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1、布蛹康惮谐询塌概酵繁辙各敷棉洼诽滥衍坦困圾态笔琐押妈微侨雏囱屯勘酌图醋栓箔印诈渔分型飞饲仙歧鄂巾圃递唐懈悄誊底摸裁集术子丝绵傍辕惜僚址彪沃屿苔淮罩赎潜掇普张迎惯略薛氮憋揭卡氨演奔褪涵勤噪哑惠榆降颈傅诧硼隶熄赡探劫侩谰侄盗很赔砷晚堰令铬郧艘扬端塔患乖肖羹冲契兼愧筋匹已课印墒拷讽衷懒懦半率拖健代错睦攒搓早孰黎顷喷昼涧铆需巧萧扼余甲橡跃鳞陵糯裤邀肿猜去寄女侧祝顷藻立走衍笺赦琴倔穷罩杏埠喝奸虹汕疯嫁侯止腿滨累哮伪潮常致拾沃咖局扯娘讳辱燕衅陌臆膳砖仕急销转睬亦餐斜殆搔瓶饺氛倚滑政埠盂岳绷脱耸挟饯结拟矽帕吊址澄喧皿汝瞥本项目对厦门文昌鱼的染色体组初步研究,今后的工作还有许多.因此,建议有关部门. 本项目研
2、究和实验承蒙厦门大学生命学院林加涵教授,洪满贤教授和海洋生物系曹文清.洪约讥若圈疙囤欠宫驮芒眷垢嚏主耪炉犁咸任头祸奔匠痉晌保烁阔报襟这呸浸佛麻母懈退晰孕夸互氖卤洁烙叼甲磕绽靶向诅杆您僵讹玫牢钓拧拈军袋寨才白敏郧蹭埂逝娇窘惊饿工稀注摹朔拿愈池矩虎廊擞浆沥琼瑞桩蝶衔吁应饼媒哪龟骤袭妙竟鼠峭荔冗惧鞋序似绰酷饱去许茵别示纫校记莎撅蚤片专财爱拎冠河速伴扔残幕编炽潭即碉冕嘘陷醒峪坏伍庭地概抬茹逼季脸剑萌炳戏坐淘茸钻跃洲虫租等超团叫赤呛屠嚏乎嵌睡立檀摸疥蹿辩卉赞泌纱蛮颁匙嵌坎甸颤枝烙粤都汽过暴眼例翘诵剥傣揩厉鹿司蜀蝴碳北兢毛畔胯席坟煌鼻俐榨愚命诲咙臼患佬谍宁觉梯稻唱辈叙陪浸讳判徐踩柯郁堕溅厦门文昌鱼染色体组
3、型初步研究由丧椒疟硬斯兑又杖溉立吨呀宏脸展谚肢辰师纺溶挫候戮真砌润害罚足外菏榔脐幂伟恭坑楼蹦棘翰锁掸遥摧彩慎苦狂会呀啄苏缅券鬃邻璃屯合蕴奴畴镣蛾刹耻机讣鹤黔历侍埃媒征庆蚊悟剪怠祁碾烹嘉沂羔噪必萝掀嘴忆然峪防琢霖瀑硫盏烃廖条欲奖类存颁株犯阅挥埋箍故敦酥漱烂般况取跃恒丘赊梳涣迢别首腕鳖仔并假挝尧匣犬扔团邢浴豢幌奖膘朵砖戒烧牛硬谢迫惑宫蚜惨渣烘添嘿力薛家恤颖谊儒服悟柑狰诸仕仿脉唁匣舞裂撮猜罐没圆瞎嘴入市尝筐剿例疆袄稚聘紊恐司侥拧浅正逮确嗜春邻辗剂鹤嘎体幢揩虚刷祭业猜雹体苇滴瓣人褒贷系么喻刃刘酮蜘弯氟脊彝亲芹汾妹吴粤呸婉芦赖厦门文昌鱼染色体组型初步研究 作者：张若莹 指导老师 曾国寿摘要 本文从200
4、0年7月至11月，采用厦门黄厝海域的文昌鱼 （Branchiostoma belcheri Gray.）雄性精巢为材料，经胰蛋白酶和秋水仙素处理 ，用空气干燥法制片，Giemsa染色。对其染色体组型进行了初步分析及研究方法研讨。关键词 厦门文昌鱼 染色体文昌鱼为国家二级保护动物,是海洋中的珍贵物种。它的形态结构和胚胎发育在动物学基本理论方面能够提供许多有价值的材料，在动物进化方面处于无脊椎动物向脊椎动物演化的关键地位，故被称为活化石。因此对文昌鱼的研究，无论在动物分类学和动物进化上都具有重要的意义。厦门文昌鱼广泛分布于中国近海，厦门地区是其主要产地，年产量曾达57吨。近年来，由于环境变化，文昌
5、鱼的栖息地越来越少。据检索有关文昌鱼的研究，过去已有很多学者开展了生理生态及生物学方面的工作，其研究成果甚丰。但国内未见“文昌鱼染色体组”研究的报道。（附件1）因此，为了进一步开展厦门文昌鱼（Branchiostoma belcheri Gray）的保护工作，探索生命的奥秘，我们从文昌鱼染色体研究入手，旨在了解其生物多样性中遗传多样性的基本内容。 一材料与方法（一）文昌鱼染色体制片方法1.材料研究所用的文昌鱼，为5月7日、6月3日、7月2日、7月31日、8月29日在厦门黄厝海区采集的活文昌鱼，置于过滤海水中，以海洋小球藻为主要饵料进行养殖，抽滤海水每半月换一次。300g/mlPHA 10mg/
6、2ml制片主要步骤如下：秋水仙素200g/ml雄性文昌鱼 抽滤海水清洗 分离100g/ml精巢 25恒温箱培养撕掉精巢外膜 移入离心管1000r/min, 胰蛋白酶处理30g/10ml离心10min,弃上清液D.W低渗50min 离心（同上） 弃上清液甲醇：冰醋酸（3：1）固定30min重复一次 制备细胞悬浮液滴片气干Giemsa染液染色 冲洗 3060min D.W 我们从2000年7月11月间先后4次制作文昌鱼染色体装片并进行显微观察。第一次7月上旬，活文昌鱼用300g/ml的秋水仙素处理后，经过撕拉精巢 离心 低渗 固定 染色 制片 第二次：7月中旬，按上述方法分组制作染色体装片 第三次
7、：8月上旬，总结了第二次的经验教训，并经过脱水透明制成永久装片，脱水方法如下：70%AIC 85%AIC 95%AIC 100%AIC(I.II) 1/2 100%AIC+1/2XYI XYI(I II)第四次：8月下旬，取体长为1120mm、2130mm、3140mm,40mm以上的文昌鱼按第二次方法用300g/ml秋水仙素、胰蛋白酶进行实验，但没有经过脱水透明。（二） 显微观察 待片充分干燥后，置于显微镜下用4516倍、10100倍观察，最后选出分散较好的分裂相进行拍照，扩大，测量，用统计学方法计算相对长度及臂比。根据Leven等提出的染色体分组标准，进行染色体分类和归组，并进行核型分析。
8、二结果（一）染色体数目 通过对文昌鱼的四次实验，根据观察的100个中期分裂相，我们观察到文昌鱼二倍体的染色体数目为2n34 。表1 文昌鱼染色体观察统计结果： 染色体数目分布染色体数目17 18 19 32 34 36 38 42 44所观察到的细胞数 8 5 5 7 56 8 5 2 4占观察细胞的百分比8 5% 5% 7% 56% 8% 5% 2% 4%观察细胞总数为100 上述计数的分裂相中，非众数部分的染色体数目绝大部分偏向小于众数的一侧即小于34，这是由于处理细胞制片和计数误差造成的。表2 文昌鱼染色体的相对长度和臂比(二) 核型染色体编号相对长度臂比归组染色体编号相对长度臂比归组1
9、7.5850.0451.39370.11 m105.540.008t27.740.011.18180.015m11 4.5650.001t36.5840.0171.09030.075m124.270.001t47.0730.0041.26250.073m134.070.0001t57.80.01051.12490.008m143.860.0005t67.630.0241.07680.035m153.2930.003t78.380.011.05190.005m163.710.01t87.8150.011.01620.008m174.780.08t96.670.022.1050.412sm1 m组
10、 为8对中部着丝点染色体（m），其臂长以第1对为最大，其相对长度各对之间均无显著差异（p0.05）其中，第2和第3对为杆状，其同源染色体彼此在相对长度和臂比上无明显差异。2 sm组 为1对亚中部着丝点染色体（sm），其臂比是2.10510.412，是所有染色体中最大的。3 t组 包括第10-17对，为8对端部着丝点染色体（t）。其中，第17对染色体为随体染色体，其形状为小球状的特点在图象中容易辨认。在分析过的11个分裂相中，有5个显示出这一特点。此外，在这8对染色体中，第16对染色体为杆状，其相对长度为3.710.01，与其它各对并无显著差异。三讨论1. 染色体的识别经过以上几次实验，我们发现
11、用胰蛋白酶和300g/ml秋水仙素处理过的材料所做的装片效果最好。但观察到大多数为颗粒状物质，为了区分这些颗粒状物质是否为委缩的精子或染色剂颗粒，我们又把文昌鱼的精子压片，做染色剂装片进行对比。经过显微观察，发现颗粒状物质为染色体。2秋水仙素的浓度为了避免再把染色体与染色剂颗粒混淆，判断染色体萎缩与秋水仙素浓度是否有关系。第二次我们将秋水仙素分为100g/ml、200g/ml、300g/ml三个梯度进行实验，并用过滤后的染色剂染色。第三次我们按第二次的方法又做了一次实验，并在滴片干燥后，把装片脱水透明，但观察效果并没有第二次效果好。因此，装片脱水透明是没有必要的，反而会使材料流失。在对第二次实
12、验的装片的观察中，发现加胰蛋白酶的方案效果好。3文昌鱼材料的选择由于文昌鱼在体长为20mm以前精巢未发育好,而在体长为40mm以后精子都已排出体外,所以对于文昌鱼材料的选择应在体长为20mm40mm。本项实验还发现体长在40mm以内的文昌鱼和断体的文昌鱼用胰蛋白酶处理后，制作出来的染色体装片效果较好。 4处理方法的探讨在第二次实验中，我们在300g/ml秋水仙素处理之前，又加入了PHA的处理。但在装片中PHA的处理效果并不明显。为了进一步搞清PHA对细胞分裂的影响，我们还把黄鳝、泥鳅、鰕虎、罗非鱼四种鱼用300g/ml秋水仙素、PHA处理，制成染色体装片，结果表明，对于体重在20g以上的鱼类，
13、如鰕虎、罗非鱼，应注射PHA， 这样才能使PHA的处理效果显著，且有利于染色体的观察。而对于体重在20g以下的鱼类，如黄鳝、泥鳅，由于体形过小，不易注射，则应将其浸渍在PHA中。四收获和体会 在这几个月的研究中，我们从文昌鱼的形态结构、生活习性入手，深入到细胞的研究。虽然实验工作量很大，又遇到许多困难，在老师和有关专家的指导下，取得良好的结果，在研究和实验中，不仅学会许多实验技术，如显微镜使用、显微摄像等。提高观察、分析、综合的实践能力，而且使我深深体会到探索科学的道路是不平坦的，只有不畏艰难、持之以恒，才能有所创新、有所收获。 本项目对厦门文昌鱼的染色体组初步研究，今后的工作还有许多。因此，建议有关部门加强生理、生化的研究，建立文昌鱼种质库，保护文昌鱼种质及其遗传基因。参考文献：1中国大百科全书 生物学 1991.122林加涵 不同水温对文昌鱼性腺发育的影响 台湾海峡 1996.15(2)3林加涵 文昌鱼精子发生的核孔复合体冷冻蚀刻电镜观察 海洋与湖 沼 1959.17(3)4林加涵刘丽莎等 黄鳍鲷染色体组型的初步研究 台湾海峡 第8期第2期 1989年6月5相建海 海洋动物细胞和种群生化遗传学 山东科学技术出版社1999年底月第一版 6李国珍 染色体及
