《HPLC培训教程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC培训教程（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、HPLCHPLC培训教程培训教程一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?历史概述和定义液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家 Mikhail S. 茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物树叶色素。一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?混合物最有效的分离、分析方法。u色谱法是一种分离技术。u 混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。u 一相固定不动，称为固定相。u 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。u 如果是气体称之为气相色谱，那液体就是液相色谱。一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?液相
2、色谱的形式薄层色谱法 纸层析法 柱色谱法 一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?什么是高效液相色谱法HPLC?缩写 HPLC, 高压 (high-pressure) 早期的泵只能承受 500 psi 35bar。这就被称为高压液相色谱法HPLC随着这一期间不断的性能改进更小颗粒，更高压力, 字母缩写保持一样，但全称变为高效 (high-performance) 液相色谱HPLC。高效液相色谱HPLC是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。缩写LC是指Liquid Chromatography 一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?HPLC的特点的特点
3、（一）（一） 项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法色谱柱：柱长色谱柱：柱长/cm/cm 柱内径柱内径/mm/mm101025252 21010101020020010105050固定相粒径固定相粒径/m/m5 550507575600600色谱柱柱效色谱柱柱效（理论塔板数）（理论塔板数）2102103 35105104 42 25050柱压降柱压降/MP/MPa a5 515150.0010.0010.30.3进样量进样量/g/g1010-6-61010-2-20.10.11010分析时间分析时间/h/h0.050.051.01.01 12020一、什么是液相色谱
4、一、什么是液相色谱?HPLC的特点（二）项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法进样方式进样方式样品制成溶液样品制成溶液样品需气化或裂解样品需气化或裂解流动相流动相溶液溶液惰性气体惰性气体分离原理分离原理吸附、分配、筛析、亲和等吸附、分配、筛析、亲和等吸附和分配吸附和分配检测器检测器UVUV、PDAPDA、RIDRID等等TCDTCD、FIDFID、ECDECD等等应用范围应用范围低、中、高沸点有机化合物低、中、高沸点有机化合物离子型无机化合物离子型无机化合物热不稳定化合物热不稳定化合物生物活性分子生物活性分子低沸点有机化合物低沸点有机化合物永久性气体永久性气体二、二、二、二
5、、HPLCHPLC的应用的应用的应用的应用n n在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用n n食品中的天然成分食品中的天然成分食品中的天然成分食品中的天然成分n n碳水化合物碳水化合物碳水化合物碳水化合物n n类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇n n脂肪酸和有机酸脂肪酸和有机酸脂肪酸和有机酸脂肪酸和有机酸n n蛋白、肽、氨基酸蛋白、肽、氨基酸蛋白、肽、氨基酸蛋白、肽、氨基酸n n食品添加剂食品添加剂食品添加剂食品添加剂n n酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂酸味剂、甜
6、味剂、香精、乳化剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂n n抗氧化剂、防腐剂抗氧化剂、防腐剂抗氧化剂、防腐剂抗氧化剂、防腐剂n n颜料和染料（色素颜料和染料（色素颜料和染料（色素颜料和染料（色素n n维生素维生素维生素维生素n n污染物污染物污染物污染物n n霉菌（黄曲霉毒素霉菌（黄曲霉毒素霉菌（黄曲霉毒素霉菌（黄曲霉毒素n n农药和兽药残留农药和兽药残留农药和兽药残留农药和兽药残留n n多环芳烃（多环芳烃（多环芳烃（多环芳烃（PAHSPAHSPAHSPAHS和亚硝酸和亚硝酸和亚硝酸和亚硝酸二、二、二、二、HPLCHPLC的应用的应用的应用的应用n n在医药研究中分析应用在
7、医药研究中分析应用在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用 n n常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。药、磺胺类消炎药等。药、磺胺类消炎药等。药、磺胺类消炎药等。n n甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素
8、和孕激素等。和孕激素等。和孕激素等。和孕激素等。n n抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。环素、氯霉素、诺氟沙星等。环素、氯霉素、诺氟沙星等。环素、氯霉素、诺氟沙星等。n n中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类( (皂甙、强心甙、黄酮甙等皂甙、强心甙、黄酮甙等皂甙、强心甙、黄酮甙等皂甙、强心甙
9、、黄酮甙等) )、萜类萜类萜类萜类n n手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分( (如解毒剂如解毒剂如解毒剂如解毒剂D-D-青霉胺毒青霉胺毒青霉胺毒青霉胺毒性小，性小，性小，性小，L-L-异构体毒性很强异构体毒性很强异构体毒性很强异构体毒性很强) )n n医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。二、二、二、二、HPL
10、CHPLC的应用的应用的应用的应用n n在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用n n氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究n n核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究n n生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) ) n n在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用在精
11、细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用n n醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析n n酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析n n表面活性剂的分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析n n聚合物的分析研究聚合物的分析研究聚合物的分析研究聚合物的分析研究n n药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品n n在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用n n饮用水、酸雨、土壤中阴
12、离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析二、二、二、二、HPLCHPLC的应用的应用的应用的应用n n在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要n n毒品分析等毒品分析等毒品分析等毒品分析等n n在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用n n废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和
13、胺废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测类的检测类的检测类的检测 n n*n n 2004200420042004年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到年获悉，世界上化合物总数达到4700470047004700万，其中绝大部分是有机化万，其中绝大部分是有机化万，其中绝大部分是有机化万，其中绝大部分是有机化合物，而大约有合物，而大约有合物，而大约有合物，而大约有70707070以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对以上是不挥发的。对HPLCHPLCHPLCHPLC来说，只要被分析物质来说，只要被分析物质来说
14、，只要被分析物质来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLCHPLCHPLCHPLC在各行各业有着广泛的应用潜力。在各行各业有着广泛的应用潜力。在各行各业有着广泛的应用潜力。在各行各业有着广泛的应用潜力。三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 高效液相色谱系统的各组成部分。 储液瓶 、高压泵 、进样器、色谱柱、检测器 、数据记录系统 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作?
15、高效液相色谱系统的各组成部分。 储液瓶 、高压泵 、进样器、色谱柱、检测器 、数据记录系统 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 高效液相色谱操作高效液相色谱操作一个简单的方法来理解如何获得样品中化合物的分离，如下图所示 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 什么是检测器什么是检测器?当分开的染料谱带离开色谱柱后，它们马上进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下看检测到每个分开的化合物谱带的流通池如图 H。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 几个常见检测器的类型几个常见检测器的类型紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器 示差检测器光电二极管阵列检测器
16、质谱仪MS三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? a.紫外检测器紫外检测器(UV) 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线性范围宽； 流通池可做得很小(1mm 10mm ，容积 8L)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(PDA) 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，不但能得到分析全过程的色谱图，同时还能得到所有组分的光谱图（3D谱图）。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? c
17、. 示差折光检测器示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数 差值。差值与浓度成正比。 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。 灵敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱，不适合做衡量分析。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? d.质谱检测器（质谱检测器（MS） 1.样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。2.具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。什么是色谱图什么是色谱图?色谱图表示发生在高效液相色谱系统中的化学色谱分离。一系列
18、从基线出现的峰以时间为坐标。每个峰代表对不同化合物的检测器反应。色谱图由计算机数据站描绘。如图 H. 色谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 四、定性和定量化合物四、定性和定量化合物 定性和定量化合物 每一个洗脱物在一个特定的位置，时间段计算从进样零时到峰最高点洗脱出来为止。比较每个峰的保留时间tR和注入同一色谱系统的标准物质相同流动相和固定相的保留时间，色谱工作者就可能鉴定每一个化合物。检测器基本上反映化合物谱带通过流通池的浓度。浓度越高，信号越强，峰面积越大。 五、等度和梯度液相系统操作五、等度和梯度液
19、相系统操作等度和梯度液相系统操作等度和梯度液相系统操作高效液相色谱使用两种基本的洗脱模式。第一种称为等度洗脱等度洗脱。在这种模式下，流动相，无论是纯溶剂或混合物，在整个操作过程中保持不变。第二种称为梯度洗脱梯度洗脱，正如名称所指，流动相的组成在分离过程中发生变化。如20%甲醇20分钟变为80%甲醇。这种模式对含有多种不同色谱极性化合物的样品非常有用。随着分离的进行，流动相的洗脱强度逐渐增强以洗脱出更强保留的样品组分。六、高效液相色谱柱硬件六、高效液相色谱柱硬件 色谱柱色谱柱 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成，而且相对于分离系统样品，流动相和固定相来说具有化学惰
20、性。为承受尽可能高的压力，大多数色谱柱由不锈钢制成。分离性能分离性能-分离度分离度两种化合物分离的程度称为色谱分离度RS。 由色谱柱决定的总体分离能力或分离度的两个主要的因素是，机械分离能力：由色谱柱长度，粒径和填料床层的均一性决定；化学分离能力：由填料和流动相对化合物的物化竞争决定。效率是衡量机械分离能力的指标，选择性是化学分离能力的指标。机械分离能力机械分离能力-效率效率如果色谱柱床稳定均一地填充，它的分离能力就由柱长度和颗粒大小决定。机械分离能力，也叫效率，通常以塔板数符号是N来测量和比较。较小颗粒色谱床有较高效率和反压。对于固定的颗粒大小，增加色谱柱长度可获得更强的机械分离能力。然而，
21、代价是色谱运行时间延长，更多溶剂消耗和更高反压。减少色谱柱长度可以减小以上变量但也降低了机械分离能力。六、高效液相色谱柱硬件六、高效液相色谱柱硬件 色谱柱色谱柱色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：常规分析柱（常量柱），内径25mm（常用4.6mm），柱长1030cm；窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径12mm，柱长1020cm；毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.20.5mm；半制备柱，内径5mm；实验室制备柱，内径2040mm，柱长1030cm；生产制备柱内径可达几十厘米。 六、高效液相色谱柱硬件六、
22、高效液相色谱柱硬件 色谱柱的发展方向色谱柱的发展方向1.因强调分析速度而发展出短柱，柱长310cm，填料粒径23m。为提高 分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（microbore）。细管径柱的优点是：节省流动相；灵敏度增加；样品量少；能使用长柱达到高分离度；容易控制柱温；易于实现LC-MS联用。2. 但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1100l/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小
23、，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 总的来说，化合物的三种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。它们是：极性极性电荷电荷分子大小分子大小七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离 结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据它结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据它含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式，不同分子含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式，不同分子的相对色谱保留时间大都由这些官能团的本性和位置决定。基于的相对色谱保留时间大都由这些官
24、能团的本性和位置决定。基于极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相互排斥。极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相互排斥。 设计一套色谱分离系统设计一套色谱分离系统如图如图Q，我们通过选择流动相和固，我们通过选择流动相和固定相制造样品中各种化合物的竞争。这样，样品中和固定相定相制造样品中各种化合物的竞争。这样，样品中和固定相柱柱填料填料极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地被颗粒吸引。极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地被颗粒吸引。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。 基于基于极性的分离极性的分离 极性分子非
25、极性分子这样，基于流动相和固定相对极性分子非极性分子这样，基于流动相和固定相对不同化合物的相对吸引力不同而产生了分离。不同化合物的相对吸引力不同而产生了分离。图 Q: 适当流动相和固定相的组合影响基于极性的分离七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离常用流动相极性：常用流动相极性：石油醚汽油庚烷己烷二硫化碳二甲苯甲苯氯丙烷苯溴乙烷溴化苯二氯乙烷三氯甲烷异丙醚硝基甲烷乙酸丁酯乙醚乙酸乙酯正戊烷正丁醇苯酚甲乙醇叔丁醇四氢呋喃二氧六环丙酮乙醇甲醇乙腈甲酰胺水固定相颗粒色谱极性：固定相颗粒色谱极性：C18 C8 CN Silica官能团极性大小官能团极性大小(样品
26、）样品） 烷烃（烷烃（CH3，CH2）烯烃（）烯烃（CH=CH）醚类（）醚类（OCH3，OCH2）硝基化合物）硝基化合物(NO2)二甲胺（二甲胺（CH3NCH3）脂类（脂类（COOR）酮类（）酮类（CO）醛类（）醛类（CHO）硫醇（）硫醇（SH）胺类（）胺类（NH2）酰胺（）酰胺（NHCOCH3）醇类（）醇类（OH）酚类（酚类（ArOH）羧酸类（）羧酸类（COOH）七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离 考虑到流动相和固定相的极性，对于某一固定相，必须选择一个流动相，使得感兴趣的分析物可以结合在色谱柱上，但不能太强而洗脱不下来。在具有类似极性强度的溶剂中
27、，考虑固定相和流动相的配合，可以区分分析物极性和溶解性的更微弱的差别，使色谱系统的选择性最大化。总而言之，色谱学家会选择最佳的具有合适相反相极性的流动相和固定相的组合。之后，当样品流过色谱柱的时候，同性相吸的原则将决定哪一种分析物流速放缓（出峰慢），哪一种流速更快（出峰快）。 七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离正相高效液相色谱正相高效液相色谱图 S -1 代表三个染料混合物的正相色谱分离。极性的固定相极性的固定相最强地保留了极性的黄色染料。相对非极性的蓝色染料在非极性溶剂的流非极性溶剂的流动相动相保留竞争中胜出，很快被洗脱出来。由于蓝色染料最像流动相
28、两者都是非极性，它流动得更快。对硅胶柱正相色谱来说，典型的情况流动相是100% 极性较小的有机相，不含水。样品是极性小的先出峰样品是极性小的先出峰图 S -1: 正相色谱法七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离反相高效液相色谱（最常用）反相高效液相色谱（最常用）反相是指与正相恰好相反的色谱模式，即使用极性流动相极性流动相和非非极性极性疏水性如疏水性如C18固定相固定相。图 S-2 描述了三种染料的黑色混合物被该种方法分离的过程。样品是极性大的先出峰样品是极性大的先出峰图 S -1: 反相色谱法七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于电荷的分
29、离基于电荷的分离: 离子交换色谱离子交换色谱IEC离子交换分离的固定相以表面酸碱性强弱和吸附保留的离子类型来划分。阳离子交换是用负电荷表面来保留和分离带正电荷的离子。反之亦然，阴离子交换是用正电荷表面来保留和分离带负电荷的离子。离子抑制色谱法：离子抑制色谱法：通常改变流动相的通常改变流动相的pH值被中和，使其失去吸附力而被洗值被中和，使其失去吸附力而被洗脱脱 。使用条件应在填料基质的范围内，使用条件应在填料基质的范围内，硅胶柱的硅胶柱的pHpH在在2-82-8（较（较保险值保险值3-73-7）内。）内。七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于尺寸大小的分离：基于尺寸大小的分离：排
30、阻色谱SEC - 凝胶渗透色谱GPC十九世纪五十年代，Porath 和 Flodin发现生物分子可以通过过滤或流经孔径可控的亲水右旋糖苷聚合物时按照大小被分开，而不是基于电荷数或极性。这个过程被称为凝胶过滤。后来，一种类似的装置，使用特定孔径范围的有机聚合物填料可分离合成寡聚物和多聚物。这个过程成为凝胶渗透色谱GPC。使用孔径可控的硅胶填料操作类似的分离过程被称作排阻色谱SEC。八、液相色谱分析方法的建立八、液相色谱分析方法的建立1 . 色谱柱的选择：色谱柱的选择：疏水性的样品疏水性的样品反相键合色谱；反相键合色谱；亲水性的样品亲水性的样品正相键合色谱；正相键合色谱；生物大分子生物大分子 体积
31、排阻色谱；体积排阻色谱；无机离子化合物无机离子化合物离子对色谱；离子对色谱；高分子聚合高分子聚合 凝胶色谱；凝胶色谱；同系物的分离同系物的分离吸附、分配和键合色谱；吸附、分配和键合色谱；同分异构体同分异构体 双键或取代基异构用吸附色谱；双键或取代基异构用吸附色谱； 多环芳烃异构选用反相键合；多环芳烃异构选用反相键合；对映异构体对映异构体 流动相加入手性选择剂或具有光流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。学活性的固定相。八、液相色谱分析方法的建立八、液相色谱分析方法的建立2.流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择：根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流
32、动根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。相。为达到较好的分离效果，确定流动相配比。为达到较好的分离效果，确定流动相配比。流动相的总流量增加，通常柱效增加。流动相的总流量增加，通常柱效增加。梯度洗脱梯度洗脱-在洗脱过程中连续或间断的改变流动相在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的缓冲溶液及调节流动
33、相的Ph值来改善峰型。值来改善峰型。九、样品分析方法介绍九、样品分析方法介绍1 流动相的准备流动相的准备 流动相的流动相的选择选择-有机相（色谱级甲醇、有机相（色谱级甲醇、色谱级乙腈）与水（超纯水、缓冲溶液）色谱级乙腈）与水（超纯水、缓冲溶液）流动相的流动相的过滤过滤-用孔径为用孔径为0.45m滤滤膜过滤除去固体颗粒杂质。膜过滤除去固体颗粒杂质。流动相的流动相的脱气脱气-超声脱气、吹氦脱气、超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。法。2 样品的准备样品的准备称量称量、用流动相超声、用流动相超声溶解溶解、过滤过滤。九、样品分析方法介绍九
34、、样品分析方法介绍3 分析方法的设定（参考相关文献）分析方法的设定（参考相关文献）流动相的配比及流量流动相的配比及流量-选择何种有机相，纯水或缓冲选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。紫外检测波长的确定紫外检测波长的确定-通过测定被分析样品的通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。最大吸收波长（紫外吸收检测器）。是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如20 80)及终及终点配比点配比(如如80 20)。九、样品分析方法介绍九、样品分析方法介绍4 样品的分析样品的分析选定分析条件，走基
35、线；选定分析条件，走基线；待基线平稳后，发出进样指令；待基线平稳后，发出进样指令；用进样针吸取已过滤好的定量样品；用进样针吸取已过滤好的定量样品；进样分析，获得色谱图及分析结果；进样分析，获得色谱图及分析结果；如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。十、柱的使用和维护注意事项十、柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。色谱柱。1.避免
36、压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。全部是水，反之亦然。3.一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指
37、明该柱可以反冲时，才可以反冲一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。4.选择使用适宜的流动相（尤其是选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶入分析柱之前预先被硅胶“饱和饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。十、柱的使用和维护注意事项十、柱
38、的使用和维护注意事项5.避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。6.经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐
39、过渡，每种流动相的体积应是柱体积的体积的20倍左右，即常规分析需要倍左右，即常规分析需要5075ml。 下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲
40、烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（和三氟醋酸（0.
41、1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。）梯度洗脱能除去蛋白质污染。 十、柱的使用和维护注意事项十、柱的使用和维护注意事项7.保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。8.色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱
42、内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。到改善，但是很难恢复到新柱的水平
43、。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。柱效，这是值得的。十一、与检测器有关的故障或排除十一、与检测器有关的故障或排除1. 流动池内有气泡流动池内有气泡 如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状在基线上出现许多线状“峰峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动
44、相进行充，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池
45、破裂。流动池破裂。2. 流动池被污染流动池被污染 无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。十一、与检测器有关的故障或排除十一、与检测器有关的故障或排除3. 光源灯出现故障光源灯出现故障 紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严紫外或荧光
46、检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。换光源灯。4. 倒峰倒峰 倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫
47、外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。不同所引起的。 十二、流动相使用注意事项十二、流动相使用注意事项1. 流动相的性质流动相的性质 一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。得到纯品和低毒性等特征。 流动相应不改变
48、填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。系统。 纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。所以流动相一定要选用柱上积累时。所以流动相一定要选用色谱级，水要选用
49、超纯水（娃哈哈纯净水）色谱级，水要选用超纯水（娃哈哈纯净水）。必须与检测器匹配。使用必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在收，或吸收很小。与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外紫外185205nm处检测的要求处检测的要求 。粘度要低（应粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在
50、100以下的流动相。以下的流动相。对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。了纯化分离，且会使柱子恶化。十二、流动相使用注意事项十二、流动相使用注意事项2. 流动相的流动相的PH 采用反相色谱法分离弱酸（采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7）或弱碱（）或弱碱（7pKa8）样品时，通过）样品时，通过调节流动相的调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的并
51、改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，值越小，组分的组分的k值越大，当值越大，当pH值远远小于弱酸的值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。三乙胺溶液。注：流动相
52、中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。尾剂。十二、流动相使用注意事项十二、流动相使用注意事项3. 流动相的脱气流动相的脱气 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基
53、线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。的变化，对分离或分析结果带来误差。 常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。 超声脱气比较好，1020分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声2030min方可），
54、此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。 十二、流动相使用注意事项十二、流动相使用注意事项4. 流动相的过滤流动相的过滤 所有溶剂使用前都必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。 用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过
55、，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。十二、流动相使用注意事项十二、流动相使用注意事项5. 流动相的储存流动相的储存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。 贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉
56、淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。十三、六通伐使用注意事项十三、六通伐使用注意事项 六通阀的进样方式：六通阀的进样方式： 有部分装液法和完全装液法两种。用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的510倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项：六通阀使用和维护注意事项： 样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。 谢谢 谢谢 大大 家！家！结束结束
