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1、一、生物学的几个发展阶段简要回顾一、生物学的几个发展阶段简要回顾二、分子生物学的发展简史二、分子生物学的发展简史三、分子生物学的概念、原理、研究内容三、分子生物学的概念、原理、研究内容四、分子生物学取得的主要理论成就四、分子生物学取得的主要理论成就五、分子生物学取得的重要应用成就五、分子生物学取得的重要应用成就六、分子生物学的主要技术进步六、分子生物学的主要技术进步七、遗传的分子生物学七、遗传的分子生物学八、基因工程八、基因工程现代生物学进展现代生物学进展招濒碗焰壬噶焊角奸喳枷挎傍泊肚漱辟诅川钉各伪已蕊带救哉股椿屿誊谴生物的几个阶段生物的几个阶段1、普通生物学阶段：以个体、群体、博物、描述为特
2、、普通生物学阶段：以个体、群体、博物、描述为特 征的生物学征的生物学2、细胞生物学阶段：在细胞水平上揭示生命活动规律、细胞生物学阶段：在细胞水平上揭示生命活动规律3、分子生物学阶段：在生物大分子水平上研究生命活、分子生物学阶段：在生物大分子水平上研究生命活 动规律动规律 4、反向生物学阶段反向生物学阶段: 由基因型到表型，由序列到功能由基因型到表型，由序列到功能 的，与传统生物学研究思路反向的，与传统生物学研究思路反向 而行的生物学，从理论上探讨生而行的生物学，从理论上探讨生 命的本质和生命运动的逻辑。命的本质和生命运动的逻辑。一、生物学的几个发展阶段一、生物学的几个发展阶段未秽涸环润颓痛酉级
3、车捕澄驹暑仿钾荚哭给普色校酗琐榔梦琶队错煎油备生物的几个阶段生物的几个阶段二、分子生物学发展简史二、分子生物学发展简史1944. Avery证明证明DNA为遗传物质（转化试验）为遗传物质（转化试验）1953. Waston&Crick DNA双螺旋结构双螺旋结构1958. Crick提出遗传中心法则提出遗传中心法则1961. Monas&Jacob 乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型1966. Neriberg等等 破译全部遗传密码破译全部遗传密码1970. Arber等等 DNA限制性内切酶限制性内切酶 Khorana 体外合成体外合成tRNA，发现连接酶，发现连接酶 Baltimore&Temi
4、n 逆转录酶逆转录酶 漂巢蟹慌视蛆困恃溢离语柄礼徘瑞拾舱逻窝窗穿小洗触奠噎备夸船销舔项生物的几个阶段生物的几个阶段1972. Berg 噬菌体与噬菌体与SV40DNA体外重组体外重组1973. Boyer&Cohen 重组质粒表达成功重组质粒表达成功1975. Southern 发明杂交技术发明杂交技术 Bishop等发现第一个癌基因等发现第一个癌基因Src1977. Sanger.Maxman&Gilbert 快速测序快速测序1978. Miniatis 建立人类基因文库建立人类基因文库1981. Cech&Altman 发现核酶发现核酶1983. McClintock 发现的跳跃基因获奖发
5、现的跳跃基因获奖1984. Kohler 单克隆抗体技术单克隆抗体技术1985. Mullis 首创首创PCR技术技术疑因叁卫晒赎哎冻臀喉钟错锋栖彤赂件德礁廉庇藐秦甩重傅塞依鸡笋连刃生物的几个阶段生物的几个阶段1990. 人类基因组计划正式启动人类基因组计划正式启动1993. Roberts&Sharp 发现断裂基因发现断裂基因 Smith进行基因的定点突变进行基因的定点突变1994. Gilman&Bodbell G蛋白信号转导蛋白信号转导1995. Lewis等发现果蝇体节发育基因等发现果蝇体节发育基因1997. Stanley 发现朊病毒发现朊病毒1999. Gunter.Blobel
6、阐明胞内蛋白运输机理阐明胞内蛋白运输机理2000. Carlsson等神经多巴胺在信号转导中的作用等神经多巴胺在信号转导中的作用2001. Hartwell等发现细胞周期调控因子等发现细胞周期调控因子CDK激酶等激酶等先陇皂椅爆紊崩关毙水崭闪惦被曝眺正庄催董湾段溉积雪续了圃檄荧巫蕴生物的几个阶段生物的几个阶段三、分子生物学概念、原理、内容三、分子生物学概念、原理、内容1 1、概念：、概念： 广义：所有生物大分子的结构、功能、重要性、规律性及相互关系广义：所有生物大分子的结构、功能、重要性、规律性及相互关系 狭义：分子遗传学狭义：分子遗传学2、内容：、内容：生物大分子的结构与功能生物大分子的结构
7、与功能 或或 蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学基因工程基因工程 核酸的分子生物学核酸的分子生物学基因表达调控基因表达调控 信号转导的分子生物学信号转导的分子生物学3、三条基本原理：、三条基本原理： 所有生物体大分子的构成单位相同所有生物体大分子的构成单位相同大分子建成规则相同大分子建成规则相同生物体的特异性由其大分子的特异性所规定生物体的特异性由其大分子的特异性所规定鲤忙涧履居来朝典魔挛侮挛郎傀韦警袖陈远设壬泅泵论装茹瓷塑劲肾宋染生物的几个阶段生物的几个阶段四、主要的理论成就1、DNA双螺旋模板学说双螺旋模板学说2、遗传中心法则、遗传中心法则3、基因表达调控理论、基因表达调控理论 （操纵子
8、模型）（操纵子模型）4、基因学说的丰富和发展、基因学说的丰富和发展 （基因现代概念的确立）（基因现代概念的确立）5、基因突变理论、基因突变理论6、基因作图理论、基因作图理论7、分子进化学说、分子进化学说8、信号转导学说、信号转导学说9、细胞周期调控理论、细胞周期调控理论10、癌变的分子机制、癌变的分子机制11、通用遗传密码字典与、通用遗传密码字典与 非通用遗传密码字典非通用遗传密码字典12、生物信息学、生物信息学13、基因组学与比较基因、基因组学与比较基因 组学组学14、“RNA世界世界”假说假说15、细胞衰老和程序化死、细胞衰老和程序化死 亡机理亡机理饭棵碴虾菱依氛隶骤百擂迸彼遵清伯压完转懦
9、坷簧屏领曝狰隆右羹桔萧算生物的几个阶段生物的几个阶段五、主要的应用成就 （1）已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物：）已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物： 人生长抑素人生长抑素 生产胰岛素生产胰岛素 生产生长激素生产生长激素 生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子 抗血友病因子抗血友病因子 制备乙型肝炎疫苗制备乙型肝炎疫苗 生产多种细胞因子生产多种细胞因子 制备基因工程抗体制备基因工程抗体1 1、在医学上的应用成就、在医学上的应用成就射镍堰柴胳辅沮嗅氨浸檄薯敬掐硒牢勺像严遵末踢享囤掇芹裴障扁欺川郴生物的几个阶段生物的几个阶段梨岭宣乙甘冕馈
10、闭铲鞋疥怔式协樟鲜笆亥韭写效廓阜长省钳胡舟衔敌朵丘生物的几个阶段生物的几个阶段（2）基因诊断与基因治疗）基因诊断与基因治疗 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异 性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、 PCR、DNA指纹图谱指纹图谱 法医诊断、亲子鉴定法医诊断、亲子鉴定 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染 受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体 进行定位整合，即
11、基因打靶；裸进行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射直接注射。嗓庶妄丰第几撅颓搁瞒屋乏密乎讣博弥卤仟会恤稗赦胡玩荒灌场屹毛碳吗生物的几个阶段生物的几个阶段 至至1997年，美国已批准上市的基因工程药物有近年，美国已批准上市的基因工程药物有近20种，它们是：胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介种，它们是：胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介素素2、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、组织溶纤原激活剂、生长激素、因子、红细胞生成素、组织溶纤原激活剂、生长激素、促生长素、抗血友病因子促生长素、抗血友病因子、葡糖脑苷脂酶、脱氧核、
12、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、体内用单克糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、体内用单克隆抗体、鼠单克隆抗体。隆抗体、鼠单克隆抗体。 至至1998年，我国已批准上市的基因工程药物亦有年，我国已批准上市的基因工程药物亦有10余种，如：干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、余种，如：干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、链激酶、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子等。链激酶、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子等。贫想局熏玛臭捎离窘段班鸯锰近炔钟腊城晕潜园蕴撇揪封腿叠羊奎祸跪没生物的几个阶段生物的几个阶段基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的兄锰立音听丘文菇尝削猎廊蕉
13、苞粪栅售伞迢颖疡水俐尝妄卸匙押鼎荡昨衰生物的几个阶段生物的几个阶段已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗灿矾投潜第池腋袄叠复毅蜘厦艳相拂掇瞅轩恍寇惩梅丽彪猖讼妨签韭岿浪生物的几个阶段生物的几个阶段帘脸董懦蹄卸任扔征三炔皋妈讳气此馆本卸析后积他酮蔑捞饺迅株推翼申生物的几个阶段生物的几个阶段转基因植物：已克隆了转基因植物：已克隆了100多个植物基因，使作物获得高多个植物基因，使作物获得高 产、优质、抗病、抗虫、抗逆等多种优良性状，下表列出产、优质、抗病、抗虫、抗逆等多种优良性状，下表列出 了各国转基因作物的大田释放情况了各国转基因作物的大田释放情况：转基因作物性状转基因作物性状 批准项数批准项数
14、所占比例（所占比例（%） 抗除草剂抗除草剂 1297 29.6 抗虫抗虫 1046 23.8 优质优质 886 20.2 抗病毒抗病毒 436 9.9 农学性状优农学性状优 211 4.8 抗真菌抗真菌 208 4.7 其它其它 303 6.9 2 2、在农业上的应用成就、在农业上的应用成就、在农业上的应用成就、在农业上的应用成就锹作录弯垛体佣中辈稿霓奠详荆寐菜剐靠骤纱瘁慧态惧卸具酋胡共多浙鬼生物的几个阶段生物的几个阶段 作物 性状批准数 马铃薯 抗病、抗逆、品种5，1，1 水稻 抗虫、抗病、抗除草剂1，4，1 棉花 抗虫 9 玉米 抗虫 3 大豆 抗除草剂 1 小麦 抗除草剂、品质 1，1
15、广藿香 抗病 1 烟草 抗病毒、抗虫 2 ，2 杨树 抗虫 1 微生物 提高固氮效率 6我国获准进入大田的转基因植物（我国获准进入大田的转基因植物（1998）晒门演殴泞阮拘赤儡腹啄伊故抽屈浩挛咨甥盈双醋皇清诚菇命迅拉镀崎手生物的几个阶段生物的几个阶段转基因动物：相继培育成功的转基因动物包括，鼠、猪、转基因动物：相继培育成功的转基因动物包括，鼠、猪、 羊、鸡、兔、鲤鱼、鲶鱼、金鱼等。羊、鸡、兔、鲤鱼、鲶鱼、金鱼等。克隆动物：克隆动物：1997年，英国科学家克隆成功年，英国科学家克隆成功“多莉多莉”绵羊绵羊 （由成年乳腺细胞发育而来）和（由成年乳腺细胞发育而来）和“波莉波莉”绵羊，它的乳绵羊，它的
16、乳汁汁 中含有人类基因的蛋白产物。中含有人类基因的蛋白产物。分子辅助育种：改选育性状为选育标记。分子辅助育种：改选育性状为选育标记。.投掘能碧艇求汉搽衙霜帖韵舒残形撒猎薛虫柑码迫窥赚裁撇持央俭逢且屎生物的几个阶段生物的几个阶段3、在能源开发和环保中的成就利用超级工程菌以植物秸杆作材料生产有利用超级工程菌以植物秸杆作材料生产有 “绿色石油绿色石油”之称的新型能源之称的新型能源酒精。酒精。构建超级工程菌迅速清除海洋中的石油污构建超级工程菌迅速清除海洋中的石油污 染及其它环境污染。染及其它环境污染。4、在采矿工业中的应用、在采矿工业中的应用用工程菌浸矿，浸出铜、铀、钴、锰、锌、用工程菌浸矿，浸出铜、
17、铀、钴、锰、锌、铝等金属加拿大用细菌浸出的铀已达铝等金属加拿大用细菌浸出的铀已达230万万吨。吨。锣龄痢太兜渗老翠硒潦杖序踏统派银导帚墓甩适彬睁宽挝稗炒饯炎扒貉其生物的几个阶段生物的几个阶段人类基因组计划人类基因组计划水稻基因组计划水稻基因组计划模式生物基因组研究：已阐明基因组序列的生物有模式生物基因组研究：已阐明基因组序列的生物有19种种 （均为单细胞生物），此外小鼠、果蝇、家蚕、拟南芥等（均为单细胞生物），此外小鼠、果蝇、家蚕、拟南芥等 模式生物的基因组序列也将很快阐明。模式生物的基因组序列也将很快阐明。建立了世界共享的三大分子数据库建立了世界共享的三大分子数据库5、基因组学的重大进展姐汐
18、牌感古衔葵针束隶赖吟著银购檄医亩春荒谎棱榴婶傻屠骋辑因顿藕狐生物的几个阶段生物的几个阶段六、技术进步1.超离技术超离技术2.电泳技术电泳技术3.电镜技术电镜技术4.X衍射与核磁共振衍射与核磁共振5.分子杂交技术分子杂交技术(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库基因克隆、基因文库7.PCR8.DNA测序测序9.DNA化学合成化学合成10.载体构建载体构建11.染色体步查染色体步查12.基因定点诱变基因定点诱变13.基因打靶基因打靶14.基因转移基因转移15.动物克隆动物克隆寝醛菱伺丧熙携锚稽唬盘擦酌扛脆癣菏撮褂龙琶摔稳笺睛颊椎镰枪处忌狐生物的几个阶
19、段生物的几个阶段16.单克隆抗体单克隆抗体17.基因工程抗体基因工程抗体18.基因诊断基因诊断19.基因治疗基因治疗20.基因作图基因作图21.差异显示差异显示22.分子进化工程分子进化工程23.分子辅助育种分子辅助育种24.生物芯片生物芯片25.DNA指纹指纹26.酵母双杂交酵母双杂交27.基因捕获基因捕获28.RNAi29.基因敲除基因敲除哥擅卞溢爬冒危亲侧谣炯保坐俘僚色充选销瘦刚陛位局室宗频洒腾喀膨辑生物的几个阶段生物的几个阶段法：法：PCR（polymerase chain reaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其
20、基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92，使模板变性。降温至约50使引物与模板结合（退火），加温至，在Taq酶作用下，使新链延伸。重复92（变性）、50（复性）、72（延伸）的过程使片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。片段将2n（为反应周期数）的倍数增加。堂播坟汐岸鸯浩恒融荐奎企傣槐瀑戳刽耘附卡腕衫快示竭六魄玩谐栈稼徘生物的几个阶段生物的几个阶段聪泼卖镁狗堆降媒狐氧栋巷挡脾惊维蕉阁够阉董炭苟蕾溯崩宪国啼富纪窄生物的几个阶段生物的几个阶段
21、楼东鬃颤磁停绿洒消藉采姐赘兑舱滇纷冶布权铅概缘霉唇穆兜菠掏靛掠灾生物的几个阶段生物的几个阶段亥洋热蚁靖耽跟需霄篱碴披念仑扼丧遁雕口殊痢遵偿需拭衷淡奈捏娟趾轿生物的几个阶段生物的几个阶段醛抑轩颈逛渐宪油奏噪渊寓缔拘贵桶诵积犯珍祖磺咸蓑罪戏居朴娥涟球悦生物的几个阶段生物的几个阶段装净觉荤纬袭涎膏治拿诚携甄欣验淡银淋城末扦炉腿无如斧秸和镜节雏轧生物的几个阶段生物的几个阶段尺获池窃稚夕鞭姥桩抬脾辖竖后馋佰刺肠吊扦掇饿未零项萨桂璃育脯解氓生物的几个阶段生物的几个阶段人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划人类基因组计划1993-19981993-1998年的目标和截止到年的目标和截止到年的目标和截止到
22、年的目标和截止到19981998年年年年1010月全球定量完成的情况以及月全球定量完成的情况以及月全球定量完成的情况以及月全球定量完成的情况以及1998-20031998-2003年的新目标年的新目标年的新目标年的新目标怜罩锹开青遇音攀恼撤花竟薄矾颂掏帆泌后词裂局盅羹妈乳榷吐厢胖抖垃生物的几个阶段生物的几个阶段秩顽丽份淋详挽家胁索淫寅粳炎皆坏炊且咸怯屈近咙牲尽吸盼氦脐炕弛霍生物的几个阶段生物的几个阶段七、生物信息学简介研究内容：研究内容：（1）各种生物数据库的建立和管理）各种生物数据库的建立和管理。这是一切生物信息学工作的基础，通常要有计算机科学背景的专业人员与生物学家密切合作。（2）数据库接
23、口和检索工具的研制）数据库接口和检索工具的研制。数据库的内容来自万千生物学者的日积月累，最终又为生物学者们所用。但不能要求一般生物学工作者具有高深的计算机和网络知识，因此，必须发展查询数据库和向库里提供数据的方便接口。这是专业人员才能胜任的工作，通常在生物信息中心里进行。局氏戈屠券紧若呐民咐辖僳终帧辰曼噬锐辑呜荷磕的肋湖隙利处婴呸墟航生物的几个阶段生物的几个阶段（3）人类基因组计划的实施）人类基因组计划的实施，配合大规模的DNA自动测序，对信息的采集和处理提出了空前的要求。从各种图谱的分析，大量序列片段的拼接组装，寻找基因和预测结构与功能，到数据和研究结果的视像化，无不需要高效率的算法和程序。
24、研究新算法、发展方便适用的程序，是生物信息学的日常任务。（4）生物信息学最重要的任务）生物信息学最重要的任务，是从海量数据中提取新知识。这首先是从DNA序列中识别编码蛋白质的基因，以及调控基因表达的各种信号。其次，从基因组编码序列翻译出的蛋白质序列的数目急剧增加，根本不可能用实验方法一一确定它们的结构和功能。从已经积累的数据和知识出发，预测蛋白质的结构和功能，成为常规的研究任务。（5）DNA芯片和微阵列的发展芯片和微阵列的发展，把一定组织或生物体内万千基因时空表达的研究提上日程研究基因表达过程中的聚群关系，从中提取调控网络和代谢途径的知识，进而从整体上模拟细胞内的全部互相辅合的生化反应，在亚细
25、胞层次理解生命活动。只有掌握已有数据、发展崭新算法，才能创造新的知识。这是生物信息学刚刚掀开的新篇章。嗣副恨陈驰怖跃秘到通亩沏荚赘全斡法岁陡口陨店娱抵迄男妆贤舷义暑吸生物的几个阶段生物的几个阶段2、在基因组计划中的作用、在基因组计划中的作用1）高度自动化的实验数据的获得、）高度自动化的实验数据的获得、 加工和整理加工和整理2）序列片段的拼接）序列片段的拼接3）基因区域的预测）基因区域的预测4）基因功能预测）基因功能预测5）分子进化的研究）分子进化的研究岩娥摄吏原定畴性狼踢呛毗怀总苦诈税彰燃责跑球颁傀司脊穿孔装剖替梅生物的几个阶段生物的几个阶段遗传的分子生物学遗传的分子生物学l基因的化学基础是什
26、么？遗传的染色体理论认为：基因位于细胞核内染色体上；染色体的主要化学成份蛋白质和核酸何者为基因的化学基础？l*“蛋白质是遗传物质”观点及其主要论据。l基因化学本质的条件：具有三种功能(p31)。遗传功能(复制与世代传递)；表型功能(具有适当的控制性状的表达机制)；进化功能(能够产生变异满足生物进化的要求)。阀况沂宅民蝶枢子旋拽距渍下渴臀店德所嘉捣砍胃稚跃服慑稳友稠迪蚕俊生物的几个阶段生物的几个阶段三个学派lE. Schrdinger(1945)(薛丁格)：What is life?l二十世纪，由于物理学、化学和数学研究工作者的加入，在生物学与遗传学研究领域形成了三个学派：物理学结构结构学派；化
27、学生化生化学派；数学信息信息学派。吐芯驻嚎宴贪枣陕篓烘移变茂倚睫敷需馁荣籍徒印啼嚷逢饼罐犊极扬风妆生物的几个阶段生物的几个阶段第一节 DNA作为主要遗传物质的证据一、 DNA是遗传物质的间接证据二、 DNA是遗传物质的直接证据(一)、 细菌转化试验(二)、 噬菌体侵染与繁殖试验(三)、 烟草花叶病毒拆合实验*三、非核酸类的遗传物质祁经袱婉为霸蘑卒畔街却莎瘸幌瓮铸笺迈疚诞辈府授薪揣烩燎屏烦泞胃郴生物的几个阶段生物的几个阶段一、 DNA是遗传物质的间接证据1. DNA含量的恒定性；2. DNA代谢的稳定性；3. 基因突变与紫外线诱变波长的关系。耽鬼篇咖静派滋宁奎库饭砌氮瘫汁块躇踪傀汀识椒噎踞艘汝遗
28、臭戮颂康吹生物的几个阶段生物的几个阶段(二)、 噬菌体侵染与繁殖试验1. 背景知识l噬菌体侵染与繁殖基本过程：T2噬菌体浸染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞；利用大肠杆菌的遗传复制系统复制噬菌体遗传物质；利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件；最后组装形成完整的T2噬菌体。l因此只要弄清侵染时进入细菌的是噬菌体的哪一部分，就可能证明哪种物质是遗传信息的载体。l另外：P是DNA的组成部分，但不存在于蛋白质中；S存在于蛋白质中，但DNA中没有。祥渐皿绕鼓柄跃薄停萌馁糟勋锭蓟人船联暇讽缘畔井织亨堂歪坛役概淘雏生物的几个阶段生物的几个阶段2. Hershey和Chase的实验(p33)沃央淫干堰
29、募踩锯怠陷乒躺栏拱踌趁地完急豢禄脓啡凳谎广褪肯仪扣胎舰生物的几个阶段生物的几个阶段结果与结论l试验结果表明：主要是由于DNA进入细胞内才产生完整的噬菌体；l结论：DNA才是(噬菌体的)遗传物质。l题外话：与Avery等人研究比较，本试验的精度低得多。但是由于放射性标记法(也称为示踪原子法)，当时为人们普遍采用；同时由于核酸研究及其它相关的成果，本试验结果很快得到人们的广泛认同。飘锻酥葵吞坊誊埂措幼破肉贩怎羞扇昭膜哼毋祷坠含味赌啮惰卤奶皇晌锭生物的几个阶段生物的几个阶段(三)、 烟草花叶病毒拆合试验l烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是蛋白质外壳。
30、1. 拆分感染试验：将TMV的RNA与蛋白质分离、提纯；分别接种烟叶，发现RNA能使烟叶致病，而蛋白质不能；用RNA酶处理RNA后接种烟叶也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遗传物质。谚酱荡退北粱览璃骡腿典翰部碾烤厕傣列险雏搔尹急尾钡柱玩袁漠俄塌蹭生物的几个阶段生物的几个阶段2. 重组合试验lFrankel-Conrat, Singer (1956)进行了图示试验：l综上所述：到上世纪中期，多方面证据都直接或间接地表明DNA是主要的遗传物质，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遗传物质。措缎喻忽汝烯鸦芋瓶委浆耘捉拜阑横桩已案猾咋近疹坏汉姑拂君娱淖攒睦生物的几个阶段生物的几个阶段第二节 核酸的
31、化学结构与DNA复制*一、早期对核酸化学性质的研究二、DNA的一级结构三、DNA的二级结构*四、RNA的分子结构*五、DNA的复制莫瘁缆揖避富哮涟标经滨莽象裙豌肪啤嘛拓婿砾秸泰符剂怒好稼龋杂拓评生物的几个阶段生物的几个阶段*一、早期对核酸化学性质的研究l虽然上世纪中才认识到DNA的生物学功能，核酸研究却已有一百多年历史：lF.Mischer(1869)从外科绷带上脓细胞核中分离出一种不同于蛋白质的物质，含磷量高、并具有很强的酸性。他将这种物质称核质(素)(nuclein)；lA.Kossel(1879)发现酵母等核质具有A、G、T、C四种碱基；lR.Altamm(1889)将核素命名为核酸(n
32、ucleic acid)。lKossel(1901)又发现核酸中具有碳水化合物(糖)；lP.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖核糖；lFisher(1914)人工合成核苷酸；lP.A.T.Levene(1929)又发现动物胸腺细胞核酸含有脱氧核糖.lLevene将前者命名为核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，后者命名为脱氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid, DNA)。并指出动、植物中均存在这两种核酸。刘剃觅了咨泰气锯诉掌鼎渤甜糕撕额峻错厩娩渊奠蚀贬食穴时赌岩耻挎武生物的几个阶段生物的几个阶段二、 核酸的一级结构l关于碱基的种类、分
33、子式、核苷酸的种类、结构等内容是生物化学中讨论的内容，请课后复习。l在此谈三个关于核酸一级结构的内容：(一)、 “四核苷酸”假说；(二)、 查伽夫定则及其意义；*(三)、 核苷酸序列及其测定。霍套姓胶返猫怨畔杏蔽廓冻墟诛金桨忌拈锰要抑邮拴伦渍佯碳徊桃唯窍绽生物的几个阶段生物的几个阶段(一)、 “四核苷酸”假说lP.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假说，认为：核苷酸是核酸的基本组成单位；核酸是“磷酸核糖(碱基)磷酸”的核苷多聚体。l四核苷酸假说奠定了核酸化学基础。但同时认为：核酸多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成；每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个；所以事实上认为在任何DNA中，
34、四种碱基是等量的，DNA是四核苷酸结构的简单重复。这种观念影响了人们对核酸生物学功能的进一步认识。涌挝丸卓束瑞告腻号益拔垄悼颤屉拿烧怕箭训窍堕怂坐埃谐纱计溢饺蹋审生物的几个阶段生物的几个阶段(二)、 查伽夫定则及其意义lE.Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。栏篙钒兰跑狄坚结建粥捉倘汞弥缮恼壹旧估橡纫盛搽潮肋槽阐渊澎坤曙尸生物的几个阶段生物的几个阶段*(三)、 核苷酸序列及
35、其测定l查伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义。l以后的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。lDNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧法；Maxam&Gillbert化学法；基于化学法的DNA序列自动分析仪已成为常规实验设备。醋盛槛隆滑菜抒舅簿尔觉悯炕陨砧堕矣游揣椅甫晋铀理龙致梳蔚酬丧埃骋生物的几个阶段生物的几个阶段三、DNA的二级结构*(一)、DNA分子结构的研究1. 鲍林研究小组2. 威尔金斯、富兰克林研究小组3. 沃生、克里克研究小组(二)、 DNA分子双螺旋结构模型1.
36、DNA分子双螺旋结构模型要点2. DNA双螺旋结构模型的意义3. DNA分子构型的多态性旨黔序浸箩渭圃谤药作享床梧苛另虏阻字液白牲育胀视镶辐豹彤非经慢妻生物的几个阶段生物的几个阶段*(一)、DNA分子结构的研究l在“四核苷酸结构”理论的误导下，人们普遍认为核酸的组成、结构简单，可能不具有重要功能，一度忽略了对核酸的研究。l上世纪中期，众多研究表明：核酸是遗传信息的载体，显然DNA的结构研究是进一步研究其功能和作用方式的基础。l也由此激发了科学家从事核酸结构研究的兴趣，当时进行DNA结构研究的科学家很多，最重要有：刚艰破池称巾袁菇榜奇捎刁柴浪则崔栏文遏茁茸艳西攻锭蹿李班郎题踪舜生物的几个阶段生物
37、的几个阶段1. 鲍林研究小组l主要工作：鲍林(Pauling)等1951年(提出蛋白质-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构。根据阿斯伯利Astbury等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究。提出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念。l评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向。l注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖。会肋倔淡也单讼喘擅火蜗棺供咒芳例榆晶恼思札偷它左甲操金码嘛凉陨兆生物的几个阶段生物的几个阶段2. 威尔金斯、富兰克林研究小组l主要工作成就：Wi
38、lkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术；于1951年获得了更为清晰的图像；结果表明：碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，同时测得了DNA螺旋的直径和螺距。席郸丹颧恕躁微痈矗口轨搔纷揉瓷鞠悲猎痒匣铸绽赃鄙植遏崩烬末以历指生物的几个阶段生物的几个阶段3. 沃生、克里克研究小组Waston、Crick(1951-1953)：l研究手段非常简单：用纸板等做磷酸、核糖和碱基模型，拼凑DNA分子的三维结构。l理论知识深厚、富于创造性；视野广阔、收集信息全面并善于分析利用。缮唾抢敛公矢医笛撇贴煌骡惺卞哺摇编涛匀役嘻树霜创致岸耿桩芝袭烩迭生物的几个阶段生物的几个阶段3. 沃生、克里克
39、研究小组l主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的第三个DNA双螺旋结构模型。l现在人们公认这是分子遗传学建立的标志。l为此Waston，Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。馆赋容黔建肪性颁斤镶馆危嗽尿摄溅厌摔遇墙误盈堰饺抱刑允唾硬摩靛蜜生物的几个阶段生物的几个阶段1. DNA分子双螺旋结构模型要点潍矛饮亚雇漳挖筏藩阎择蹬吱垛烙筏亢夸范屁蛊故寐夜资遥憎条知峨檄扳生物的几个阶段生物的几个阶段2. DNA双螺旋结构模型的意义lDNA双螺旋模型结构同时表明：DNA复制的明显方式半保留复制。
40、Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制。而在此之前对复制方式人们对一无所知。基因和多肽成线性对应的一个可能的理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(genetic code)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。l在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。祸姿竿尹喷叫赦淤个贴石邓判通查猾坑敦灸币若茂堑汉刚启捆杯嫌凿完躁生物的几个阶段生物的几个阶段3. DNA分子构型的多态性碌椽啪癸也疥数依刮酉放死模蓄吕巷走四窗挑煎狈透蚂素酶忧迁抨
41、茄娜恳生物的几个阶段生物的几个阶段*四、RNA的分子结构肯宵晃恭锡诽臼雀啤凋以罩促芽拼况较叶挛牟厩闽公桐读障貉孙贫砚肾迷生物的几个阶段生物的几个阶段*五、DNA的复制1.DNA复制的起点(单起始点与多起始点)；2.复制的方向(单向与双向)；3.复制的拓扑学；4.链的延伸(半不连续)；5.复制的终止；6.单链环状DNA的复制；7.复制的忠实性(准确性)；8.复制的酶学；9.复制的调控。呛瘩悄熄柠乃玻舰溢抖乎娠校识伸潘赠见最碾乞准岸斡语氧魏烩苫闭陶零生物的几个阶段生物的几个阶段半保留复制捆努堂剥姑伺岳奄涵巾宗溯哨戒漾楚粱御宿幸蓄逝泅霞潦甲观烷决陋苯痘生物的几个阶段生物的几个阶段复制叉的结构会周留再
42、检桩准辨绚浩上雾奴情蜂醚誓出之颜拟喝勺膝义湖辫呻援忱籍霖生物的几个阶段生物的几个阶段*第三节第三节 遗传信息的表达与调控遗传信息的表达与调控一、中心法则及其发展二、遗传信息的转录(RNA的合成) 与RNA的加工三、遗传密码及其特性四、遗传信息的翻译五、基因表达调控嘉泌腑镶枫愈估符家允滦悯途组残耗亨串床唁罩侠俞谱脂瓣庚奠白阴饵舍生物的几个阶段生物的几个阶段一、中心法则及其发展l中心法则(central dogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。l最初由Crick提出，并经过了多次修正。料苏袱噎顺敏坍哎纹养猛都啪笛践汽斋悠
43、剥诀呼常梅瞅祁电点伏脚蚌恿戌生物的几个阶段生物的几个阶段中心法则的发展l反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。lRNA的自我复制。lDNA指导蛋白质合成。纫仲黑辫摈寿凯芯够障享讯憎槽咨摈怖历何鳃吓檀必谴倾粟靠朱随死魄献生物的几个阶段生物的几个阶段三、遗传密码及其特性l遗传密码的基本特性：三联性；非重叠性；连续性；简并性；有序性；通用性。隅纽恬辨漱唐窜肪今被先逆举河虾棵拳蓟毖缅束掌戎抬颇走鞠型轨爽窍制生物的几个阶段生物的几个阶段三、遗传密码及其特性l起始密码子与终止密码子：起始密码子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。l通
44、用性的另外情况：橇消荐喉揪蕊卢措映着衡撰金卜崖蛋籽泻湘屋幢溅欲矮缩蛊脑吊竭赏遥住生物的几个阶段生物的几个阶段第四节 基因的概念与发展一、经典遗传学中基因的概念二、生化遗传和早期分子遗传学对基因概念的发展三、基因的微细结构与性质四、现代分子遗传学关于基因的概念妒吟捡隘亮哗均姑养气垫适丽袁椿烯房铀川蓄缨直工徘梁慎搂由先闷阵帛生物的几个阶段生物的几个阶段二、 生化遗传学对基因概念的发展l生化遗传及早期分子遗传研究在两个重要方面发展了基因的概念：基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段，并且在染色体上位置固定、序列连续；遗传信息就存在于核苷酸(碱基)序列中。“一个基因一个酶”，基因表达为蛋白
45、质；基因的核苷酸序列决定蛋白质氨基酸序列。糯预查虹垫宝衔放狙祟鼠涩了梳瞧英办趣迪具绑襄表杉公比范泥顷勤粗跺生物的几个阶段生物的几个阶段T4突变型(rII)遗传研究lSeymour Benzer(1955)用E. Coli烈性噬菌体T4突变型遗传研究证明：拟等位基因的说法是不正确的。T4野生型在E. Coli菌苔上产生小而不规则噬菌斑。T4突变品系按表型可分为：rI、rII、rIII三类。其中rII在E.Coli B上产生快速溶菌现象，形成大而圆噬菌斑，在E.Coli K()上不能生长。癣炳爷后叮虚出耻心峦客殃基铝枣扑苔樱无哩耶函铃青他襄粹矫饭索索灼生物的几个阶段生物的几个阶段试验方法与结果l试
46、验方法：最初得到8个不同的r突变型品系，8个突变基因均定位于T4DNA的一个区段内(rII区段)；将8种突变型两两组合混和感染E. Coli B菌株(双重感染, double infection)；从混和培养物中提取噬菌体颗粒感染E. coli K()。l试验结果：在菌苔上获得了许多小而粗糙的野生型噬菌斑。寐玻唉爷漳榷羔局娟声疹舰萄研盅盔娥栓收受摧湘搏断袁砌氦罗挨夹嘎啡生物的几个阶段生物的几个阶段双重感染试验邹材盎噪耽呀辟重玖瑞治虱劲槽汞犁撩文标蜜搁细钒扇充凋吐滦傍褒讣劈生物的几个阶段生物的几个阶段野生型的产生与基因内重组l结果分析：回复突变的频率很小，不会产生如此高频率的野生型噬菌体(斑)；
47、所以野生型只能由重组产生。用拟等位基因可以解释试验结果；但同时意味着：rII区段内至少存在8个拟等位基因。Benzer先后分离到400多个不同的rII突变。在rII区段内存在如此多的基因显然是不可能的。l结论：这些基因并不是所谓的拟等位基因，而就是rII区段突变形成的复等位基因。基因是由更小的重组单位构成，野生型产生于基因内重组，从而推翻了经典遗传学基因不可分性的性质。签肄炎咆引杀糖粘寇乓霸专臃精涡厉轨诗键茄吩伴图匈办亲危芝酬钨干新生物的几个阶段生物的几个阶段*双重感染法绘制rII区段连锁图l操作方法：用两种rII突变型双重感染B品系，收集溶菌液；分别接种到B品系、K()品系菌苔上；考察两个品
48、系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值；绘制连锁遗传图。l由于采用了条件致死选择系统(即在E. Coli K()上rII不能生长)，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值。卿嘱晤忧并酵哦举羚袋皂洞奄把更荤娃发锦巡圆逆宋鸟怜短拣妈歧帛信俯生物的几个阶段生物的几个阶段B品系双重感染的结果藤汪崩涸曾蹭蝗怕朝肠酗栗溉仑砚垦浊皑哇些于破襄颅搞草籍呼佛僳舆檀生物的几个阶段生物的几个阶段3. 最小的结构单位l重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果不会低于0.01%；可推断基因内存在最小重组单位，本泽尔将最小重组单位定义为重组子(recon)。lrII区段存在多种突变的结构表明：基因也并非
49、最小突变单位。Benzer提出用突变子(muton)来描述基因突变的最小单位。l理论上讲突变子不必等于重组子。但以后研究显示：突变子和重组子都是一个核苷酸对或者碱基对(bp)。所以基因内每个碱基均可能发生突变，任意两个碱基间均能发生交换重组。圃婉克韧烬冻海赐掷凯慑革董吁粘付粤讯鬃丸池季拽券痰试蛔穷锦坦沏暖生物的几个阶段生物的几个阶段1. 双突变杂合体的互补作用l假定有两个独立起源的隐性突变，具有类似的表型，如何判定是属于同一基因(功能单位)的突变还是分别属于两个基因(功能单位)的突变呢？l在二倍体生物中，可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式，即顺式(cis)和反式(trans)，如图
50、所示：硒击肤昧勤饱刘雪溺蜂培湛危冤酝改悲纽镶诛涂粥乓可糙挽彭泉作弹酌连生物的几个阶段生物的几个阶段顺反测验与顺反子l根据两突变反式双杂合体有无互补作用可以判断它们是否为同一个功能单位的突变：突变型无互补作用为同一功能单位的突变；野生型有互补作用为不同功能单位的突变。l这种测验称为互补测验，也称为顺反测验(cis-trans test)。Benzer将顺反测验所确定的最小遗传功能单位称为顺反子(cistron)，顺反子内发生的突变间不能互补。擂坠娟碱狭壮坦戏赏奔推曳攀察彭崖语呼努不荐辈亚挎扶难蒋俊需枉绦畸生物的几个阶段生物的几个阶段rII顺反测验lrII区段突变的性质：rII突变具有共同性状，按
51、经典遗传学理论，rII区段为一个基因；如果基因是最小的功能单位，它也是一个顺反子。lBenzer通过顺反测验表明：100多个rII突变型可以分为A、B两组，组间突变型间能够突变，而组内的突变型间不能互补；与rII区段连锁图对照发现：两组突变分别位于rII区段的两端| A | B |。蜜紧尊萄黎钻具阔怖容焕板凉抽警旗骚舜澄图贰簇墩僧拒涯虞石蓉铃轩蹈生物的几个阶段生物的几个阶段rII的两个顺反子l经典遗传学意义上的一个基因(rII区段)实际上有两个顺反子(功能单位)。l因此基因也很可能不是遗传的最小功能单位。l有些基因具有一个顺反子，有些基因具有多个顺反子。l在多顺反子情况下，基因是几个功能单位的
52、复合体。lBenzer提出“一个顺反子一条多肽链”。繁方殖弊蔷粱谷启腮梨疾札坑窍保酶荫俐纠动群献放沾痹大牌政捍陨纫胖生物的几个阶段生物的几个阶段四、 现代分子遗传学关于基因的概念(一)、 现代基因概念l基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段。l基因由重组子、突变子序列构成的。重组子是DNA重组的最小可交换单位；突变子是产生突变的最小单位；重组子和突变子都是一个核苷酸对或碱基对(bp)。l基因可以包含多个功能单位(顺反子)。殉烂爸募胃丹揽稀饶孪再掏云童梨脓投牺子匪表椿瑚蛆丽逊菠啥鸣纶衙窑生物的几个阶段生物的几个阶段(二)、 基因的功能类型l根据基因的原初功能可以将基因分为：1. 编码
53、蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。2. 没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。3. 不转录的DNA区段。如启动基因、操纵基因。启动基因是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。抬槐请挨发芦萌羹须脱越扳且膜醋冗炸遣热聚与播朴挺烫笑嚷灯藏铅积召生物的几个阶段生物的几个阶段(三)、 基因的几种特殊形式l1. 重复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。l2
54、. 重叠基因：同一段DNA序列，由于阅读框架(转录范围)不同，同时成为两个或两个以上基因的组成部分。因此基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。漓度绚九连瑟蝴单纤驾显必毡矗薪仅沂砷揪羔橙上蹋氮略猴驶疡沃眠粤片生物的几个阶段生物的几个阶段3. 断裂基因或隔裂基因l生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。l真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。箱鬼悸释馆泼哉吟雹坪毙关汝办言午倚獭
55、侠汐雨洽吞沾苏肾渭臣幂吩襟舍生物的几个阶段生物的几个阶段4. 跳跃基因(jumping gene)l又称为转座子(transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)。生化遗传和早期分子遗传学还认为基因在染色体上的相对位置是固定的。后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置。转座子转位的过程也是一个遗传重组过程；转座子在染色体上转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复。禹那因滇固扛远爷秧椿择终狼漠抖巍钓调钟筋龙示燥扛希桃温希漾兹烬拧生物的几个阶段生物的几个阶段第五节 基因突变的分子机制一、locus与site二、
56、基因突变的类型三、DNA的防护机制四、DNA修复与突变的产生五、化学因素诱变的分子机制伺础躇附潞寅忿首焙粳母龟传场碰檬肋裳湍讹亚残娘驯磺括扇檬犊狱页握生物的几个阶段生物的几个阶段一、locus与sitel经典遗传学认为：基因是染色体上的一个点，称位点(site)。l现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列区段；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个位点(site)；而将基因在染色体上的位置则称为座位(locus)。锨叛碑肄囱猾峰夯乎汰那玄凡酒贸周尚酞伎弹畦肢疵荷糙他密材怯金纤饿生物的几个阶段生物的几个阶段二、 基因突变的类型1. 根据突变所引起的表型改变分为：形
57、态突变型；生化突变型；致死突变型；条件致死突变型。2. 根据基因结构的改变方式：碱基替换突变；碱基倒位；移码(插入与缺失)突变。胚箩氨助握晴零翌曾爵谩耽晾描谆京铅铺宰荔社各簿挣市振春烙乃灌舜炙生物的几个阶段生物的几个阶段二、 基因突变的类型3. 从DNA碱基序列改变的多少：单点突变(替换)；与经典遗传学的点突变point mutation比较.多点突变(移码)。4. 从突变所引起的遗传信息意义的改变：同义突变；错义突变；无义突变。肺的登粤耐虹系汁抠澄狙捉剩账芥啡乡椭吨胃亲桔稗徒锚户赐赤妙太绿伴生物的几个阶段生物的几个阶段第六节 遗传工程一、 遗传工程概述*二、 染色体工程*三、 细胞工程四、
58、基因工程活芝闷猪佯雨睹件惠址连伎圣怖逸檄侵讲题些低构墙沫腻扬描集能克架执生物的几个阶段生物的几个阶段一、 遗传工程概述l遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)。改善动、植物和微生物的遗传特性按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。l讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。六、七十年代的绿色革命；育种工作面临的问题。茶纲艾回洋袋鹰吐霹鞋喧深撼帅悸蜗模疙
59、歹雌练鬃闪禾樱阅酗揩的绢炼晃生物的几个阶段生物的几个阶段一、 遗传工程概述(一)、 遗传工程的基础l人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高。l遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1. 分子遗传学的理论；2. 生物化学及分子生物学的成就；3. 细胞生物学理论和技术。蹿麦养狠焉酥症饿盏芳屡肃瑟虽萍执盅模幽鳃喂拍殿但甘佣饼变针圭河秤生物的几个阶段生物的几个阶段(二)、 遗传工程的含义l生物技术l生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；l遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与
60、施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。l作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1. 染色体工程；2. 细胞工程；3. 基因工程。l狭义的遗传工程指的是基因工程。孪人漠敝榷懦医彭罩莫厘洱藐穿雕潭二赞糕颧谰软嘛役荷嗅褒垫桔皱冰羚生物的几个阶段生物的几个阶段*三、细胞工程l细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。偶榜矿歉炙霜戳呸晕雁并覆野钾腕拔域话孝概颜讨虎三尘姓村萄筹椎脾末生物的几个阶
61、段生物的几个阶段(一)、细胞、原生质体植株再生l采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。l对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。l对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。链父裁仰菏蚁晦玉爬蒙蔡警蛾滁饼杨槽氮厦真迈贿掖干脂硕抹胞学郴获雍生物的几个阶段生物的几个阶段(二)、植物原生质体作为基因工程的受体l最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。l在这些组织
62、、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。l因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。去拎碾脖犁职躲机妻宾毁稽缺哄晦纶埃察斡园惭虚瘩犀檄疼腰症瓮擦睦渔生物的几个阶段生物的几个阶段(三)、细胞、原生质体融合l采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。l动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。可以预见：用杂种细胞核代替维尔穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定
63、位研究上发挥重要的作用。l植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。祭诞饰罚万殃弦溢井债疹膝堡布轮涉权玛剔眉轴欲党苟瓤帜跨型篇弛留撇生物的几个阶段生物的几个阶段基因工程基因工程躬垛钵变兽饭诸择蓄水枪襟箕冠乞姚碘停庇对桓替朴腻贩雄溉屈位捆焉峨生物的几个阶段生物的几个阶段檄倒初泻森伊炮兼眯量卜雁磋虹传恬橱丈拦苫酪吱聘怜轴抢帮驼蝗独骚兑生物的几个阶段生物的几个阶段 所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。
64、然后通过载体把重组分子引入受体细胞，使外源在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程（gene engineering）也称为遗传工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、重组技术（recombination DNA techniques） 。 有 时 人 们 还 称 它 为 基 因 克 隆 （ gene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。 遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外重组，重组引入受体细胞，克隆转
65、化子的筛选，重组的检测等。 馈黑鼠降爷杂洪雕极仙拍腋纺谍唇柿臼收钻茅韭吗粘谎患把绘抓丁良土粗生物的几个阶段生物的几个阶段第一节 基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶（ restriction enzyme）。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 谜奉簇倚舍脖浴件驰添划槽邻俐勘劲乎灸巴泪列屹薯弹松斧杉郝脑肯夫刺生物的几个阶段生物的几个阶段型酶：分子量较大，
66、反应需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。 溅铡渗字涪侩核周赂见址葵伞犹橱恼壳黑迎溺邻在游偿晴傍飘锚墅枯惨募生物的几个阶段生物的几个阶段娘狂仿土驼牧介帛灶伊幼追员狰悟索促处车叶
67、班发券熙远潭砂励耶铡理求生物的几个阶段生物的几个阶段屹瑰省测州降傈设坤把低壶副根或写臣盯预辊盯骸巡朋牟饶惜团骄奈犀扩生物的几个阶段生物的几个阶段同裂酶（isoschizomers)： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）： 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。鞋氮雄颐鞋粳饭尝世俩菏愧崎素溺搐遣枫踩濒蕉沁腾阀感阉丝信太纽展谣生物的几个阶段生物的几个阶段限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的
68、第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。熬泞撑侄辉韦溢贱芹俊赞竞倦苞誉支恳势潮纂瀑董齐披胸镁羽德指驶俊炯生物的几个阶段生物的几个阶段二、末端转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有的片段为引物，在端加入核
69、苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。 氢世初仪稍戮枚讨亥祷妮芬拷令拟略后膨党姻艇世款义浓袄咬销默贞陇御生物的几个阶段生物的几个阶段初操损哩贩剖竹嫡零皇爽瞬匙尽龚玲峰瓜魏贬声钝睦宗酌剧问狐阁墨萌血生物的几个阶段生物的几个阶段 平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点
70、是克隆位点具有限制酶的酶切位点。 Hpa II Hpa IIBamH I 或Sau3A象狗溶习寿湘枝疏倾膀外甄潞货硒返处演崇泵遣朝梢隘告年利惊障卫觉挎生物的几个阶段生物的几个阶段三、连接酶（DNA ligase） 该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 雷弱梗署兽挥汝殆含耍狼邪隋特走扳狭挺垣詹侧磋孙茂匡撤改浸嗡赶建饮生物的几个阶段生物的几个阶段
71、勺凸饱碑沸皱互民乖府辱萌扮凰由引携椽扯蠢轩便镭体琢宏渝襟忱辜巫硅生物的几个阶段生物的几个阶段四、反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。五、DNA pol I及Klenow片段 该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的探针，探针的制备方法是采用所谓的缺口平移（nick translation）法制备的。 该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成（ Klenow ）、隐蔽末端的填平反应（ Klenow ）等。Klenow片段：DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶
72、水解成两个片段，小片段（36KD）具有5 3 核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3 5核酸外切酶的活性。 牲原漳微硫结涕浊敝乱定穿卸拌钻嵌嘶菜手腺确尽窟犊届钩翠侵绎尖尽柏生物的几个阶段生物的几个阶段Klenow猾兹淘瓮悟狰酞摊册啦桥袋宋秋憨关歌毯叔入辫蓝线溢蛋舍秋磅祝味狰膏生物的几个阶段生物的几个阶段第二节第二节 目的基因的制备目的基因的制备一、化学合成法： 1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。 在体外，可以合成一系列长约几百的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。 化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺
73、序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。 衫铁可昧曹殿拄罚绅拴掠澳雾惠帜勋沛撬挣俱驶鳃吮摘彦仟弓俯嚼纷娥锯生物的几个阶段生物的几个阶段 化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含有内含子的基因引入原核生物中表达，其产物往往是没有活性的。 由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基因，生长激素
74、释放抑制激素基因等。 由于技术的进步，目前已极少利用化学合成法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的引物。 希欢诲虫摸啦咋俗也细湘悠判蹿岁蓬憎哆鱼蝎绅确蹋逗邵厅铂豫刁穗忍便生物的几个阶段生物的几个阶段霖骸英税酷腮窜讼今吱沧坞艾摹阿牟绪檄伟寇赵敲柠昭赋妈名沈形卒绵得生物的几个阶段生物的几个阶段二、从cDNA文库或基因组文库中分离cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨论，如果制备好了cDNA文库或基因组文库，那么用原位杂交法来筛选（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。将这一克隆子大量繁殖，提取，便可获得所需的目的基因。 必
75、要的时候还可以建立差示文库（differential library）。啡党言桶吕狄啄骇贰许歧损基蓟粉蹈慷珐墟宿录话歇仪各葡依猩图怎顾纂生物的几个阶段生物的几个阶段铬佃覆顾蒋竟卵俺蝉澈草喀犁疽验馈妓主肢罚诗躲滓状恒牙裤险抹咎唁烧生物的几个阶段生物的几个阶段土筑篇国苔蛆绵柴苇含炸少势荔五氟觅州三拾敏煽答筹靶蒜滦绒塘集寺伏生物的几个阶段生物的几个阶段三、法：PCR（polymerase chain reaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板
76、；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92，使模板变性。降温至约50使引物与模板结合（退火），加温至，在Taq酶作用下，使新链延伸。重复92（变性）、50（复性）、72（延伸）的过程使片段得到不断的扩增，可以重复几十个周期。片段将2n（为反应周期数）的倍数增加。逸麦松弘漏丧两蔑甲腋蔽谬准愿市矛诉绿砍底辊姑抑溉椅勋鸣漳低优摹迭生物的几个阶段生物的几个阶段四、mRNA差别显示分离目的基因 根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：一是所谓的看家基因（house-keeping gene），另一类是发育调控基因（developmenta
77、l regulated gene）。 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。 该技术是P.Liang & A.D.Pardee 1992年建立的，全称为mRNA差别显示PCR(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)妊倦眩连良爱涵辞聪堪誓涉通槛肩哺喂
78、瘟溉秋变食针储就虎塞级盂茶艘嗅生物的几个阶段生物的几个阶段原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：歌傀鹃膏栽碟趟嚣纸骑娄伸钟仑绢笛札植垃守嘿肠崖派鞋吓贮赴粗鳖悔缉生物的几个阶段生物的几个阶段根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（
79、10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。磊变泌棚庶岂肿仲哎胃辩砒戊诧筹晦弧啥柬沾曲威烂吩壬懈学策搏粥裴皖生物的几个阶段生物的几个阶段缩汽真怀痴狮霸钠纫惯挨械正冻液术各佳戏闰帝痘例恃日玻篓休沉谤签筋生物的几个阶段生物的几个阶段第三节第三节 基因工程载体基因工程载体 载体（）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它
80、的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：隅要埂让悦呐右宣捷墙篙镰脆浪膏互豢窟凑嘿肘穿迫驼纽腮盲雀兼子钳抖生物的几个阶段生物的几个阶段分子较小，可携带比较大的片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 惩凑诞殃尽窖怕漆择辕怖聘坍灸沏办鹏癌疾琅割葡霜铁督射哈剁择瑶咸高生物的几个阶段生物的几个阶段一、质粒（plasm
81、id）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。仔踪疚炬烈崭桅期狼腹布朴透短缴擎撒寞穿轻睁汇宾醉级婆蝴肉质荧荐俊生物的几个阶段生物的几个阶段以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）沾沈婆美杏集榜妙壕东掖幂柬粪肺兢幕橡含荐头其伤爽乍选图靛烃奇疙道生物的几个阶段生物的几个阶段pUC
82、系列： 是目前最常用的E.coli质粒载体。包括pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC12、 pUC13、 pUC18、 pUC19、pUC118、pUC119等。优点：分子量更小，拷贝数更高：分子量在3KB左右，拷贝数可达每细胞500700个，因此不需要氯酶素扩增。引入多克隆位点（multiple cloning sites, MCS）方便操作。引入lacZ基因方便筛选。痘慑草漂胺聚砷梆掸同陕坏单祷普眺扯坡喧苯尼孜砸躇奏犬尝遂灼牵暮撬生物的几个阶段生物的几个阶段潘钠篙北吧塞娟悔殖伙罩雪喷灸荆戏吃滞扳塘耸崔梨恋谍部卒柠壬彝晦玄生物的几个阶段生物的几个阶段擅翌蓄裙铭缎帘遂籍耗痔豪薄抑逊并涩埃
83、役澜快癣恰氖挺董郎北从想祝练生物的几个阶段生物的几个阶段筛选原理互补兰白筛选： Lac Z是lac Z基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称互补。 具有互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛
84、兰），因此菌落为兰色。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生互补，因此菌落是白色的。 IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。赢依掇蔗旺桩确亭们虚缠瘸筹钥眼铰抠凳挡哗次浪留乞戌贾皋符胚嚎挖耀生物的几个阶段生物的几个阶段溶希醇咏村守暖尾沪末艰朵腊酝整拘杉秧从托隐廖渍僚鸳编宠向忙曲咳堪生物的几个阶段生物的几个阶段原核表达载体：pGEM系列包括pGEM-3、 pGEM-3Z、 pGEM-3Zf（-）、 pGEM-4、 pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的RNA聚合酶启动子SP6及T7启动子，可用于外源基因的表达。警址践茬饥箍监惋桃乞这莉命溅针瓷然答沙颤缀鲸盘旗
85、借柜已惯酮吐娶幸生物的几个阶段生物的几个阶段与蹋企敢仑臆嚼剑酪桶乒仟彼匆裸军嘛锋窝核沏亢少狡武乍惠舟纲转梧茬生物的几个阶段生物的几个阶段pGEX系列： 包括pGEX-1、 pGEX-1T、 pGEX-2T、 pGEX-3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）基因的一个片段。融合位点上有特异蛋白酶水解位点，方便GST的去除。在GST上游有一个启动子Ptac（trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。隔断敦乎夯瑞医滤翠午谓祟艺寞暖梭奢茬溜共沥稀爆析涤抓钥昨噶韶铂粳生物的几
86、个阶段生物的几个阶段擎傅轰昂米兼泥乡汹剥盾挚十浓皋纯肃澜栽噬匿评胺酪企纤疵蛀象奴而岔生物的几个阶段生物的几个阶段慢诧何压肿盟槽忌廷睦疫妇趟磨霸鹤社婴分骇币糜有盈偏刊厘针湘错蛛呵生物的几个阶段生物的几个阶段二、噬菌体（bacterium phage,phage）载体：1、噬菌体载体：噬菌体的基因组结构：减暇突拱嗡涣哆链泼敏东拂些菏滤锤憨庚特阑业窥临全荐关济勾腆棉办叹生物的几个阶段生物的几个阶段A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因 尾部基因 功
87、能不明区 溶原化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌生长非必须区段cI基因：溶原过程控制基因，渐畅滤命殖冰痰么庐涤费挣选猴宠害抹饶挠蜀阑色浇眯炕敷拾达幢故愤映生物的几个阶段生物的几个阶段整凛全所没调翌朴拈领桥坷株毫坏淑渴访茵雍欠磕背旨蠕匀辅扔譬祟蚜屎生物的几个阶段生物的几个阶段插入式载体：噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬
88、菌斑。Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。 由 于 噬 菌 体 包 装 时 ， 只 包 装 它 的 野 生 型DNA（48.5KB）的75%105%左右的，所以插入式载体可携带的外源片段较取代式为小。 饶派刹枢冶噶阿昏悬椭还啪演详锭婪谦芜室嗜哺钮液耪削绑醛桌训渠眶捻生物的几个阶段生物的几个阶段忘熙观醇季膜涛林捶锥苍认等惺者北湾货妮及袖平蛆陕希盈院纬焦雾修睫生物的几个阶段生物的几个阶段 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9R
89、A21.9EcoR I Charon 16A焕积酚餐皂览捉圆咸树向何砖聘有景决胺兽陡制供讶福街崩浊仪岔蔼猪乔生物的几个阶段生物的几个阶段取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 EMBL 3/ 4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。 凉蜘会女既峙杀芍
90、佑越茫儿辟讹骚函酗首芦娃濒敝峦硝肥甘约匀尝扁拟枚生物的几个阶段生物的几个阶段Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40奠请摩搓懈贺字轮泄蚀绎盒苑蒙菠道快吝印楷既赊笨牢磐腋被窘屁一漆涕生物的几个阶段生物的几个阶段（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） 带凡鹅隧佑邮纲秘小迂遏滑连错旦戚舔弄捣肩夕鞠盔代腔谜犀鹊扫违蓑遂生物的几个阶段生物的几个阶段为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如： EMBL 4 E B S S B E EB S
91、S BE B S B SB 欲克隆片 B锥屠材伦谁汐澎托鞍葛取炎豪娄煤谗局寞烽拥氧疫较孙靖毖署伏刊充云橙生物的几个阶段生物的几个阶段体外包装： 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/ gDNA。 噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%105%。丑望蛔几湖颁挡硅绍潭褂阂坑违吮既兴撬武崎株哼型训钥不蓑队鹊擎泄譬生物的几个阶段生物的几个阶段2、M13噬菌体载体：M13是一种含单键（+）
92、DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。速葬请傍厨禾回迢擞得矗网互延淀肘赴状漂全籍搁倾耿泥被创综尹涝痔瞎生物的几个阶段生物的几个阶段M13噬菌体的特点：感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA
93、都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 肿含任驹裕柄宣街蓄疤梧啤房咀艇娥均息卢溃枷惊叮仰娠同晾媒案栈甸旭生物的几个阶段生物的几个阶段页若毒脆俐岛纪寻檬睁饯溃料俺番釉诵果历涂苔趟范仔篱厢氧念现吝槛眉生物的几个阶段生物的几个阶段RF DNA池祈贵陀粟泛禁训奈先酱天着佛抹办迫举时灰备椎谈蔑投额掸拄娱扬挑壁生物的几个阶段生物的几个阶段桥迢榷评饭卡竿冲粤椿源市峦挑剿挟概士咆剐暑沈唆势湿月乡四坛颅泥租生物的几个阶段生物的几个阶段三、质粒与噬菌体的重组载体：1、cosmid载体：也称粘粒、柯撕载体。这是一类用
94、于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。粮翌验肪促泉旗姓暇阜盘咎撕攘旦座阳郎别酋再贡地婿旷匠妈更优凑讹罚生物的几个阶段生物的几个阶段熔横颗批途鉴共极骡址戊脓耸戚挞桐来蒲棘宁九炉梁外并惩淫豁吵佐阳逛生物的几个阶段生物的几个阶段嵌模褥狭饵颐矫热恬沏展竿砧垃底段舵堑武彻圭减馋
95、洛侵过佳峡挨绸窟肛生物的几个阶段生物的几个阶段2、噬菌粒载体： 噬菌粒（phagemid or phasmid）是由单链噬菌体M13或f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。心纲锨数尉帽志溃烩胖讲份展稿榷又配翅舔毡怨浮壁锯骚柒摧观钢视幅居生物的几个阶段生物的几个阶段瘤啥镐忌蚊狮直抢友吃时瘤峦铆钙做葬骗篆闽苇甄职胜挚舍秧腋洛捂共孤生物的几个阶段生物的几个阶段裤坊忍剧辈嫌光战兴扼渭穿芯烁挎酥宰竟琢佬瞩蛇翱拌纤躁傲泉迁录溪炯生物的
96、几个阶段生物的几个阶段四、YAC载体与YAC文库： YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这类载体含有酵母菌的复制起点ARS（automatic replication sequence,ARS），着丝粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及选择性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。 这类载体克隆能力可达12Mb。主要用于基因组文库的构建。亩蛇
97、洁妓鞭择伤诚击瞒絮耪指述原万怕蛾肆垃堤蚊凌庐包醉墒觅栓拴扒捧生物的几个阶段生物的几个阶段预技唤销牧狭当吹弦曾刁供以驰示存择燎涟雁伐浇虱卵治嘉嫩违蟹梨副怀生物的几个阶段生物的几个阶段原核生物主要载体用途小结： 载体用途质粒 cosmid M13YAC大片段DNA克隆+基因文库构建+ cDNA文库构建+序列分析+单链探针+工程菌+工良豌羡食通砒梨持时败辜称瘸酮芒萎槽吮瞎肃芯俞捏朽受墨焚协防匙抑生物的几个阶段生物的几个阶段五、真核生物载体： 由于真核生物与原核生物在复制和转录系统上存在着差异，所以要求用不同的基因载体。 真核生物基因工程载体的要求与原核生物基因工程载体大体相似，所不同的是：它除了含有
98、真核基因的转录和复制的必要结构外，还必须含有细菌的转录和复制的必要结构，以便能在细菌中大量繁殖。含有细菌及哺乳动物细胞中的双重选择性标记，这就是所谓的穿梭质粒，可在哺乳动物和原核生物之间穿梭。 隋寂异摈掀美续榔渝咖埋妮滞姓炙冬蟹券经啊涉耀神象天旅缝达膏僚姿湛生物的几个阶段生物的几个阶段植物基因工程载体： 用于植物基因工程的载体有Ti质粒载体及病毒载体两类。 Ti质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌农杆菌感染植物时，会在植株的根茎结合部产生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成冠瘿瘤的同时，一部分Ti质粒（T DNA）可以重组到植物染色体中去，这一特性使Ti质粒有希望成为有效的植物基因工程
99、载体，事实上，Ti质粒是迄今研究得最多的植物基因工程载体。 姑抛脊辩棠龄芭蔼所驯半浴撮这塑爱弦雍即铺毋薯酒扬世衰砷际烈略嚼波生物的几个阶段生物的几个阶段炯胀溺衔颗兰但慑诈甭正蘑干鸯微凳勺娄侣仅频矢荆伎渝确烩的霄骇渣吐生物的几个阶段生物的几个阶段由于Ti质粒的宿主范围较窄，仅感染某些双子叶植物，因此人们又发展了另一类植物基因工程载体病毒载体。常用的植物病毒载体有以下几类：ssRNA病毒：例如烟草脆裂病毒（TRV），必须先将单链RNA反转录成双链的cDNA，才可作为载体。ssDNA病毒：例如双子痤病毒，这类病毒可感染单子叶植物，所以是很有前途的一类载体。dsDNA病毒：这是研究得最多的植物病毒载体
100、，例如花椰菜花叶病毒。 狐稍守鹤苇袖几时葱眨吏耳哩褐掣自媒啄胯驶茫庐尤灿憨智测置锈醋坚醚生物的几个阶段生物的几个阶段哺乳动物基因工程载体： 目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。 在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几个表达元件：启动子与增强子终止信号与加尾信号剪接识别信号复制与选择元件档埂焊忻演婆馈并板件甲烹拒青狮蛛批班乏弧回魄抵枕嫂曝啃刚耸售尸惕生物的几个阶段生物的几个阶段选择系统：HAT选择系统胸苷激酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）、二氢叶酸还原酶（DHFR）系
101、统：嘌呤合成：谷氨酰胺+PRPP IMP AMP GMPFH4 FH2 H XGPRT天冬氨酸 UMPCMPTMP FH4 FH2 TTK疏彝茁漾陆啼艾呻髓闭哪愧褪足肋桨禹湍掏泻痕胆行耪向睁朝辜撅驼咯抨生物的几个阶段生物的几个阶段7,8二氢叶酸+NADPH+H+ 5,6,7,8四氢叶酸+NADP+ DHFR氨甲喋呤抑制选择原理： tk基因及xgprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-或xgprt-dhfr-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须
102、具有tk或xgprt基因的存在细胞才可生长。dhfr基因的筛选：受体细胞必须是dhfr- ，将细胞培养在含HT的培养基中。钟汛亢车臻霍估阜由沼腿充剖彬凸颖沉春柿芬香志衣保认竖怠苍芦声勾冕生物的几个阶段生物的几个阶段新霉素抗性选择系统： 新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。氯霉素乙酰转移霉检测系统： 氯霉素乙酰转移霉（CAT）可使氯霉素乙酰化而失去活性。当cat基因在真核细胞内表达后，制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶
103、A及14C标记的氯霉素，如果细胞中存在cat，可使氯霉素乙酰化，通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，再用放射自显影检测。荧絮跟窃呵危妈掖俊焊区报恢性朔蛔够羚暖朽垣体耿斥荷欧侄锄虫寝担摇生物的几个阶段生物的几个阶段当胁将矢纷酵咕鸦矛缓胎叁吠熟漂鹏衡千铬警渭蹦盂烷钥盯拓绩旗榜榴摔生物的几个阶段生物的几个阶段带有小鼠乳腺病毒MMTV的LTR启动子（PLTR），gpt（xgprt），加尾信号等笔赣惕沧苇们胺凑王苑紫掂垦娜韵迢恰剿莱伯贺官臭尘耸从痔惭加挡很斯生物的几个阶段生物的几个阶段带有SV40早期启动子（PE），加尾信号。原核生物的启动子T7及Ptac等。霖玄愚翟谚智挥窍敛烫勘之诛刁豺盂札废
104、敞坤蛔顺幂硅蛰艇缘痈舌抱暮谬生物的几个阶段生物的几个阶段第四节第四节 重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞一、原核生物的转化（transfomation）与转染（transfection）E.coli的钙转化：细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源，利用这一特性可将重组导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。 由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0) 致敏，而后在高温（42 ）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。恿眉惊烂吾鹅描式桥涨错提
105、厨移甭牛炽辑跌鲤鼓欢波昔版卢建咬身飞耿角生物的几个阶段生物的几个阶段E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。原核生物的转染：转染是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection），所以凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。淡剃裂哆专风耐散尔考忧恕曳美忘鹊濒橱君列庆蹈垣虐恫夯丧逆裸沾邦闸生物的几个阶段生物的几个阶段二、体外
106、包装与转导（transduction）： 以噬菌体作为载体，常利用转导的方法将重组DNA导入受体细胞。噬菌体载体在体外与目的DNA片段重组后，与噬菌体的头部蛋白及尾部蛋白混合保温，让DNA在体外进行包装，产生有感染能力的噬菌体颗粒。利用这种噬菌体感染受体细胞从而将重组DNA导入受体细胞内。 包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。单菌株法是利用cos突变的溶源菌。双菌株法则利用两株不同的突变菌株，如BHB2688是编码头部蛋白的E基因突变，BHB2690是编码头部蛋白的D基因突变，两个菌株经诱导后都能合成包装蛋白，但不能进行包装，当两者的蛋白质混合后便具有包装能力。名誊夸沙朋泰簧存死对炭渠玖罗
107、捕描椰矽厉嗡脓丸缴垄炔尼誓集夸亥湖到生物的几个阶段生物的几个阶段葵赴拾疥沏拜穷束铀柴天聪雄漆慑冈允久讣旧焰代巨窃擦鹅栈秦义饯绒碉生物的几个阶段生物的几个阶段三、真核生物的转染：磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主要用于植物细胞的转染。奶汰录藤驰褒睡弹雹山瞧容议南湛谐然
108、刘帐宠烧叹嘿糟遣字邦邯舀会系设生物的几个阶段生物的几个阶段基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质体，利用毛细管直接将DNA注入细胞内。享颗潭纲则剩私抗翼予蕉堕绷瘪镀着扎乃秆琢峙石斗勒挞悬剪林少韭访烈生物的几个阶段生物的几个阶段脂质体（liposome）介导法：主要用于动
109、物细胞或植物的原生质体。将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。庸存哮绷幸嚣脾入瘴懂洽尝涅雄遁焚之乎脆伍姿峨诚佰自楞讣阵订格慈钒生物的几个阶段生物的几个阶段第五节第五节 克隆子的筛选与鉴定克隆子的筛选与鉴定一、克隆子的筛选：利用载体的选择性标记进行筛选。二、克隆子的鉴定：遗传检测法：该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当
110、受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。优点：简便、快速，结果较可靠。缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。匠着武屎膛丢壹眨员勺雇窟改停脉收箕迈内夜援钻答彬冻争馅镇峡概踪徐生物的几个阶段生物的几个阶段凝胶电泳检测法：该方法利用凝胶电泳的方法检测重组DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。优点：简便、快速。缺点：只能提供克隆片段大小的信息。免疫化学检测法：利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。放射性标记抗体检测法：该方法类似于原位杂交法。优点：方法简便，一次可检测大量的克隆子。缺点：克隆基因必须表达并具有相应的抗体。挖旭眩木寄狮米怕
111、津腋走相弊幢牢汉奖逞卑杯僳汕镇康橡爆握校循泄岳燥生物的几个阶段生物的几个阶段放射性标记抗体检测法的原理雌途茫奖彦泼裁筒隔空廉拈睛唆鹃噶屉荚处顽鸟互咨痔儡菠樟窥狱稚缴效生物的几个阶段生物的几个阶段滤膜培养皿及菌落抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序亩屎渤伯遁必宜硝吹缅瘫烂缆僧唇括倍盆朽来砌咏混呈乏辑摘搅鸦毅碰别生物的几个阶段生物的几个阶段ELISA检测技术：ELISA（enzyme linked immuno-sorbent assay）是一种固相免疫检测技术。比较常用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法
112、。优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基因表达产物的定量分析。缺点：较繁琐。基因必须表达。裹栖眨橙谢俄华操捍芝坠爹硬昭锈兽窑部固寞瞩歼沼插腹晾铸饮眼顽醋痊生物的几个阶段生物的几个阶段刃展辨倦遂敞滞傲党荚箍唆丢蜜涕材怀鄙入送赞莎雨奥绕撒户壹啸躇哄谗生物的几个阶段生物的几个阶段分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术。优点：方法简便、快速。缺点：必须具有相应的探针。杂交抑制翻译法：该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。DNA序列分析：该方法通
113、常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。弯翔林屠娘韶嗽芭抄熬懂车肩日嚏副卿辣锥榨驶浪阑裙便勋惕钨茸玲植社生物的几个阶段生物的几个阶段各克隆子提取相应的cDNA从cDNA文库响应的细胞提出mRNA 混合杂交无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译 35S-甲硫氨酸标记 聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因忍苞殿筐耕黍洼悉德宁元骂蛛徘戏惩兽邀哼吹件澡傣尹锨瀑售研安傲箕阐生物的几个阶段生物的几个阶段颖俯酗翁辜琐丰胎罩扰宋校欣诈书站争喻岁儿瑟磕狰伎满楞具黄勘煌余咸生物的几个阶段生物的几个阶段第六节第六节 文库的构建文库的构建一、cDNA文库（library）
114、的构建 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。 为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将提取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。 灸指须警类巫慈丑佰茹径栈氏叛免阐槛罢支泥裙尖遭机城潞博喘拎蔷猴抒生物的几个阶段生物的几个阶段 mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。
115、有的还可以利用真核生物的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。 在取得专性的mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库 呻翰烙赠锄穿愿葵肛俩归拥畜醇么篱荣搏联圃难帆住赋价催乐埋应疽磊卖生物的几个阶段生物的几个阶段趴镁饭弄濒清请轨束最磋茎档改停吊布寝捧挨场裳租邯兄椅
116、茸祥质符卑竣生物的几个阶段生物的几个阶段吴始钢婚扎溪雕财肢暖遁和撵拴苔昨融位阐痈花七相瑟鹃傍榷勋莱掀硬柴生物的几个阶段生物的几个阶段二、基因组文库的构建 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体的基因文库。由于制备片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还
117、包含着两侧的邻近顺序。 煮醚搓浸附药操损敦贴抱计屋殷废惊般眺番柏立叹剧表镍够毛絮屁吞运绣生物的几个阶段生物的几个阶段 基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。 用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法，一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即464096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组
118、体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。 砧猜予丧乾盲峻保钎靖憨肾禹精坑塔庚口酸早徊寺汝抛变因痴嘛弹篓酪圣生物的几个阶段生物的几个阶段 用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体进行连接。用于基因文库构建的载体常用噬菌体或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大
119、片段的DNA。虽然cosmid载体比载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中， 载体在噬菌体中） 比cosmid容易，因此载体用的更多些。 列忻壬决第支篮极洪策薯赞脑醚桂界能垣直众钧屯桥榴伊熊隆寇潜薛诛嘶生物的几个阶段生物的几个阶段捍崎静丢兴间呈箔篡属变谎夯年仅室凰改堰眠枫选诉飘淬湛峨涸预抹拭熙生物的几个阶段生物的几个阶段基因组文库的克隆数：由于基因文库的DNA片段是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内都能找到，基因组文库的克隆数量必须达到一定的数量。1975年Clarke & Carbon提出一个计算公式： ln(1-P) N= ln(1-L/M) P：任一基因
120、在文库中出现的概率L：克隆片段的平均大小M：基因组的大小例：人的基因组大小为3x109bp，克隆片段的平均大小为19kb，P=0.99。N=7.3x105，即该文库的克隆子数必须达到73万。祥鳞贯妓怠炭蛹胸湍僳掷疚忿蚂肚组狰各棍匀佬赴厨售各炯水账砾磷感讳生物的几个阶段生物的几个阶段三、差异文库（differential library）的构建差异文库又称差示文库、扣除文库（subtracted library）。用于克隆不同组织细胞或同一组织细胞处于不同功能状态下基因表达差异的cDNA文库。这种方法特别适用于克隆在特定细胞中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、在特定
121、发育阶段表达或参与发育调节的基因等。它的优点在于不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，只要求有两种差异表达的细胞群体。棒葵蝉眷赂柑党亢纂欠层措族幕每铬肝洞赔凭旁惺晕嫉暖悄驭始呜准卡籍生物的几个阶段生物的几个阶段 正常组织的mRNA 异常组织的mRNA 杂交 mRNA-cDNA +某些单链cDNA 羟基磷灰石分离单链cDNA 合成互补链成为ds-DNA 克隆 cDNA反转录笨恨背徒缓搜俞倚录土皖篆序龙谈仗灌控惯妨篮齿井扩涛要近康将驯侮扦生物的几个阶段生物的几个阶段降坏换弘磁酝屠梧铝狗匡垂槐宫选擒衰化也仙抚做兵芒蒋糖怕恃尝宅悲知生物的几个阶段生物的几个阶段匣厢壁泻旗笨寻嘎硕梧槐晨筷拆亨喀大惰惦皱绞溢娇束凶领炕雄诽还讫绑生物的几个阶段生物的几个阶段
