《小鼠实验方案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠实验方案（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验方案酵母提取物抗氧化能力的测定概述：自由基是指是机体代谢的正常产物，在体内有很强的氧化反应能力，町以在细胞代谢的过程 中不断地产生。人屋的研究结果证明，自由基足衰老的决定因素。在生命活动过程中产生的齐种自由基中轻自由基的作用最强，进攻性也最强，几乎可以和所 有的生物分子、有机物或无机物发生不同类型的化学反应。超氧阴离子不仅自身具有毒性，而且 可以通过其他反应产生更多的氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用。试验拟采用DPPH自由基体系、超氧阴离子(0J自由基体系、包自由基(Ho)体系以及还原力 测定体系评价酵母提取物的抗氧化活性。试验方法1) DPPH自由基清除
2、试验DPPH储备液配制：精密称取19.7 mg DPPH溶解t 25 mL甲醇中，再吸取2.5 mL溶液，以 甲醇补足体积至25 mL，得到200 mM DPPH母液，暗处保存备用药品及对照品储备液配制：酵母提取物采用甲醇溶解，得到终浓度为ImM的母液。再将母液 加甲醇稀释至一定浓度梯度，加3 mL于比色管中(对照组加入3mL甲醇或水)再 加入ImLDPPH 母液，居I烈震荡后，与暗处保存30min，以甲醇做空白，测英517 nm吸光值。以VC作为阳性对 照，各组反应平行测定三次，DPPH自由基淸除率按照下面公式计算：DPPH自由基清除率()上需X 100式中Ao代表对照组的吸光值：Ai代表加
3、药组的吸光值。2) 超氧阴离子(0()自由基清除试验采用NADH-PivlS方法评估酵母提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。试管中依次加 入 ImLNBT (81 m M)溶液,1 mL NADH (468 m M )溶液，1 mL 不同浓度的待测溶液,0.4 mL PMS (88HM) 溶液，充分混匀，静置5 min,在560 nm处测其吸光值。用水代替待测溶液做阴性对照，水代替 PMS做本底组对照，Ve做阳性对照。清除率计算：清除率(%) = I (AA)/A X 100%a b 0式中Aa为样品吸光值，Ab为样品吸光值，A0为阴性对照值。3) 轻自由基(H0 一)清除试验本实验参照文献等
4、提供的方法评估PEP对耗自由基的清除能力。反应液的配制：100 mL的磷 酸盐缓冲液(20 mM pH7.4)T加入EDTA, FeC13和DR (终浓度分别为0.1 mM, 0.1 mM和 2.8mM)测定时，取反应液 1.5 mL依次加入 0.1 mL VC (1 mM )、035 mLH 0 (20 mM)及 1 mLa2 2不同浓度的样品溶液，37 C水浴。20 min后，加入ImLTBA(I%)fn 3 mL TCA(2.8%), 90C 水浴,25 min后，532 nm处测定吸光值。D-M nn iTOI做阳性对照。清除率的计算：a清除率(%) = I-(A-A)/A X 100
5、%a b 0式中Aa为样品吸光值，Ab为样品吸光值，A0为阴性对照值。酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验 四氯化碳是一种强右力的肝毒索，被广泛用于诱导肝脏损伤的实验动物，本身对肝细胞没 冇毒性效应，但其受到肝微粒体酶活化成为ccl3.，以共价形式与蛋口质结介，导致蛋口合成障 碍，脂质分解代谢紊乱，引起肝细胞内甘油三酯蒂枳，同时CCL3能述速与氧气结合 转化为 CCL3OO*,导致脂质过氧化，引起细胞膜变性共至坏死。3 ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发L损伤、坏死或嗖:到破坏时，就会引起術人j 凤酶和谷草转氨酶在血清中浓度会偏嵩.ALT和AST是迄今为止国内外应用最为广泛的反 映肝细
6、胞损害的指标。TC fl| TG是临床血脂分析的朿要指标，当肝细胞受损时二者的含駅将会升 高。丙二酸(MDA)在体内是口然生成的，足氧化应激的标志物,MDA增加的越多町以间 接反映机 体细胞受到自rtl基攻击的程度越人。冷胱甘肽(GSH)是体内觅要的抗氧化剂和自由基清除剂， 貝何解毒和抗氧化能力，对肝脏有甫要的保护作用，为肝细胞或冷机体受到损伤时组织和血液里 的含量就会降低；超氧化物在超氧化物歧化酶(SOD)催化作用下转化为氧(和过氧化氧，能清除 超氧阴离子口由基，可见SoD具有使机体的超氧化物减少的作用，进而达到保护细胞的作用;谷 胱甘肽过氧化物卿(GSH-P)是机体内的一种重要的町以促进
7、过氧化物分解的酶，它町以将体内的X 过氧化物进行分解，从而减轻机体或者组织受自由基或过氧化物带来的损害；在所有的机体内都 存在看酶促反应体系和非酶促反应体系两种反应类型，这两种反应类型当然也涉及到了机体抗氧 化的反应类型。总抗氧化能力(T-AOC)反映了机体酶促反应体系和非穂促反应体系总的抗氧化水 平的指标,半机体或者组织受到伤害时就会使T-AOC的活性水平降低。卅肝脏受到损伤时， GSH、SOD、GSH-PX和T-AoC倉就的都 会不同程度的降低。试验动物：昆明小鼠60只，雄性，体重18-22gC试验试剂：酵母提取物，联苯双醛配制成IOmg/ml的溶液。四氯化碳、花生油。谷丙转氨酶(ALT)
8、,谷 草转氨稍(AsT),总胆固醇(TC),甘油三脂(TG)谷胱廿肽(GSH).谷胱甘肽转移IW(GSH-P ),超氧化x物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),总抗氧化能力(T-AOC)Oalt和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时，会引起谷丙转氨函 和谷草转氨葩在血清中浓度会偏高,和是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损 害的指标。 和是临床血脂分析的觅要指标，当肝细胞受损时二者的含量将会升高。试验方法：1. 试验分组：60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、联苯双酚组和低、高、中酵母提取物量组，每组 10只2. 动物给药：试验前让小鼠自由饮仅和摄水，适应性喂养3天。
9、联苯双酯(BP)组小鼠给药0.5ml(500mg/kg %w):高中低剂量实验组中给药分别为8 mg/kg %w5mg/kg %w2mg/kg %w:空白对照组和 四氯化碳组给予等最的生理盐水，所有组别每天灌胃一次。所有组小鼠连续喂 养21天后，第22 无 書白对照组外其余各组均腹腔注射08%CCl4油溶剂0.3ml,而空白对照组仅注射等量的花生 油。2h后所右动物禁負，水供应充足。48h后对小鼠进行称重麻醉，实行颈椎脱位方式处死。眼 球釆血，剥离小鼠肝脏用生理盐水清洗后称重，讣算肝脏指数(肝脏指数=肝体质量/小鼠体质量)。 离心后的血液样品储存于4冰箱，小片肝脏冷藏在-80。C冰箱，以供进一
10、步分析。试验期间观察 小鼠皮毛、活动性等，解剖期间观察肝脏颜色。 酵母捉取物和柠椽苫素动物模型建立参照上述方法进行。3. 血清和肝匀浆的制备，将离心后的血液分别吸取上清液以供实验分析，分别称取lg肝脏，加入09%的冷藏的NaCI 溶液IOmI,进行匀浆，3000r/min离心IOmin取上清液备用。4. 血清生化指标测定：禾用试剂盒测定小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、MDA、GSHX GSH-P等生化指标。X5. 病理石蜡切片6. 试验数据釆用统计学软件SPSS対实验数据资料进行分析处理，数据用均数土标准差表示， 组间比较用t检验，且p0.05有统计学意义。酵母提取物中脂肪酸、笛醇组分的
11、 GC-MS分析酵母提取物中脂肪酸.笛醇的降血脂作用緇醇酯能够在人体内转化成辎醇和脂肪酸,所以其生理功能包括植物傷醇和脂肪酸两部分所 具右的生理功能，只令与游离植物當醇同等的降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的效果， 在某些方而甚至效果更好。试验试剂：甘油三SS(TG) 总胆固醇(TC).高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C).低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C).丙二 醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶()、超氧化物歧化酶(SOD)O试验动物：昆明小鼠，雄性，体八18-22g试验方法：1 .试验分组： 50只小鼠随机分为空白对照组、高脂模型组和任、中、高剂量酵母油脂提取物组，每组10 只。2 动物给药
12、： 空白对照组：喂食基础饲料(玉米面30%,面粉30%,麦战35%,鱼粉2%,骨粉2%, 食盐1%) 其余四组喂食高脂饲料,即基础饲料77%,猪油15%,胆固醇3%,蛋黄4.5%,脱氧胆酸钠0.5%。持续喂养高脂饲料一周建立高脂模型。一周后从空白对照组和高脂模型组随机分别选出4 只，眼球取血,离心得血清测定其总TC、TG含量。检验高脂模型是否建立。高脂模 型建立后除空 白对照组外其余各组仍然喂仅高脂饲料。根据中国营养学会推荐的每人每天油脂的摄入最是25氐换算为小鼠大概IOmg所以根 据以 上数据对各组进行灌胃试验。每天早上灌胃一次，灌胃剂量为低剂量组()，中剂量组 (),高剂量 组()。空白对
13、照组与高脂模型组均供给自來水。喂养35天，各组小鼠禁食24h,摘眼球采血，分 离血清后，测各项指标。酵母提取物中脂肪酸、笛醇对细胞血脂调节作用研究肝脏是人体介成内源性甘油三酯及胆固醇的主要场所，同时也是脂肪酸进行B 氧化最活 跃的部位，通过促进脂肪酸的分解氧化，释放能最供机体利用。HepG2细胞株虽属于癌细胞， 但其保留了正常肝细胞的糖脂代谢等绝人多数生理功能，是国际公认的可用于降脂功效研究的 细胞。长链脂肪酸能够引起肝细胞脂肪变性，冈此拟采用无脂肪酸的牛血清蛋白BSA代替胎牛 血清，并通过外源添加油酸建立体外HepG2细胞脂质堆积模型，以消除血清中脂 肪酸造成的干 扰。细胞培养(Cell C
14、UItUre)是指从机体内取出某种组织或者细胞，模拟机体内的生理条件， 使英町以在体外生存、生长和繁殖的过程。动物细胞的培养开始丁本世纪初，1962年其规模开 始扩大,发展至今己成为生物、医学的研究及应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生 产具有甫要医用价值的酶、疫苗和单抗等,己经成为了医药生物高技术产业的甫要部分。利用动 物细胞培养的技术生产的生物制| %已经占世界生物高技术产I %市场份额的50%C动物细胞 的人规模培养技术是生物技术制药中菲常重要的环节。培养技术水平的提高主要集中在培养规 模的扩大、优化细胞培养环境、提高产品的产率与保证英质量等方而。细胞培弄町分为原代培养和传代培养
15、两种情况。原代培养(PrimaryCUItUre)是指直接 从机 体中取出组织或细胞后,进行首次培养。传代培养(SUbCUItUre)是指当原代培养的细胞增殖到 一定的密度后,将其从原培养容器中取出,以一定的比例转移到另一个或几个容器中所进行的再 次培养。传代培养可简称传代。在体外培养的过程中,要使细胞能正常地生长以及繁殖,需要经 常对细胞进行传代。传代的累枳的次数也就是细胞的代数。细胞培养是一种程序复杂、条件较多并且要求严於的实验性的工作。由于细胞在体外的生 长、繁殖会受到温度、酸碱度、营养物质及微生物等多种因素的影响,故细胞培养工作的各个环 节如培养器皿清洗消毒、值调整、营养液配制和除菌、
16、温度调节等操作环节都有严格的要求和 规定,无菌操作尤为重要,这也是细胞体外培养的最关键的因素。实验中几种常用的细胞模型U937单核细胞U937是巨噬细胞淋巴瘤细胞系。悬浮生长，生长非常迅速细饱圆形。生长不好会表现为培 养基中的杂质增多，细胞变形等。HepG2细胞HepG2是一种人肝癌细胞株，牵涉面非常广泛，影响因素众多。广泛应用于乙型肝炎病毒感 染机制、病毒培养遗传毒理学试验以及外源性生物性异物的细胞毒性等方面的研究。因为该细胞 容易培养传代，且胆固醇的合成及代谢与止常的肝脏相接近。很多学者把它作为研究的细胞模型 并检测其对胆固醇代谢的影响，进而研究降血脂的样品。CHO细胞CHo细胞是一个转化细胞系，是年从中国地鼠卵巢细胞得到。广泛的采
