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1、蛋白质的提取与检测第一节 细胞总蛋白的提取及含量测定【基本原理】蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前 常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马 斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法 并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方 法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑:实验对测定所要求的灵敏度和精确度;蛋白质的性质； 溶液中存在的干
2、扰物质；测定所要花费的时间。Lowry 法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使 暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与 磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在 750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相 同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Bradford 法：蛋白质与染料考马斯亮蓝 G-250 结合，使得染料最大吸收峰从 465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应 液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增
3、加 即可进行蛋白定量。BCA （Bicinchoninic acid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质 还原成一价铜离子（Biuret reaction ）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。 两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在 562nm 处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关 系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。试剂配制】1. 1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF：0.174g PMSF 溶解于 100ml 异丙醇，分装于 1.5ml离心管中，-20C保存。2. 细胞裂解液：50mM Tris-HCl (pH
4、7.4 ), 150mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 4C保存。3. 100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)： BSA 0.1g, 0.15mol/L NaCl 1ml,充分溶解 后-20C保存。4. 0.15mol/L NaCl： 0.877g NaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。5. 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 100mg, 95%乙醇50ml,磷酸 100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去 离子水，混匀后滤纸过滤，4C保存。6. PBS 缓冲液(pH 7.4)：
5、NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO412H 2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至 1L,常温保存备用。【操作步骤】一、细胞总蛋白的提取1. 人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10% FBS 的DMEM培养基，37C、5% CO2条件下常规培养。2. 去除培养液后以预冷的PBS冲洗23遍。3. 加入适量的预冷的裂解液后置于冰上2030 min,不时摇动。4. 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧,转移将细胞碎片和裂解液至预冷的 1.5ml 离心管中；。5. 4C、 1
6、2 000 rpm 离心 15min。6. 将上清分装至1.5ml的EP管中，-20C冻存备用。二、蛋白含量测定（BCA法）（碧云天P0012）1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量 BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2. 完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样 品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL 加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释 标准品的溶
7、液补足到 20uL。4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液（PBS）到 20uL。每个样品三个重复。5. 各孔加入200uLBCA工作液，37C放置30分钟。也可以室温放置2小时，或 60C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延 长孵育时间。标准品浓度ug/uL00.0250.050.10.20.30.40.56.酶标仪测定A562, 540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白 浓度。标准品OD值0.0780.0990.1180.1540.2130.
8、2830.3290.404第二节 SDS-PAGE 电泳【基本原理】SDS-PAGE 电泳技术(SDS polyacrylamede gel electrophoresis)首先在 1967 年由 Shapiro 建立，1969 年由 Weber 和 Osborn 进一 步完善。 当在样品介质和聚 丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS 后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的 分子量大小，其它因素可以忽略不计。SDS 是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间 的非共价键(氢键和疏水键)。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的 存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多
9、肽链。解聚后的蛋白质分子或 其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电 荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的 电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴 对不同的蛋白质-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量 的大小成正比，因此这种复合物在 SDS-PAGE 系统中的电泳迁移率不再受蛋白 质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小 。 当蛋白质的分子量在15200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关 系。因此， SDS-PAGE 不仅可以分离鉴定蛋白
10、质，而且可以根据迁移率大小测 定蛋白质的分子量。【试剂配制】1. 10%SDS： 10g SDS加入100ml去离子水中，50C水浴下溶解，室温保存。2. 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)： Tris-base 45.43g，加入200ml去离子水溶解后， 用浓盐酸调pH至8.8，加去离子水定容至250m l，高温灭菌后室温下保存。3. 1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8)： Tris-base 30.29g，加入200ml去离子溶解后，用 浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250m l，高温灭菌后室温下保存。4. 电泳缓冲液：Tris-base 3.03g
11、，Glycine 18.77g，SDS 1g，加入适量去离子水 溶解后定容至1L，室温保存。5. 5XLoading buffer： 50%廿油，250 mM Tris-HCl (pH6.8), 10% 艮巯基乙醇， 2.5%o溴酚蓝，10% SDS。混匀后，分装于1.5m 1离心管中，4C保存。6. 10%过硫酸胺(AP)： 0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离子水，4C保存，保存时 间为2周。7. 四甲基乙二胺(TEMED)：分装少量原液于棕色瓶，4C避光保存。8. 30% Acr/Bic (37.5:1)：丙烯酰胺(Acr) 29.2g，甲叉双丙烯酰胺(Bic) 0.8g， 加入适量去离
12、子水于37C下充分溶解并定容至100ml，4C保存。注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积累，应戴手套进行操作。9. 凝胶脱色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L,室温保存。10. 考马斯亮蓝G250蛋白染色液：0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中， 混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。11. 凝胶保存液：450ml脱色液中加入50ml甘油，混匀后室温保存。12. SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)配方：菩种蛆粉名韩咨斡社胶熄軾蘭对毎苗苦聊俎协的取样号1 mi2 ml3 ml4 ml5 ml6 ml& ml10 mlH=
13、O0 6S1,43.12.73.44.1556 9OT%毗州盘闽酬0.170.S30.50.670.B31.01.31.71.0 M Trls-HCI (pHS.S)0.130 25Q.30050.630.751.01.251(J% SDS0.01aoe0.030.040,050.06aos0.110% 过 fllBS 铁0.010.020.030.040.050.060.060.1TEMED0.00100020.0030.0040.0050.0060 00.0113.分离胶配方SmlID mil15 ml20 ml25 ml30 ml40 tnl50 m6% GelHsO 30%Azryla
14、mide- 1.5MTri5-HCl(pHH.3) 10% SDS过皿披 TEMED9%GslhW30% A:rylaniici& l5MTriE-HCI(pHS.a) 1D% SDSTEMCD10%住日I hbOAzrylamide-1.5 MTriS-HCl(pHa.a) 10% SDS 10iStWtS TEMED12%GbIl-bO3D% Acrylarnicie1.5MTriB*HCl (pHH.8)10% SDSTEMED lECelHaO30% Acrylanicfe1.5MTri5-HCIi：pH0.3) 10% SDSIDj. iSiflltiS TEMED265.37.91O.13.215.92122S.5i.n2.0ao4.0S.O6.00.010.Di.3包5SB6.37-5ifj.b佗5Q.HS0.1Q.1&J0.2531.40.50.050.1D.150.2a.350.3.40.5O/OCM0,008：0.0120.016o oe 02=41.0320.040.050.05 QOOB4.6 .7 丸50.10.1 00苗95 D B 1 -.&.a.3.D.O o9.3 S35X10.2Q2 0 01211.S6.76.3 J.25 0 250 01513.9B.D了 0.3o.s oia血1-0.7W.O.40.40 02421213L
