮样癌细胞人口腔皮样癌细胞人宫颈癌上皮细胞（人宫颈癌上皮细胞（HelaHela）动物细胞与组织培养技术课件成骨肉瘤细胞成骨肉瘤细胞(多角形多角形)上皮细胞型上皮细胞型动物细胞与组织培养技术课件奶牛肾脏上皮细胞奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型上皮细胞型)动物细胞与组织培养技术课件v体外培养时

23、所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，而且，这种名词系使这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原

24、来的形态要有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同方向可能并不相同。动物细胞与组织培养技术课件 （3 3）游走型细胞：）游走型细胞：不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件

25、下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。似多角型或成纤维细胞形态。如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。动物细胞与组织培养技术课件体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。动物细胞与组织培养技术课件单 核 巨 噬 细 胞1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成、

26、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。、细胞胞质常伸出伪足和突起。3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。方向不规则。4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。动物细胞与组织培养技术课件单核巨噬细胞（未刺激状态）单核巨噬细胞（未刺激状态）游走细胞型游走细胞型动物细胞与组织培养技术课件单核巨噬细胞（活化剂刺激单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足后）：向四周伸展伪足动物细胞与组织培养技术课件需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在需要注意

27、的是：在实际细胞培养中，可能同时存在2 2种及其以上种及其以上细胞形态；其影响因素包括（细胞形态；其影响因素包括（1 1）不同来源细胞细胞形态学表现）不同来源细胞细胞形态学表现不同；（不同；（2 2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成分，培养基，温气环境等分，培养基，温气环境等动物细胞与组织培养技术课件（4 4）多形型细胞：）多形型细胞：形态上不规则的细胞，形态上不规则的细胞，不常不常见，见，一般分胞体和胞突两部分一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。

28、如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。动物细胞与组织培养技术课件神经细胞（神经细胞（DAB显色）显色）多形型细胞多形型细胞神经细胞神经细胞动物细胞与组织培养技术课件大鼠大鼠 海马神经细胞海马神经细胞动物细胞与组织培养技术课件2 非贴附型细胞非贴附型细胞 v 悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。中悬浮生长。 v见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆细胞转化细胞

29、系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。v这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。v优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。分接触无需消化传代，易于收获细胞。v缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。能悬浮生长。v 贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养动物细胞与组织培养技术课件实际

30、情况下，所培养的细胞并不一定呈现某实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。动物细胞与组织培养技术课件n影响细胞形态学特征的因素影响细胞形态学特征的因素血清成分、培养基成分、添加成分、培养血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。基的酸碱度、气相环境、温度等。如如,H

31、ela细胞原本是一种上皮型癌细胞细胞原本是一种上皮型癌细胞,但但在过酸或过碱的条件下培养在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。动物细胞与组织培养技术课件(二）培养细胞的生长特点二）培养细胞的生长特点贴附和伸展贴附和伸展接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制动物细胞与组织培养技术课件1贴附贴附贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。v贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素

32、、殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。v培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。v细胞贴附和伸展过程：细胞贴附和伸展过程：动物细胞与组织培养技术课件贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上悬浮的圆形细胞与底物附着悬浮的圆形细胞与底物附着细胞将伸展成其原来的形态细胞将伸展成其原来的形态。动物细胞与组织培养技术课件贴附过程贴附

33、过程 动物细胞与组织培养技术课件v影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因素（如促附着因子）；素（如促附着因子）；机械、物理因素（如低温或机械、物理因素（如低温或培养液的流动过快培养液的流动过快)；其它一些因素的影响（例如：；其它一些因素的影响（例如：离子的作用离子的作用).v可采取的措施：可采取的措施：包被；包被；减少接种时细胞悬液的减少接种时细胞悬液的量；量；培养液中离子成分及浓度培养液中离子成分及浓度培养液的温度培养液的温度动物细胞与组织培养技术课件2接触抑制（接触抑制（Contactinhibition）细胞从接种到长满底物表面后，由于细

34、胞繁殖数量增多相细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。互接触后，不再增加。v一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。下面经过而重叠生长。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件3、密度依赖性、密度依赖性（Densityinhibition）v3T3细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞

35、生长汇合成一片时（每速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿培养皿约约106个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。v转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的终末细胞密度。的终末细胞密度。动物细胞与组织培养技术课件（四）（四） 体外培养细胞的生长与增殖过程

36、体外培养细胞的生长与增殖过程 1、单个细胞的生长过程：、单个细胞的生长过程：与体内细胞周期相似，经历与体内细胞周期相似，经历G1、S、G2、M期。期。细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为细胞分裂时间为细胞分裂时间为细胞分裂时间为121248h48h， 细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂 周期周期周期周期= =间期间期间期间期+ +分裂期分裂期分裂期分裂期 间期（间期（间期（间期（G1+S+G2G1+S+G2） 分裂期（分裂期（分裂期（分裂期（MM）动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段体外培养细

37、胞寿命的过程可分为三个阶段 原代培养期原代培养期 传代期传代期 衰退期衰退期 2、细胞系的生长过程：细胞系的生长过程： 动物细胞与组织培养技术课件(1)原代培养（初代培养）原代培养（初代培养）v为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段段,一般持续一般持续14周。周。v 特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。具。动物细胞与组

38、织培养技术课件(2)传代期传代期 v当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。u特点特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，在细胞整个生命期中此期的持续时间最长， 一般情况下，可传代一般情况下，可传代1050代。代。 细胞增殖旺盛，并细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。动物细胞与组织培养技术课件v有限细胞系和永久细胞系有

39、限细胞系和永久细胞系v 动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primaryculture）。经继代）。经继代培养后即成为有限细胞系培养后即成为有限细胞系(finitecellline)。v有限细胞系：有限细胞系：细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自行停止生长。即使提供生长所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种行停止生长。即使提供生长所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为有限细胞系。寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为

40、有限细胞系。v 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。v 有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化物细胞培养中称为体外转化(invitrotransformation)。v 永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高永久细胞系有

41、如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。动物细胞与组织培养技术课件荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒动物细胞与组织培养技术课件结果：细胞群体中具有迅结果：细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占速增殖能力的细胞将渐占优势而非增殖的或增殖缓优势而非增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。慢

42、的细胞将被减弱。 动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件(3)衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。死亡。v 细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓谓“危机期危机期”(crisis)，获得不死性而具有，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。动物细胞与组织培养技术课件3、每代细胞的生长过程、每代细胞的生长过程在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分在细胞的生长过程中，繁殖

43、到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中称为接种。开而移至新的培养皿中称为接种。细胞细胞”一代一代”：仅指从细胞接种到分离再培养的一：仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。段时间。动物细胞与组织培养技术课件潜伏期潜伏期每代细胞的生长阶段每代细胞的生长阶段：指数生长期指数生长期 停止期停止期动物细胞与组织培养技术课件v培养细胞传代的生存期：培养细胞传代的生存期：1)潜伏期潜伏期(latentphase)2)指数生长期指数生长期(logarithmicgrowthphase)又称对数又称对数期期-试验用试验用3)平台期又称生长停滞期平台期又称生长停滞期(stagnatephase)。-传传代代动物

44、细胞与组织培养技术课件1）潜伏期）潜伏期动物细胞与组织培养技术课件2）指数生长期指数生长期v细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。持续究。持续35天。天。v细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚渐次铺满培养器皿底物，提

45、供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。动物细胞与组织培养技术课件3 平台期平台期v又称生长停滞期。又称生长停滞期。v此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和密度达到饱和，细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，密度达到饱和，细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，细胞数量持平。细胞数量持平。v特点细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一特点细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动

46、并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件第二节第二节动物细胞、组织培养的方法动物细胞、组织培养的方法 一、体外培养的一般过程一、体外培养的一般过程二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法三、动物细胞大规模培养技术三、动物细胞大规模培养技术 四、动物细

47、胞体外培养举例四、动物细胞体外培养举例 五、动物细胞体外培养现状与展望五、动物细胞体外培养现状与展望动物细胞与组织培养技术课件一、体外培养的一般过程一、体外培养的一般过程v体外细胞培养一般过程：体外细胞培养一般过程： 组织获得组织获得 组织消化组织消化 接种接种培养培养传代及传代及细胞冻存复苏等细胞冻存复苏等动物细胞与组织培养技术课件动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬液细胞悬液胰蛋白酶胰蛋白酶1代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定

48、量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）动物细胞与组织培养技术课件动物细胞培养的基本过程动物细胞培养的基本过程动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件过程过程 组织组织取材取材 组织细胞的分离分离 培养培养 机械法机械法 消化法消化法 动物细胞与组织培养技术课件机机械械法法分分离离胚胚胎胎 动物细胞与组织培养技术课件（二）、（二）、 原代培养与传代培养技术原代培养与传代培养技术 1、原代培养分为两种：、原代培养分为两种：1） 组织块培养法组织块培养法 2）

49、组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细胞等。胞等。v一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。肿瘤组织比正常组织易于培养。动物细胞与组织培养技术课件（一）取材（一）取材 动物细胞与组织培养技术课件基本步骤：无菌取出目的组织基本步骤：无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成用利刀无菌切割成1 12mm2mm小块小块 以以HanksHanks液漂洗干净液漂洗干净, ,低速离心，弃上清低速离心

50、，弃上清 移入培养瓶，加入适当培养基浸润移入培养瓶，加入适当培养基浸润 培养瓶翻转培养瓶翻转1801800 0，置，置15153030分，使其贴壁分，使其贴壁 培养瓶翻回，置于培养瓶翻回，置于3737培养培养（1）组织块培养）组织块培养 动物细胞与组织培养技术课件组织块培养法组织块培养法 a：取材修剪冲洗：取材修剪冲洗b：剪切成：剪切成1mm3左右的小块左右的小块c：移入培养瓶：移入培养瓶d：分布组织小块间距：分布组织小块间距5mme：翻转培养瓶并加培养液：翻转培养瓶并加培养液37静止静止1-2hf：翻正培养瓶进行培养：翻正培养瓶进行培养g：原代细胞生长：原代细胞生长动物细胞与组织培养技术课件

51、 取材分离和组织消化取材分离和组织消化 无菌取出目的组织无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成细块用利刀无菌切割成细块 胰蛋白酶液消化胰蛋白酶液消化 Hanks Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清液漂洗两次，低速离心弃上清 吸管吹打分散细胞吸管吹打分散细胞 移入培养瓶薄层培养移入培养瓶薄层培养(2)组织消化培养组织消化培养 加入加入30-50倍体积倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液浓度胰蛋白酶溶液3737消化消化30-60min30-60min，每，每5-10min5-10min摇动一次摇动一次动物细胞与组织培养技术课件相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白

52、酶、蜗酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用特点选择使用动物细胞与组织培养技术课件原代培养与检查原代培养与检查 v 接种、培养接种、培养 v v 常规检查常规检查（检查细胞形态及活力、检查营养液（检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染）及污染）动物细胞与组织培养技术课件2、传代培养技术、传代培养技术传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。需要对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。第一次传代时间第一次传代时间：有有80-90%或刚刚全部汇合的细

53、胞或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。不佳。 动物细胞与组织培养技术课件基本步骤：基本步骤： 吸出培养瓶内旧培养液吸出培养瓶内旧培养液 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混和液混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）以能覆盖整个瓶底为准） 吸出消化液，加入培养液终止消化吸出消化液，加入培养液终止消化 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 重新接种重新接种于新的培养瓶内于新的培养瓶内1）贴壁生长细胞传代）贴壁生长细胞传代 培养培养动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件2）

54、悬浮生长细胞传代）悬浮生长细胞传代离心法传代离心法传代 直接传代法直接传代法 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分-800g）去）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除将上清培养液去除l2一一23，然后用，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。动物细胞与组织培养技术课件（三）细胞纯化（三）细胞纯化动物细胞与组织培养技术课件（四）细胞的冻存复苏（四）细胞的冻存复苏v细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常

55、规工作。1、冻存意义：、冻存意义：1）长期保存细胞；）长期保存细胞；2）防止细胞老化；）防止细胞老化；3）减少人力、经费，减少污染。）减少人力、经费，减少污染。动物细胞与组织培养技术课件2、冻存和复苏的原则：慢冻快融、冻存和复苏的原则：慢冻快融v当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。v在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。的形成是减少细胞损伤

56、的关键。v如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。v复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。晶。动物细胞与组织培养技术课件3、保存细胞三要素：营养、保护剂和低温、保存细胞三要素：营养、保护剂和低温低温保护剂的应用低温保护剂的应用v在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。v常用的低温保护剂是常用的

57、低温保护剂是甘油或甘油或DMSO，渗透性保护剂，可迅速，渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。v保护剂的浓度在保护剂的浓度在515%之间，常用之间，常用10%。动物细胞与组织培养技术课件4、慢冻程序v标准程序：标准程序：v当温度在当温度在-25以上时，以上时，12/minv当温度达当温度达-25以下时，以下时，510/min

58、v当温度达当温度达-100时，可迅速放入液氮中时，可迅速放入液氮中v简易程序：简易程序：v将将冷冷冻冻管管（管管口口要要朝朝上上）放放入入纱纱布布袋袋内内，纱纱布布袋袋系系以以线线绳绳，通通过过线线绳绳将将纱纱布布袋袋固固定定于于液液氮氮罐罐罐罐口口，按按每每分分钟钟温温度度下下降降12的的速速度，在度，在40分钟内降至液氮表面，停分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。分钟后，直接投人液氮中。动物细胞与组织培养技术课件细胞冻存方法1预先配制冻存液：预先配制冻存液：含含20%血清培养基血清培养基9份份DMSO1份份2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液取对数生长期细胞，经胰

59、酶消化后，加入适量冻存液,用吸用吸管吹打制成细胞悬液（管吹打制成细胞悬液（11065106细胞细胞/ml)3分装：每瓶分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。称和冷冻日期。4 4、冻存、冻存1)传统方法：冷存管置于传统方法：冷存管置于410分钟分钟-2030分钟分钟-801618小时小时(或隔夜或隔夜)液氮槽长期储存。液氮槽长期储存。-20不可超过不可超过1小时，小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。冰箱中，惟存活率稍微降低一些。(2)程序降温：

60、利用已设定程序的等速降温机以程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟分钟之速度由室温降至之速度由室温降至(-80以下以下)-120，再放在液氮长期储存。，再放在液氮长期储存。适用于悬浮型细胞与适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。之保存。动物细胞与组织培养技术课件v冻存要点：冻存要点：1）慢冻）慢冻2）取对数生长期细胞进行冻存，无微生物污染；）取对数生长期细胞进行冻存，无微生物污染；3）细胞浓度：达到）细胞浓度：达到106/毫升毫升4）合适的冷冻保护剂：）合适的冷冻保护剂：DMSO,常用常用10%。5）使用高浓度血清）使用高浓度血清动物细胞与组织培养技术课件5、细胞复苏方法、

61、细胞复苏方法n与与快快速速融融化化的的手手段段，以以保保证证细细胞胞外外结结晶晶在在很很短短的的时时间间内内融融化化，避避免免由由于于缓缓慢慢融融化化使使水水分分渗渗入入细细胞胞内内形形成胞内再结晶对细胞造成损害成胞内再结晶对细胞造成损害。n程序：程序：（l）从从液液氮氮中中取取出出冷冷冻冻管管，迅迅速速投投入入3738水水浴浴中，使其融化（中，使其融化（1分钟左右）。分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。倍以上。（3）低速离心）低速离心10分钟。分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。动物细胞

62、与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法 v 悬滴培养法悬滴培养法 v 旋转管培养法旋转管培养法 v 灌注小室培养法灌注小室培养法 v 培养瓶培养方法培养瓶培养方法 v 培养板培养法培养板培养法v 克隆培养法克隆培养法动物细胞与组织培养技术课件1、悬滴培养法、悬滴培养法 v 悬滴培养法：又称植块悬滴培养法，悬滴培养法：又称植块悬滴培养法，1907年，哈年，哈里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂

63、于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。v优点：优点：1）容易换片。）容易换片。 2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。利于组织分化。动物细胞与组织培养技术课件2 2、旋转管培养法旋转管培养法 v 盖尔（盖尔（GeyGey，19331933年）、刘易斯（年）、刘易斯（LewisLewis，19341934年）年）建立该方法。建立该方法。 v特点：是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空特点：是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。

64、包括旋转管、旋转鼓、支架等。气直接接触。包括旋转管、旋转鼓、支架等。 v缺点：不易在显微镜下观察。缺点：不易在显微镜下观察。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件3、灌注小室培养法、灌注小室培养法 v 在盖玻片悬滴法在盖玻片悬滴法基础上发展而来，基础上发展而来，可用于连续观察细可用于连续观察细胞动态变化，研究胞动态变化，研究各种因素影响作用各种因素影响作用及活细胞反应。及活细胞反应。1912年由年由Burrows首创。首创。动物细胞与组织培养技术课件4、 培养瓶培养方法培养瓶培养方法 v 培养瓶培养方法：指将培养对象直接接种于培养培养瓶培养方法：指将培养对象直接接种于培养瓶内培养

65、。瓶内培养。 v 1923年，卡雷尔（年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶。）设计了卡氏瓶。Earle设计了设计了T-培养瓶。采用的材料对细胞无毒，透明。培养瓶。采用的材料对细胞无毒，透明。动物细胞与组织培养技术课件悬浮细胞培养瓶滚动培养瓶滚动培养瓶动物细胞与组织培养技术课件n盖玻片盖玻片+培养瓶培养法：先以盖玻片为生长表面，将培养瓶培养法：先以盖玻片为生长表面，将拟培养细胞或组织接种于盖玻片上，然后放进培养拟培养细胞或组织接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。瓶中进行培养。v优点：优点：1）可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响）可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响2）可以方

66、便显微观察、染色等操作，以及永久保存；）可以方便显微观察、染色等操作，以及永久保存；3）增加了培养瓶培养面积。）增加了培养瓶培养面积。动物细胞与组织培养技术课件5、 培养板培养法培养板培养法 v 培养板培养法又称微量培养法。培养板培养法又称微量培养法。 v一般是一次性使用一般是一次性使用动物细胞与组织培养技术课件6、克隆培养法、克隆培养法就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术术 动物细胞与组织培养技术课件过程过程:制细胞悬液制细胞悬液连续稀释获得单细胞连续稀释获得单细胞单细胞

67、接种单细胞接种培养培养细胞株细胞株 :由细胞系进一步克隆化，而获得由细胞系进一步克隆化，而获得的由单一细胞形成的细胞群体。的由单一细胞形成的细胞群体。 动物细胞与组织培养技术课件三三动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养法基础上，再融合固定化细胞、流式细胞浮培养法基础上，再融合固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器、人工灌流技术等发展术、填充床、生物反应器、人工灌流技术等发展起来的。起来的。（一）培养方法（一）培养方法u 转瓶培养转瓶培养u 反应器贴壁培养反应器贴壁培养u悬浮培养技术悬浮培养技

68、术 u微载体培养技术微载体培养技术 u多孔载体培养多孔载体培养 u微囊化培养技术微囊化培养技术 u中空纤维法中空纤维法固定化培养固定化培养动物细胞与组织培养技术课件1、反应器贴壁培养、反应器贴壁培养v此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的

69、一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。 动物细胞与组织培养技术课件2 2、悬浮培养技术、悬浮培养技术适于少数悬浮生长型细胞适于少数悬浮生长型细胞动物细胞与组织培养技术课件3、微载体培养技术、微载体培养技术v19671967年，年，Van WezelVan Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞，开发了微载体系统培养贴壁细胞，以直径以直径60-250um60-250um微珠作为微载体。微珠作为微载体。v原理：其原理是将对细胞无害的颗粒原理：其原理是将对细胞无害的颗粒- -微载体加入到微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体

70、，使细胞在微载体培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。持悬浮状态。 v理想的细胞支持物特征理想的细胞支持物特征：生物相容性；无毒害；好：生物相容性；无毒害；好的传质特征；机械稳定性好；比表面大，适于细胞的传质特征；机械稳定性好；比表面大，适于细胞生长；颗粒均一；能高压灭菌；可重复利用，易清生长；颗粒均一；能高压灭菌；可重复利用，易清洗；接种方便；能固定大部分细胞，能保护细胞，洗；接种方便；能固定大部分细胞，能保护细胞，易使细胞、载体和培养基分离；适合贴壁细胞和悬易使细胞、载体和培养基分离；

71、适合贴壁细胞和悬浮细胞培养。浮细胞培养。动物细胞与组织培养技术课件微载体系统培养细胞具体步骤微载体系统培养细胞具体步骤p110选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒接种接种培养观察和细胞计数培养观察和细胞计数消化消化分离细胞分离细胞传代培养传代培养交联葡萄糖交联葡萄糖DEAE-DEAE-纤维素纤维素蛋白质：变性胶原蛋白质：变性胶原高分子材料：硅胶、聚丙烯酰胺、高分子材料：硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯聚苯乙烯无机玻璃基质无机玻璃基质常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 动物细胞与组织培养技术课件n多孔载体培养多孔载体培

72、养优点：易固定化、比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可优点：易固定化、比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可以提高通气量，强化传质。适用于贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连以提高通气量，强化传质。适用于贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连续灌流培养和大规模高密度培养系统。续灌流培养和大规模高密度培养系统。多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性动物细胞与组织培养技术课件4、微囊化培养技术、微囊化培养技术 v人造的半透膜制成的多孔微球体，借鉴固定化技术人造的半透膜制成的多孔微球体，借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊内。适用于单克隆抗体、

73、干扰素将细胞包裹在微囊内。适用于单克隆抗体、干扰素等的制备。等的制备。v微囊直径控制在微囊直径控制在200-400m为宜。为宜。v制备中应注意：制备中应注意：v温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；v所用试剂和膜材料对细胞无毒害；所用试剂和膜材料对细胞无毒害；v膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；v膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。动物细胞与组织培养技术课件5、中空纤维法、中空纤维法vRichard Kncazek 1972年发明。最初使用

74、醋酸纤维年发明。最初使用醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成海绵状多孔结构。素和硝酸纤维素混合组成海绵状多孔结构。v可以模拟细胞体内三维状态。可以模拟细胞体内三维状态。v目前材料有：硅胶、聚丙烯等。目前材料有：硅胶、聚丙烯等。v优点是：优点是： 占地空间少；占地空间少； 细胞产量高，细胞密度可达细胞产量高，细胞密度可达109109数量级；数量级； 生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞分泌的细胞 动物细胞与组织培养技术课件动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物动物细胞与组织培养技术课件（二）动物细胞生物反应器培养（二）动物细胞生物反应器培养（

75、） 1 1、生物反应器的特点分析、生物反应器的特点分析 反应器主要结构形式：反应器主要结构形式： 搅拌式搅拌式 气升式气升式 固定床式固定床式技术要求：能提供均匀温和的混合状态，剪切力小，技术要求：能提供均匀温和的混合状态，剪切力小，传质效果好；反应器空间利用率高，选用合适载体传质效果好；反应器空间利用率高，选用合适载体系统和材料；能保证严格无菌；能控温、酸碱、溶系统和材料；能保证严格无菌；能控温、酸碱、溶氧和氧和CO2CO2浓度等；能方便快捷实现培养液连续添加，浓度等；能方便快捷实现培养液连续添加，样品采集和观察。样品采集和观察。动物细胞与组织培养技术课件2、生物反应器应用概况、生物反应器应

76、用概况 * 动物细胞培养常用的生物反应器：动物细胞培养常用的生物反应器： v柱状中空纤维反应器柱状中空纤维反应器 v板框式中空纤维反应器板框式中空纤维反应器 v中心灌流式反应器中心灌流式反应器 v灌流微载体生物反应器灌流微载体生物反应器 v旋转壁式反应器旋转壁式反应器动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件（三）动物细胞大规模培养操作方式（三）动物细胞大规模培养操作方式 1.分批式操作分批式操作 2.流加式操作流加式操作 3.半连续式操作半连续式操作 4.连续式操作连续式操作 5.灌流式操作灌流式操作 优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。优

77、点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低.优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下生长。生长。缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对设备等要求高。设备等要求高。优点：培

78、养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等优点：培养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等.动物细胞与组织培养技术课件（四）、动物细胞生物反应器大规模培养（四）、动物细胞生物反应器大规模培养 产品产品1、应用、应用 v 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰质炎和狂犬疫苗等病毒疫苗：乙肝、脊椎灰质炎和狂犬疫苗等v非抗体免疫调节剂：干扰素、白细胞介质、非抗体免疫调节剂：干扰素、白细胞介质、B细胞生长因子、细胞生长因子、巨噬细胞激活因子、巨噬细胞激活因子、T细胞替代因子等细胞替代因子等v多态生长因子：神经、成纤维、表皮、血清生长因子等多态生长因子：神经、成纤维、表皮、血清生长因子等v酶类：组织血纤维酶原激活

79、剂酶类：组织血纤维酶原激活剂v激素：红细胞、促黄体生成素、促滤胞素激素：红细胞、促黄体生成素、促滤胞素v肿瘤特异性抗原：癌胚抗原肿瘤特异性抗原：癌胚抗原v单克隆抗体单克隆抗体v病毒杀虫剂：杆状病毒病毒杀虫剂：杆状病毒动物细胞与组织培养技术课件2、关键技术、关键技术 u细胞培养环境细胞培养环境 ：氨离子、乳酸、二氧化碳、甲基乙：氨离子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、渗透压、载体二醛、渗透压、载体v细胞死亡与凋亡细胞死亡与凋亡 ：基因工程的调控：基因工程的调控v培养基与细胞系：无血清培养基的研发，基因工程培养基与细胞系：无血清培养基的研发，基因工程的应用的应用 v过程监控：在线氧吸收速率、葡萄糖分析

80、，亲和层过程监控：在线氧吸收速率、葡萄糖分析，亲和层析与在线取样系统偶联等析与在线取样系统偶联等动物细胞与组织培养技术课件第三节第三节培养细胞的检测和特性鉴定培养细胞的检测和特性鉴定一、培养细胞的常规检查一、培养细胞的常规检查细胞接种或传代以后，在生存期间，实验者每天或至细胞接种或传代以后，在生存期间，实验者每天或至多间隔多间隔1-2天，要对细胞做常规性检查天，要对细胞做常规性检查.观察的结果是：污染与否，细胞生长和观察的结果是：污染与否，细胞生长和pH等情况，等情况，随时掌握细胞动态变化，以便做换液或传代处理，随时掌握细胞动态变化，以便做换液或传代处理，如发现异常情况应及时采取措施。如发现异

81、常情况应及时采取措施。动物细胞与组织培养技术课件1、细胞形态、细胞形态生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微结构。细廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微结构。细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成类纤维细胞等。只有状态良失去原有特点，如上皮细胞变成类纤维细胞等。只有状态良好的细胞才

82、宜利用进行实验。在很多情况下，细胞虽机能状好的细胞才宜利用进行实验。在很多情况下，细胞虽机能状态不良，但仍可生长，如支原体轻度污染时即如此。因此生态不良，但仍可生长，如支原体轻度污染时即如此。因此生长与否尚不能作为判定细胞好坏的唯一标准，必须做全面分长与否尚不能作为判定细胞好坏的唯一标准，必须做全面分析。析。动物细胞与组织培养技术课件2、细胞生长情况、细胞生长情况v很多情况下，开始从组织最先很多情况下，开始从组织最先“长长”出的为游走细胞，它们出的为游走细胞，它们单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微电泳法可揭示出它单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微电泳法可揭示出它们极活跃的变形、游走和吞噬活

83、动。在游走细胞之后，接着们极活跃的变形、游走和吞噬活动。在游走细胞之后，接着出现的是成纤维细胞或上皮细胞。说细胞出现的是成纤维细胞或上皮细胞。说细胞“生长生长”不如说移不如说移动更为恰当，因这时尚很少见细胞分裂，仅有细胞运动而已。动更为恰当，因这时尚很少见细胞分裂，仅有细胞运动而已。只有当细胞分裂出现后，细胞数量逐渐增多，形成较大的生只有当细胞分裂出现后，细胞数量逐渐增多，形成较大的生长晕或连接成片时，才真正进入了生长状态。长晕或连接成片时，才真正进入了生长状态。动物细胞与组织培养技术课件3、培养液、培养液在正常情况下，培养液呈桃红色。用一般温箱培养时，随细胞在正常情况下，培养液呈桃红色。用一

84、般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，生长时间的延长，CO2积累增多，在超越缓冲范围后，营养积累增多，在超越缓冲范围后，营养液酸化变黄，如不及时调节液酸化变黄，如不及时调节PH，对细胞会发生不利影响，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。培养液中加严重时细胞脱落死亡。培养液中加Hepes或用或用CO2温箱温箱培养可使培养可使PH维持稳定。用磷酸盐缓冲系统时，可因瓶口漏维持稳定。用磷酸盐缓冲系统时，可因瓶口漏气，气，CO2溢出，也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷不洁残留碱性溢出，也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷不洁残留碱性物，使之变碱发红。更换营养液时间，可依营养物的消耗而物，使之变碱发红。更换营养液时间，

85、可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时天换一次，生长缓慢时，定，细胞生长旺盛时天换一次，生长缓慢时，天亦可。天亦可。动物细胞与组织培养技术课件4、微生物污染、微生物污染在长时间多量培养工作中，即使用品消毒操作严密，在长时间多量培养工作中，即使用品消毒操作严密，亦难避免偶尔发生污染。亦难避免偶尔发生污染。动物细胞与组织培养技术课件污染的途径污染的途径u污染途径污染途径-空气、器材、操作、血清、组织样品空气、器材、操作、血清、组织样品u污染对培养细胞的影响及检测污染对培养细胞的影响及检测体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗生素的抗污染能

86、力也是有限的，因而基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。动物细胞与组织培养技术课件1）细菌的污染及检测）细菌的污染及检测多数培养细胞在遭到细菌的污染后，培养液短期多数培养细胞在遭到细菌的污染后，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。现象，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。培养检测，可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培培养检测，可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培养基上，过夜查看。养基上，过夜查看。防止，通常在严格的实验操作之外，培养

87、基中加防止，通常在严格的实验操作之外，培养基中加入青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。入青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。动物细胞与组织培养技术课件2）真菌的污染检测）真菌的污染检测真菌的污染物通常是培养基表面漂浮的白色及黄色、真菌的污染物通常是培养基表面漂浮的白色及黄色、黑色的小点。在显微镜下可见丝状细胞的交叉。黑色的小点。在显微镜下可见丝状细胞的交叉。防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要时加入抗防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要时加入抗真菌剂。真菌剂。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件3）支原体的污染和防止）支原体的污染和防止支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立

88、生活的微生支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的微生物，无细胞壁，直径最小可以达到物，无细胞壁，直径最小可以达到0.2m，在，在0.22m的滤膜过滤仍然有的滤膜过滤仍然有1%左右的支原体可以通过。支原体左右的支原体可以通过。支原体污染后的培养细胞中没有明显可见的特征，所以很难发污染后的培养细胞中没有明显可见的特征，所以很难发现。现。动物细胞与组织培养技术课件u相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；

89、粒位于细胞表面和细胞之间；u荧光染色法：用能与荧光染色法：用能与DNA特异性结合的荧光染料特异性结合的荧光染料Hoechst33258，可使支原体内含有的，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不含酚红的在细胞未长满前取出玻片，用不含酚红的Hanks液漂洗一下，液漂洗一下，用用1：3醋酸甲醇固定醋酸甲醇固定10min，然后用生理盐水漂洗，置于用，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配置浓度为生理盐水配置浓度为50 g/ml的的Hoechst33258

90、中染色中染色10min。染色后用蒸馏水洗。染色后用蒸馏水洗1-2min，向细胞面滴加，向细胞面滴加pH5.5磷磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。动物细胞与组织培养技术课件u电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。v镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密度镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密度颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和颗粒群

91、或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、物质，部分种类需要精氨酸、 2或葡萄糖，每一种支原体都或葡萄糖，每一种支原体都有自身特点。有自身特点。uDNA分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较复杂。较复杂。 动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件4）病毒的污染及检测）病毒的污染及检测v滤器

92、对病毒没有任何阻挡作用，通常不容易滤器对病毒没有任何阻挡作用，通常不容易被污染，因为病毒不能在细胞外复制，而且被污染，因为病毒不能在细胞外复制，而且它们通常具有宿主细胞的感染限制。通常其它们通常具有宿主细胞的感染限制。通常其检测方式是抗体检测及检测方式是抗体检测及PCR检测。检测。v细胞交叉污染及检测细胞交叉污染及检测v不容易发生，常见的细胞形态观察可以区分。不容易发生，常见的细胞形态观察可以区分。动物细胞与组织培养技术课件污染的预防污染的预防v培养前培养前培养操作时培养操作时其他注意事项其他注意事项必要的细胞备份必要的细胞备份对新引进或构建的细胞株应加强观察，并做必对新引进或构建的细胞株应加

93、强观察，并做必要的支原体和病毒的检查。要的支原体和病毒的检查。定期消毒培养箱。定期消毒培养箱。动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件二、培养细胞的生物学鉴定二、培养细胞的生物学鉴定1 1、细胞形态观察、细胞形态观察内容：细胞形态、核质比例、染色质、核仁大小及多少、微丝内容：细胞形态、核质比例、染色质、核仁大小及多少、微丝微管排列状态等微管排列状态等方法：倒置相差显微镜、电镜方法：倒置相差显微镜、电镜动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件2、细胞生长情况、细胞生长情况u细胞生长曲线测定细胞生长曲线测定1）、细胞计数法）、细胞计数法v血细胞计数

94、器：人工计数细胞血细胞计数器：人工计数细胞vCounter计数仪计数仪动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件v用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液以便滴加细胞悬液.v取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。v从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。间的空隙中。v注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。v镜下观察计数：镜下观察计数：计算计数板四角大格内的

95、细胞数，计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算压线者只计算左侧和上方的左侧和上方的,右侧和下方的不计算右侧和下方的不计算在内。在内。动物细胞与组织培养技术课件步骤u取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。如是非贴壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养计数。如是非贴壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。基然后制成细胞悬液计数。v根据细胞计数结果按每个小方瓶根据细胞计数结果按每个小方瓶5104mL作传代培养接种细胞，共接作传代培养接种细胞，共接种种21瓶细胞。瓶

96、细胞。v24h后开始计数细胞，以后每隔后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取计数一次，每次取3瓶细胞，分别进瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数行计数。计算平均值。连续计数7d。v根据细胞计数结果，以单位细胞数根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数细胞数mL)为纵坐标，以时间为横为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。坐标绘制生长曲线。动物细胞与组织培养技术课件2）、）、四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法v四唑盐四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝商品名为噻唑蓝，v四四唑唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑唑盐还原成不溶干水的盐还原成不溶

97、干水的蓝紫色产物（蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的含的formazan量成正比。再用酶标仪测定量成正比。再用酶标仪测定OD值值vMTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试v验、肿瘤放射敏感性实验等。验、肿瘤放射敏感性实验等。动物细胞与组织培养技术课件v操作步骤操作步骤（1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于96孔培养孔培养

98、板；板；103-104细胞细胞/孔，每孔培养孔，每孔培养基总量基总量200微升（微升（96孔培养板每孔孔培养板每孔容积容积370微升），微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）验目的决定培养时间）（2）加入）加入2毫克毫升的毫克毫升的MTT液液（50微升孔）；继续培养微升孔）；继续培养3小时。小时。（3）吸出孔内培养液后，加入）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（液（150微升孔），将培微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪在）酶标仪在490nm处检测各孔

99、处检测各孔OD值记录结果，绘制细胞生长曲值记录结果，绘制细胞生长曲线线动物细胞与组织培养技术课件CCK-8试剂盒试剂盒 v原理：vCell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是检一种基于水溶性四唑盐的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为MTT法的替代方法，试剂盒中采用水溶性四唑盐在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。v用于测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性。动物细胞与组织培养技术课件2、细胞分裂指数v体外培养细胞生长、分裂繁殖的能

100、力，可用体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。进入了指数生长期。v分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。是不同实验研究选择细胞的重要依据。动物细胞与组织培养技术课件步骤步骤v消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。vCO2培养箱中

101、培养培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。小时，使细胞长在盖片上。v取出盖片，按下列顺序操作：取出盖片，按下列顺序操作：1）PBS漂洗漂洗3分钟分钟甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定固定液中固定30分钟分钟Giemsa液染色液染色10分钟分钟自来水冲洗。自来水冲洗。2）盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。）盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。3）计算计算:分裂指数分裂指数=分裂细胞数分裂细胞数/总细胞数总细胞数100%动物细胞与组织培养技术课件细胞周期（1）放射性核素标记自显影）放射性核素标记自显影用用3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷标记脱氧胸腺嘧啶核苷处理处理30min后，每间隔后，每间隔30m

102、in取材，取材，直到直到48h为止，观察和计算细胞分裂相出现时间、高峰和消为止，观察和计算细胞分裂相出现时间、高峰和消失分裂相数，绘图分析。失分裂相数，绘图分析。（2）流式细胞仪测定法）流式细胞仪测定法动物细胞与组织培养技术课件4、培养细胞活力测定、培养细胞活力测定v细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。v任任何何培培养养瓶瓶内内生生长长的的细细胞胞都都由由死死细细胞胞和和活活细细胞胞组组成成，从从形形态态上上区区别别死死、活活细胞是困难的。细胞是困难的。1 1 、细胞克隆形成率实验、细胞克隆形成率实验克隆形成试验是测定单个细胞

103、增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外增殖个细胞在体外增殖6 6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 v 克克隆隆形形成成率率克克隆隆形形成成数数接接种种细细胞胞数数，通通过过计计数数克克隆隆形形成成率率，可可对对单单个个细细胞胞的的增增殖殖潜潜力力作作定定量量分分析析，了了解解细细胞胞的的增增殖殖率率和和对对生生存存环环境境的的适适应应性性。克克隆隆形形成成率率高高者者其其独独立立生生存存能

104、能力力强强。这这种种方方法法常常用用于于抗抗癌癌药药物物敏敏感感性性试试验验、肿肿瘤瘤放放射射生生物物学学试试验验等等。常常用用的的方方法法有有平平板板克克隆隆形形成成试试验验和和软软琼琼脂脂克克隆隆形形成试验。成试验。v缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐v优点：精确、可靠优点：精确、可靠动物细胞与组织培养技术课件2、台盼蓝法台盼蓝法v活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占v细胞中的百分比表示细胞活力细胞中的百分比表示细胞活力 v台盼蓝排斥试验：台盼蓝排斥试验：（1）台盼蓝浓度：）台盼蓝浓度：母液：母液：4%，用双蒸水配制；工作液：，用双蒸水配制；工作液

105、：0.4%，用，用PBS稀释。稀释。（2）稀释倍数：）稀释倍数：台盼蓝工作液：细胞悬液台盼蓝工作液：细胞悬液=1：9（3）结果判断：）结果判断：镜下观察见死细胞被染成淡兰色，活细胞不着色。镜下观察见死细胞被染成淡兰色，活细胞不着色。（4）细胞活力的计算）细胞活力的计算活细胞率活细胞率=活细胞总数活细胞总数/（活细胞总数（活细胞总数+死细胞总数）死细胞总数） 100%动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件（三）培养细胞种属鉴定方法（三）培养细胞种属鉴定方法1 1、荧光抗体染色鉴别细胞的种属、荧光抗体染色鉴别细胞的种属v 间接荧光抗体染色技术间接荧光抗体染色技术采用兔产生的特异性采用

106、兔产生的特异性抗血清标记待测细胞和阳性细胞、阴性细胞。加标抗血清标记待测细胞和阳性细胞、阴性细胞。加标记有荧光染料（记有荧光染料（FITCFITC）的山羊抗兔免疫球蛋白抗体。）的山羊抗兔免疫球蛋白抗体。后加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细后加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细胞上，借助荧光即可看到抗原抗体复合物。胞上，借助荧光即可看到抗原抗体复合物。动物细胞与组织培养技术课件2 2、同工酶谱系鉴别细胞种属、同工酶谱系鉴别细胞种属v通过确定三种同工酶系统（通过确定三种同工酶系统（6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDG6PD），乳酸脱氢酶），乳酸脱氢酶（LDHLDH）

107、和核苷磷酸化酶（）和核苷磷酸化酶（NPNP）的垂直淀粉胶电泳的迁移率，可以鉴定细）的垂直淀粉胶电泳的迁移率，可以鉴定细胞系的种属来源。该法有高度的可靠性，简单、重复性好。利用同工酶胞系的种属来源。该法有高度的可靠性，简单、重复性好。利用同工酶分析检验细胞的交叉污染分析检验细胞的交叉污染vG6PDG6PD、LDHLDH、NPNP的电泳迁移率差异不仅可用来鉴别细胞系所属种属，还可的电泳迁移率差异不仅可用来鉴别细胞系所属种属，还可查出种内细胞的交叉污染。根据同种异体同工酶的表型和正常人群体的查出种内细胞的交叉污染。根据同种异体同工酶的表型和正常人群体的表型频率资料，可以估计出一特定细胞系遗传特征出现

108、的频率。表型频率资料，可以估计出一特定细胞系遗传特征出现的频率。动物细胞与组织培养技术课件3、染色体分析、染色体分析v 多数情况下，即使普通显微镜观察技术，多数情况下，即使普通显微镜观察技术，液足以鉴定不同种的染色体结构的差异。液足以鉴定不同种的染色体结构的差异。v 染色体核型分析足以鉴定不同种间细胞系染色体核型分析足以鉴定不同种间细胞系之间的污染。亲缘关系近的灵长类细胞系之之间的污染。亲缘关系近的灵长类细胞系之间和人癌细胞系之间的比较可用间和人癌细胞系之间的比较可用Giemsa显带显带分析。分析。动物细胞与组织培养技术课件4、人主要组织相容性抗原、人主要组织相容性抗原v 人主要组织相容性抗原

109、（人主要组织相容性抗原（HLA抗原）存在大多抗原）存在大多数有核细胞膜上，常用抗原检测是用补体依赖细胞数有核细胞膜上，常用抗原检测是用补体依赖细胞毒试验，用拒染来鉴定细胞活性。毒试验，用拒染来鉴定细胞活性。原理：原理：HLA抗体与淋巴细胞表面的相应抗原结合后激活补体，抗体与淋巴细胞表面的相应抗原结合后激活补体，导致细胞膜损伤，通透性增强，染料进入细胞，细胞死亡。导致细胞膜损伤，通透性增强，染料进入细胞，细胞死亡。在倒置相差显微镜下观察，着色的细胞为死亡细胞，视野下在倒置相差显微镜下观察，着色的细胞为死亡细胞，视野下有较多细胞死亡为阳性。有较多细胞死亡为阳性。动物细胞与组织培养技术课件5、核酸技

110、术、核酸技术用重组用重组DNA技术和技术和DNA探针技术鉴定和定量探针技术鉴定和定量培养细胞中等位基因的多态性。培养细胞中等位基因的多态性。动物细胞与组织培养技术课件n肿瘤细胞的体外培养与建系过程肿瘤细胞的体外培养与建系过程 n上皮细胞培养上皮细胞培养 n表皮组织培养表皮组织培养n肌肉组织培养肌肉组织培养n神经元细胞培养神经元细胞培养第四节第四节动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例动物细胞与组织培养技术课件肿瘤细胞的体外培养的历史肿瘤细胞的体外培养的历史v1906年，年，Beebe和和Ewing最早成功培养狗的淋巴肉瘤最早成功培养狗的淋巴肉瘤细胞；细胞；v1911年，年，Carrel最先在

111、体外培养了纤维软骨瘤及黑最先在体外培养了纤维软骨瘤及黑色素瘤细胞。色素瘤细胞。v1952年，年，Gey首先成功地建立了世界上第一个细胞首先成功地建立了世界上第一个细胞系系来源于子宫颈癌细胞的细胞系，并且是恶性来源于子宫颈癌细胞的细胞系，并且是恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。性细胞。v后来，口腔癌、喉癌、肺癌等细胞系相继建立。迄后来，口腔癌、喉癌、肺癌等细胞系相继建立。迄今为止，全球范围内建立的细胞系目前已经超过三今为止，全球范围内建立的细胞系目前已经超过三位数。位数。动物细胞与组织培养技术课件发展成就发展成就v在培养的肿瘤细胞

112、类型上，经历了从间充质源性的细胞转上在培养的肿瘤细胞类型上，经历了从间充质源性的细胞转上皮源性细胞、再由神经外胚层源性到造血源性的发展历程。皮源性细胞、再由神经外胚层源性到造血源性的发展历程。v在培养方法上，经历了从原代培养到传代培养、再到细胞系在培养方法上，经历了从原代培养到传代培养、再到细胞系的建立的发展过程。的建立的发展过程。v培养成分上，由采用纯血清培养到含血清培养基、再到无血培养成分上，由采用纯血清培养到含血清培养基、再到无血清培养基三个阶段。清培养基三个阶段。v在对体外培养的肿瘤细胞生物学特性研究水平上，经历了从在对体外培养的肿瘤细胞生物学特性研究水平上，经历了从细胞水平到亚细胞水

113、平，再到酶和分子水平的发展时期。细胞水平到亚细胞水平，再到酶和分子水平的发展时期。v国内已建立的肿瘤细胞系主要有：来自白血病患者的淋巴样国内已建立的肿瘤细胞系主要有：来自白血病患者的淋巴样的的J6-1J6-1、悬浮生长型的胃癌、悬浮生长型的胃癌SL-795SL-795、上皮型的肝癌、上皮型的肝癌SMMC-SMMC-77217721、鼻咽癌、鼻咽癌CNE-2CNE-2、成骨肉癌、成骨肉癌OC-8611OC-8611、结肠癌、结肠癌THC-8910,THC-8910,以及多形型的胸膜间皮癌以及多形型的胸膜间皮癌SMC-1SMC-1等等。等等。动物细胞与组织培养技术课件上皮组织的体外培养上皮组织的体

114、外培养 v体外培养细胞生长的形态特性体外培养细胞生长的形态特性 细胞排列紧密，细胞形态较为一致，细胞间质少细胞排列紧密，细胞形态较为一致，细胞间质少 上皮组织的体外培养特性：依赖性、接触抑制性、细上皮组织的体外培养特性：依赖性、接触抑制性、细胞连接、贴壁生长胞连接、贴壁生长动物细胞与组织培养技术课件表皮组织的体外培养表皮组织的体外培养 v* 表皮细胞分两类：表皮细胞分两类： v 角质形成细胞、非角质形成细胞角质形成细胞、非角质形成细胞 v* 角质形成细胞体外培养技术：角质形成细胞体外培养技术： v 1975年，莱因沃德（年，莱因沃德（Rheinwald）和格林）和格林（Green）创立饲养层培

115、养法）创立饲养层培养法动物细胞与组织培养技术课件v上皮细胞培养液：近年来，国外一些公司研制了多种成品上皮细胞培养液，例如适上皮细胞培养液：近年来，国外一些公司研制了多种成品上皮细胞培养液，例如适用于角化上皮细胞的用于角化上皮细胞的KGM，适用于一般表皮细胞的，适用于一般表皮细胞的EGM等，使用很方便。等，使用很方便。v结果及鉴定结果及鉴定培养的细胞必须鉴定，以排除间充质细胞混杂。表皮细胞对角蛋白特异性单克隆抗体反培养的细胞必须鉴定，以排除间充质细胞混杂。表皮细胞对角蛋白特异性单克隆抗体反应阳性，间充质细胞对波型丝特异性单克隆抗体反应阳性。培养初期可观察到上皮应阳性，间充质细胞对波型丝特异性单克

116、隆抗体反应阳性。培养初期可观察到上皮细胞的纤维样细胞混杂生长经数次传代后纤维样细胞逐渐消失。细胞的纤维样细胞混杂生长经数次传代后纤维样细胞逐渐消失。v【3T3细胞常规传代培养和照射处理】细胞常规传代培养和照射处理】3T3细胞是细胞是Swiss鼠成纤维细胞，在表皮细胞培养中经常用照射处理过的鼠成纤维细胞，在表皮细胞培养中经常用照射处理过的3T3细胞作滋细胞作滋养层，养层，3T3细胞一般应维持在低密度条件下培养。在细胞一般应维持在低密度条件下培养。在75cm2培养瓶中接种培养瓶中接种5106105个即可，培养个即可，培养34d可获得可获得35106个细胞，可再行胰蛋白酶消化、传代个细胞，可再行胰蛋

117、白酶消化、传代培养。如果用于照射处理，将胰蛋白酶消化的细胞悬浮于含培养。如果用于照射处理，将胰蛋白酶消化的细胞悬浮于含10%胎牛血清的胎牛血清的MEM培培养液中，在养液中，在75cm2培养瓶中接种培养瓶中接种1.5106个细胞，在钴源下给予个细胞，在钴源下给予60Gy（6,000rads）照射剂量，培养使细胞贴壁，更换培养液，待用。）照射剂量，培养使细胞贴壁，更换培养液，待用。动物细胞与组织培养技术课件肌肉组织的体外培养肌肉组织的体外培养 v（1）肌肉组织的特点）肌肉组织的特点 v 肌肉组织（肌组织）细胞间结缔组织少、血管和神肌肉组织（肌组织）细胞间结缔组织少、血管和神经丰富。肌细胞长梭形，又

118、称肌纤维。经丰富。肌细胞长梭形，又称肌纤维。 v 肌肉组织培养：指将肌肉组织植块或分散的肌肉细肌肉组织培养：指将肌肉组织植块或分散的肌肉细胞在离体条件下生存、生长或发育的技术。胞在离体条件下生存、生长或发育的技术。 v（2）骨骼肌的培养）骨骼肌的培养动物细胞与组织培养技术课件神经组织的体外培养神经组织的体外培养 v 神经组织包括：神经元细胞和神经胶质细胞神经组织包括：神经元细胞和神经胶质细胞 v 1907年，哈里森首创培养方法。经历了组织块培养年，哈里森首创培养方法。经历了组织块培养分离细胞培养分离细胞培养单一型细胞阶段单一型细胞阶段动物细胞与组织培养技术课件神经原细胞培养神经原细胞培养v神经

119、原细胞培养需要极高的营养条件，培养器皿也需要经过特殊处理，神神经原细胞培养需要极高的营养条件，培养器皿也需要经过特殊处理，神经轴突在胶原和聚经轴突在胶原和聚L赖氨酸（赖氨酸（Poly-L-lysine）溶液中可以旺盛生长，神经）溶液中可以旺盛生长，神经生长因子（生长因子（NGF）可促进神经原的生长。）可促进神经原的生长。v从出生从出生48d的大鼠脑组织取材培养，培养液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑的大鼠脑组织取材培养，培养液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神经原细胞，可获得特征明显的脑神经细胞。基本方法是取新生大鼠制非神经原细胞，可获得特征明显的脑神经细胞。基本方法是取新生大鼠脑，切成小块，用脑，切成小块，

120、用HBSS胰酶消化，胰酶消化，3715min，将细胞悬液接种于聚，将细胞悬液接种于聚L赖氨酸覆盖内底面的培养器皿内进行培养。赖氨酸覆盖内底面的培养器皿内进行培养。【用品】【用品】vDMEM培养液：其中加有培养液：其中加有10%热灭胎牛血清，热灭胎牛血清，30mmol/L葡萄糖，葡萄糖，293.2mg/LL谷氨酰胺，谷氨酰胺，24.5mmol/LKCL，100mU/L胰岛素，胰岛素，7mol/LP氨基苯酸，氨基苯酸，100g/ml庆大霉素庆大霉素vHands平衡盐液，其中加入牛血清白蛋白平衡盐液，其中加入牛血清白蛋白3g/L(HBSS)v聚聚L赖氨酸，分子量大于赖氨酸，分子量大于300,00v胞

121、嘧啶阿拉伯糖胞嘧啶阿拉伯糖v型胰蛋白酶（型胰蛋白酶（0.025%，溶于，溶于HBSS）v硅胶（硅胶（Aquasil,Pierce42799）v3.5cm培养皿，培养皿，Pasteur滴管，滴管，10ml移液器（无菌）移液器（无菌）v12ml和和50ml无菌试管、无菌手术器械、水浴箱无菌试管、无菌手术器械、水浴箱【鉴定方法】【鉴定方法】v用神经原特异性烯醇抗体或破伤风毒素作为标记物，经免疫组织化学用神经原特异性烯醇抗体或破伤风毒素作为标记物，经免疫组织化学检测可判定神经原细胞；用胶质原纤维酸性蛋白作为标记物可判断混杂在检测可判定神经原细胞；用胶质原纤维酸性蛋白作为标记物可判断混杂在其中的胶质细胞

122、。其中的胶质细胞。动物细胞与组织培养技术课件v细胞培养目的与用途细胞培养目的与用途1.药物研究与开发药物研究与开发(1)新药筛选新药筛选:如化学合成药物药效研究如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等中药有效成分筛选与鉴定等.(2)疫苗研究与开发疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗肿瘤疫苗(多肽疫苗多肽疫苗)等等.(3)基因工程药物研究与开发基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等细胞生长因子研究与开发等.(4)细胞工程药物研究与开发细胞工程药物研究

123、与开发:生物活性多肽研究与开发生物活性多肽研究与开发,人参皂甙人参皂甙,紫杉醇等生物紫杉醇等生物活性成分研究与开发活性成分研究与开发.(5)单克隆抗体制备单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体治疗用单克隆抗体.基础研究基础研究(1)药物作用机理药物作用机理(2)基因功能基因功能(3)疾病发生机理疾病发生机理2,生物制药生物制药(1)疫苗生产疫苗生产:如病毒性疫苗如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗肿瘤疫苗(多肽疫苗多肽疫苗)等等.(2)基因工程药物生产基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰

124、如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素素,粒细胞生长因子粒细胞生长因子,胸腺肽等胸腺肽等(3)诊断用和药用单克隆抗体生产诊断用和药用单克隆抗体生产(4)细胞工程药物生产细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等生物活性物质等动物细胞与组织培养技术课件动物细胞体外培养现状与展望动物细胞体外培养现状与展望 * 目前存在的主要问题目前存在的主要问题:（1）细胞密度低）细胞密度低,产物浓度低。产物浓度低。（2）细胞群体在大规模）细胞群体在大规模,长时间培养过程中分泌产物长时间培养过程中分泌产物能力易丢失能力易丢失,或产物活性易降低。或产物活

125、性易降低。（3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体昂贵。昂贵。（4）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。（5）在线监控水平技术不完善，限制了优良培养系）在线监控水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。统的开发。动物细胞与组织培养技术课件第五节第五节细胞同步化细胞同步化细胞同步化培养细胞同步化培养指自然或人工方法获得细胞群体的细胞周期同步化生指自然或人工方法获得细胞群体的细胞周期同步化生长。长。 动物细胞与组织培养技术课件细胞同步化培养细胞同步化培养指自然或人工方法获得细胞群体的细胞周期同步化生长

126、。指自然或人工方法获得细胞群体的细胞周期同步化生长。 筛选同步化细胞筛选同步化细胞 诱导同步化细胞 M期细胞震荡脱落法期细胞震荡脱落法 离心洗脱法离心洗脱法 梯度沉降法梯度沉降法 血清饥饿法血清饥饿法 异亮氨酸营养缺乏法异亮氨酸营养缺乏法 DNA合成抑制剂阻断法合成抑制剂阻断法 秋水仙素阻断法秋水仙素阻断法 动物细胞与组织培养技术课件第六节第六节器官培养器官培养v定义与特点定义与特点v器官培养技术器官培养技术动物细胞与组织培养技术课件1 定义与特点定义与特点 v 器官培养：取出动物器官或进一步修整成器官型器官培养：取出动物器官或进一步修整成器官型植块，将其培养使其存活和生长的过程。植块，将其培

127、养使其存活和生长的过程。 v 1897年，利奥勃（年，利奥勃（Leob）首创。）首创。动物细胞与组织培养技术课件人体器官培养的共同点：人体器官培养的共同点： v （1）培养对象为胚胎组织的某一器官或非胚胎组）培养对象为胚胎组织的某一器官或非胚胎组织器官的一部分织器官的一部分 v （2）被培养对象浸泡在培养液中）被培养对象浸泡在培养液中 v （3）培养器官从培养液中获氧及养料，同时排废）培养器官从培养液中获氧及养料，同时排废物物动物细胞与组织培养技术课件器官培养特征器官培养特征 v（1）被培养的器官在体外存活较长时间，并保存相）被培养的器官在体外存活较长时间，并保存相对正常的功能，器官内的细胞有

128、正常的代谢甚至增对正常的功能，器官内的细胞有正常的代谢甚至增殖。而器官保存无细胞增殖殖。而器官保存无细胞增殖 v（2）被培养物为一完整器官或具有完整功能的某一）被培养物为一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝器官的一部分，如肝 v（3）器官培养不能从一个变成多个，而细胞培养过）器官培养不能从一个变成多个，而细胞培养过程中有细胞量的增加程中有细胞量的增加动物细胞与组织培养技术课件2 器官培养技术器官培养技术 v 器官培养可分为：胚胎器官培养和成年器官培养器官培养可分为：胚胎器官培养和成年器官培养 v 培养原则：培养原则： 提供充足的氧气和养料，及时排除废提供充足的氧气和养料，及时排除废

129、物。物。 抑制细胞从植块向外迁移抑制细胞从植块向外迁移动物细胞与组织培养技术课件传统的器官培养方法传统的器官培养方法 （1）表玻璃器官培养法）表玻璃器官培养法 v 1929年，费尔（年，费尔（Fell）和鲁滨逊）和鲁滨逊 （Robinson）建立）建立 （2）琼脂凝胶培养法）琼脂凝胶培养法 v沃尔夫（沃尔夫（Wolff）和施奈德（）和施奈德（Schneider） 动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件（3）悬浮培养法）悬浮培养法 （4）直接漂浮培养法）直接漂浮培养法 v 1948年，梅达沃（年，梅达沃（Medawar）设计）设计 （5）擦镜纸培养法）擦镜纸培养法动物细胞与组织培养

130、技术课件（6）金属格栅器官培养法）金属格栅器官培养法 1954年，特罗尔（年，特罗尔（Trowell）创立。）创立。 （7）琼脂小岛器官培养法）琼脂小岛器官培养法 （8）陈氏滤纸虹吸器官培养法）陈氏滤纸虹吸器官培养法 1964年，陈瑞铭发明。年，陈瑞铭发明。 （9）旋转管培养法）旋转管培养法 1933年，盖尔（年，盖尔（Gey）建立。）建立。 （10）摇摆式器官培养法）摇摆式器官培养法 1976年，巴雷特（年，巴雷特（Barret）创立）创立动物细胞与组织培养技术课件现代器官培养现代器官培养灌流式器官培养法灌流式器官培养法 v 1938年，卡雷尔（年，卡雷尔（Carrel）和林德伯格）和林德伯格（Lindberg）尝试）尝试 器官培养应用举例器官培养应用举例 v （1）软骨的培养）软骨的培养v （2）神经组织的器官培养）神经组织的器官培养v （3）血管的培养）血管的培养v （4）肝脏的培养）肝脏的培养动物细胞与组织培养技术课件动物细胞与组织培养技术课件最新进展最新进展 v* 生物反应器培养拇指指骨生物反应器培养拇指指骨 v* 在猪身上培育人体动脉在猪身上培育人体动脉 v* 生物工程人造肾脏、乳腺、膀胱、生物工程人造肾脏、乳腺、膀胱、 v* 人造角膜人造角膜 v* 1996年，我国曹谊林教授培养出年，我国曹谊林教授培养出 “人耳人耳”。动物细胞与组织培养技术课件