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1、在蛋白质功能及结构研究过程中， 研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白别离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质， 具有识别某种特定物质并与该物质分子特异
2、性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质， 特别是重组蛋白的别离纯化中。 在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析， 直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点， 为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。自从 20 世纪 70 年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具， 具有结合特异
3、性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。 通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。根据自身分子量大小的不同， 亲和标签可以分为两大类： 一类是结合固定化配基的短肽标签， 如 His-tag 、FLAG-tag、Strep-tag 等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST 、MBP 等。短肽标签：His-tag ：His 标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His 标签一般为 515 个
4、组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：1位于目标蛋白端的His 标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；2His 标签几乎精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 10 页不影响目标蛋白的理化性质； 3His 标签很小， 不会改变目标蛋白的可溶性；4His 标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎没有影响；5采用固定化金属离子亲和层析纯化His 标签融合蛋白时， 其操作非常简便。 基于上述优点， 几乎所有的大型结构基因组研究中心都把纯化His 标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析 immobilized met
5、al-ion affinity chromatography，IMAC 作为主要的蛋白纯化方法。然而，并不是所有的蛋白质都可以与His 标签融合后， 采用固定化金属离子亲和层析别离纯化。 宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合；目标蛋白含有金属离子，一般也不采用His 标签与固定化金属离子亲和层析。FLAG-tag：除了 His 标签外，另一个广泛使用的小分子短肽标签是FLAG标签。FLAG 标签是由 8 个氨基酸DYKDDDDK组成的一个短肽， 分子量很小， 因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白
6、的功能、 分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的外表，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点 DDDK ， 可以利用肠激酶切除标签。 FLAG标签有 3 个特异性的单克隆抗体，分别为M1单抗、 M2单抗、 M5单抗。 FLAG短肽合成成本较高， 不适用于大规模纯化， 且需要额外步骤除去结合在层析介质上的短肽。Strep-tag ：与 His-tag 、FLAG-tag 相似，Strep-tag 也是一个小分子的短肽标签，广泛用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表达与纯化中。在自然界中，链霉亲和素streptavidin与生物素 biotin之间存
7、在着非常强烈的非共价相互作用，其生物学上的解离常数极低； 即使生物素与其他蛋白质共价结合之后， 两者仍可以相互作用。 基于这两者之间的强烈相互作用，运用一系列蛋白质工程手段，通过对短肽文库的筛选， 第一个链霉亲和素结合肽应运而生，即Strep-tag ，极大地方便了重组蛋白的一步快速亲和纯化。然而，Strep-tag与链霉亲和素结合时需要一个自由的羧基末端，因而该标签只能位于目标蛋白的C端，限制了它的应用范围。 在 Strep-tag的基础上， 通过对合成短肽的筛选，获得了一个与其相似、由个氨基酸WSHPQFEK组成的链霉亲和素结合肽，即Strep-tag ，可以位于融合蛋白的任意位置，从而弥
8、补了精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 10 页Strep-tag的不足。同时，通过对链霉亲和素特定氨基酸的定向突变，获得了与Strep-tag 具有更高亲和力的亲和介质Strep-tactin，在 Strep-tag 融合蛋白的亲和纯化中表现出良好的纯化效果，且蛋白质产量较高，所需成本适中。Strep-tag 系统的纯化条件比较宽泛， 在普通缓冲液下就可与strep-Tactin融合蛋白洗脱下来， 螯合剂、去污剂、复原剂 及高达 1mol/L 的盐均可加入到缓冲液中。此外，Strep-tag 在纯化过程中不依赖金属离子，十
9、分适合含金属离子蛋白质的纯化。蛋白标签：GST ：GST标签由 211 个氨基酸组成， 大小约为 26kDa ，是目前广泛用于重组蛋白融合表达与亲和纯化的一种蛋白标签。大量的表达实验发现， 外源蛋白在大肠杆菌表达系统中过量表达时， 常会以包涵体的形式形成不溶性的聚合体，大大降低了可溶性重组蛋白的产量， 增加了后续蛋白别离纯化的难度。然而，在融合 GST标签进行原核表达的过程中发现，原本用于亲和纯化的GST标签能在一定程度上增大融合蛋白的可溶性， 使融合蛋白以可溶形式存在于细胞质中，不仅促进了目标蛋白的正确折叠， 提高了蛋白产量， 而且有助于后续的蛋白纯化。 除了增大融合蛋白的可溶性之外， GS
10、T 标签还具有高效的翻译起始、纯化条件温和、亲和树脂成本相对低廉等显著优点， 成为重组蛋白融合表达经常使用的亲和标签。MBP ：MBP 标签由大肠杆菌 K12的 malE基因编码的 396 个氨基酸组成，大小约为40kDa，是除了 GST标签之外又一个很好的增大融合蛋白可溶性的蛋白标签。MBP标签能够增大在原核表达系统中过量表达的融合蛋白的可溶性， 提高其表达量，已在多个表达实验中得到确认。研究发现，当改变MBP “开放”与“关闭”构象之间的平衡时， MBP 增大融合蛋白可溶性的能力将受到明显影响，说明 MBP增大融合蛋白可溶性的特性是由其“开放”构象所介导；同时，对 MBP 配基结合间隙中保
11、守的疏水性氨基酸残基进行定向突变，MBP 表现出相似的表型，说明这个配基结合间隙在 MBP 增大融合蛋白可溶性的机制中具有一定的作用。然而，从蛋白纯化的角度来看，MBP 标签并不是一个最有效的亲和标签；在某些情况下，MBP 标签并不能特异性地与亲和树脂有效结合，亲和层析后融合蛋白的纯度也并不合适。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 10 页自从上世纪 70 年代中期亲和标签融合技术出现以来，多种多样的短肽或蛋白亲和标签极大地方便了外源表达重组蛋白的别离与蛋白质复合体的纯化，已成为蛋白质研究领域不可或缺的工具。一般而言，一个完
12、美的亲和标签应该具备以下特性：1能够用于纯化任何表达宿主或表达系统所表达的重组蛋白；2可以位于目标蛋白的任意位置而不影响其结构；3增大目标蛋白的可溶性，促进其正确折叠，提高蛋白表达量；4便于重组蛋白的检测。目前，商品化的亲和标签已具备其中诸多特性，但性能更加优越、纯化效果更加显著的亲和标签仍需不断寻找与开发。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 10 页重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。美国 GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不
13、同新推出3 类， 分别为表达宿主为大肠杆菌， 哺乳动物细胞的， 以及慢病毒载体， 宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。除了必要的复制和筛选的元件， 协助表达和翻译的元件外， 本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：His6：His6 是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C 末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征结合配体利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行别离纯化。使用 His-tag有下面优点：1. 标签的分子量小，只有 0.84KD
14、，而 GST和蛋白 A 分别为 26KD和30KD ，一般不影响目标蛋白的功能；外表活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白， 使复性不受其它蛋白的干扰， 或进行金属螯和亲和层析复性；3.His 标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质 -DNA相互作用研究；4.His 标签免疫原性相对较低， 可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；5. 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；6. 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。Flag: Flag 标签蛋白为编码 8 个氨基酸的亲
15、水性多肽 DYKDDDDK ，同时载体中构建的 Kozak 序列使得带有 FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG 作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.FLAG 作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 10 页影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。2. 融合 FLAG的目的蛋白， 可以直接通过 FLAG 进行亲和层析， 此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。3.FLAG 作为标签蛋白，
16、其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot 、ELISA等方法对含有 FLAG 的融合蛋白进行检测、鉴定。4. 融合在 N端的 FLAG ，其可以被肠激酶切除 DDDK ，从而得到特异的目的蛋白。因此现 FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。MBP: MBP 麦芽糖结合蛋白标签蛋白大小为40kDa ，由大肠杆菌 K12的 malE基因编码。 MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP 可以融合在蛋白的N
17、端或 C端。纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在 0.2% Triton X-100或 0.25% Tween 20 存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为 pH7.0 到 8.5 ，盐浓度可高达 1M ，但不能使用变性剂。如果要去除MBP 融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用 MBP 抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。GST: GST( 谷胱甘肽巯基转移酶 ) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD 。将它应用在原核表达的原
18、因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。 GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 复原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。 GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下 GST融合蛋白精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 10 页是
19、完全或部分可溶的。纯化： 该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有复原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶 (Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。 GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST 在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。如果要去除 GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用 GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。HA HA标签蛋白，标签序列 YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素外表抗原决定簇，9 个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小,
20、 容易构建成标签蛋白融合到 N端或者 C端。易于用 Anti HA抗体检测和 ELISA检测。c-Myc C-Myc标签蛋白，是一个含11 个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu， 这 11 个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag 已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry 分别是增强型绿色荧光蛋白/ 增强型黄绿色荧光蛋白/ 增强型黄绿色荧光蛋白/ 单体红色荧光蛋白 ,
21、 具有不同的激发波长发射波长为， 均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就 eGFP而言，相对于 GFP ，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有 eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 mCherry 是从 DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和 GFP 系列荧光蛋白共用， 实现多色标记体内、外实验说明，mCherry在 N端和 C端融合外源蛋白时， 荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。 这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1. 不用破碎组织细胞和不加任何底物， 直接通过荧光显微镜就能在活
22、细胞中发出绿色荧光， 实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定， 被誉为活细胞探针。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 10 页2. 其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。3. 同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。4. 其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、 蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。5.mCherry 红色荧光蛋白
23、在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP 或 mCherry标记 HIV 病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程用mRFP 标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。荧光素酶来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia 荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法Luciferase Assay 。跟普通融合蛋白标签不同， 使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、 miRNA 3UTR克隆的功能与调
24、控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与 HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速， 容易和高灵敏的监测方法。 而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统， 因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。基于荧光素酶的特性，我司研发提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit 可用于分析双报告系统中Gaussia 荧光素酶 GLuc 和分泌型碱性磷酸酶(SEA
25、P)活性。GLuc 和 SEAP 均为分泌型报告蛋白， 无需裂解细胞即可便捷的从细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。Avi Tag AviTag 标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 10 页点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和 C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化， 为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质别离纯化， 还用于蛋白质相互作用研究。Avi Tag 标签系统具有以
26、下几大优点: 1. 无论在体外或者体内， 几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；2. 生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；AviTag 只有 15 个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。SNAP-Tag SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相 (如SDS-PAGE gels)等。SNAP-Tag是从人的 O6-甲基鸟嘌呤 -DNA甲基转移 O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase获得。无论
27、体内还是体外， SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团如荧光素和假设丹明。SNAP 所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP 所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以 SNAP 标签反应是高特异的。检测：生物素或各种颜色荧光的底物如荧光素、假设丹明可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag 融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融
28、合蛋白。将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与外表固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用， 形成共价键， 融合蛋白间接被固定在了基质外表上，可以到达更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。Halo Tag 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 10 页HaloTag?标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag?配基有效地共价结合。 这个分子量为 33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的 N端或 C 端，并在原核和真核系统中表达。HaloTag?配基是小分子化学物，能够在体外或体内与
29、HaloTag?蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：(1) 一个通用的 HaloTag?反应联结子，结合HaloTag?蛋白； (2) 一个功能基团 , 例如荧光染料或亲和媒介。能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。SUMO SUMO标 签 蛋 白 是 一 种 小 分 子 泛 素 样 修 饰 蛋 白 Small ubiquitin-likemodifier ，是泛素 (ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO 与泛素只有 18% 的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能
30、却十分相似。研究发现SUMO 可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量， 且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。此外 SUMO 还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为 SUMO 蛋白水解酶 我公司可提供 能识别完整的 SUMO 标签蛋白序列，并能高效地把SUMO 从融合蛋白上切割下来。切除SUMO 后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO 标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 10 页
