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1、气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量1. 方法原理中性糖和氨基糖在吡啶 -甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐 酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应, 所得衍生物可利用气相色谱测定。由于土壤 样品成分较复杂, 需要较多的 处理过程,本试验采用内标法（内标为戊五醇,可以有效 地消除系统误差和样品损失所带来的误 差,增加实验的精密度和准确度。2. 主要仪器BEIFEN SP-3420A气相色谱仪,配火焰离子化检测器（FID,北京北分瑞利分析 仪器 （集团 有限责任公司;AT. SE-30型石英毛细管气相色谱柱（30m x0.25mm x0.25um 100%二甲基聚 硅氧烷;通用型非极
2、性固定相;热稳定性达到350C;化学键合交联柱，可用溶剂清洗； 极性相似于DB-1, SPB-1, HP-1等固定相;符合USP G1, G2, G38指定固定相冲国 科学院兰州化学物理研究所色谱技术 研究开发中心;RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HP-5016SY 型氮吹仪,上海济成分析仪器有限公司;FreeZone 6 plus cascsdo 型冷冻干燥仪,美国 LABCONCO 公司;DK-98-J 型电子恒温水浴锅,天津泰斯特仪器有限公司Allegra 64R TD5A型台式高速离心机，美国Beckman COULTER公司；DHG-9240型烘箱，上海一恒科学仪器有
3、限公司；雷磁PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司。3. 主要试剂8种中性糖标准:核糖（RIB、鼠李糖（RHA、阿拉伯糖（ARA、木糖（XYL、葡 萄糖（GLU、半乳糖（GAL、甘露糖（MAN和岩藻糖（FUC ;均购自Sigma-Aldrich 公司;4种氨基糖标准:氨基葡萄糖（GLU-N、氨基半乳糖（GAL-N、氨基甘露糖 （MAN-N和胞壁酸（MUR，均购自Sigma-Aldrich公司；内标:戊五醇（Adonitol，高纯试剂,Sigma-Aldrich公司；其它试剂：盐酸羟胺（Hydroxylamine hydrochloride，高纯试剂,Sigma-Aldrich 公司;
4、4-二甲氨基吡啶4-（Dimethylamino pyridine，高纯试剂,Sigma-Aldrich 公司；二氯 甲烷（Dichloromethane ,色谱纯，天津市凯信化学工业有限公司；乙酸乙酯（Acetic ether、正己烷（n-hexane ,均为色谱纯，山东省禹王实业总公司化学试剂厂；无水甲醇（Methanol，色谱纯，天津光复精细化工有限公司；吡啶、三氟乙酸（TFA ,均为分析纯，上海中秦化学试剂有限公司；乙酸酐，分析纯，天津市化学试剂三厂；盐酸，分析纯，白银西区银环化学制剂厂。4. 溶液的配制4. 1标准溶液和内标的配制:8种中性糖和戊五醇的浓度均为1 mgmL -1,水溶
5、液配制；四种氨基糖中除胞壁酸用无水甲醇配制浓度为0.5 mgmL -1 外,其它均为1 mg.mL -1水溶液。4. 2衍生试剂的配制：4 : 1的吡啶-甲醇溶液，含有32 mg.mL -1的盐酸羟胺和40 mgmL -1的4-二甲 基氨基吡啶。5. 标液衍生:氨基糖:吸取用无水甲醇配制的胞壁酸溶液150 ml,用氮吹吹干,各吸取其它三 种氨基酸溶液150 ml,加入到吹干的胞壁酸中溶解摇匀后，进行冷冻干燥，按照6. 2所 述方法衍生。中性糖 :将配置好的上述水溶液,吸取 150ml ,直接进行冷冻干燥后,按照 6. 2所 述方法衍生。 同时,对各标样单标按同法进行衍生。6. 土壤样品的处理和
6、衍生6. 1 中性糖和氨基糖水解及土壤样品前处理（1氨基糖。将含有约4 mg有机碳（不少于0.3 mg氮的土壤样品置于水解瓶中, 加入6 molL -1的HC1溶液10 mL,加盖密封水解瓶，在105 C下水解8 h。冷却至室 温后，加入100 pg戊五醇溶液（内标,振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干，残 余物溶解于20 mL蒸馏水中，并用0.4 molL -1的KOH溶液调节pH值至中性（pH 6.66.8,然后以3000 r/min离心10 min去除沉淀。上清液用冷冻干燥仪冻干，残留的 固体物质用3 mL无水甲醇溶解，再次离心10 min以除去盐分。将上清液转移到5 mL衍生瓶中，用N
7、 2在45 C下吹干，加入1 mL水。然后再次进行冷冻干燥（8 h以 上。实验中凡是盐酸参与的水解都采用此前处理方法。（2中性糖。将含有约4 mg有机碳的土壤样品置于水解瓶中，加入4 molL -1 的TFA溶液10 mL,加盖密封水解瓶，在105 C下水解4 h。冷却至室温后，加入100 pg戊五醇溶液（内标，振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干,残余物溶解于20 mL蒸馏水中，并用0.4 molL -1的KOH溶液调节pH值为6.66.8,然后以3000 r/min离心10 min去除沉淀。取出上清液再次旋转蒸发干燥，固体物质用4 mL蒸 馏水溶解，然后转移到5 mL衍生瓶中,进行冷冻干燥
8、（8 h以上。6. 2 衍生方法向上述衍生瓶中加入300 yL衍生试剂前述4.2,加盖密封，在7580 C条 件下加热30 min,其间振荡数次。冷却至室温后，加入1 mL乙酸酐，密封再次加热20 min。冷却后加入1.5 mL的一氯甲烷。过量的衍生试剂通过以下两步来去除:首先，加入1 molL -1 d的HC1溶液1 mL,激烈振摇30 s后，移走上层液体。其次，与上面步骤相同，用1 mL的蒸馏水至少洗涤3次，在最后一次洗涤过程中 尽可能去除水相。剩余的有机相在45 C下用N 2吹干后，用400 yL的乙酸乙酯-正己烷混合溶剂 (V /V =1 : 1溶解后转移至进样瓶中，即可进行气相色谱测
9、定。7. 气相色谱分析载气为N 2,流速1.2 mLmin -1;进样量为2.0 pL，分流比为30 : 1; GC进样口温 度为250 C，火焰离子化检测器(FID温度为300 C。以峰面积内标法定量。中性糖分析色谱柱梯度升温程序为:柱温175 C，保持4 min;以4C min -1的 速度升温至225 C，保持4.5 min;再以30 C min -1升温至270 C，保持2 min;最后 以30 C min -1的速度升温至300 C，保持2 min。氨基糖分析色谱柱梯度升温程序为:柱温175 C,保持4 min ;以3.5Cmin -1的 速度升温至225 C,保持5 min,再以1
10、0 Cmin -1升温至270 C,保持3 min;最后以 30 Cmin -1的速度升温至300 C,保持2 min。主要参考文献：张威，何红波，等不同水解方法对土壤中性糖和氨基糖含量测定的影响J. 生态环境,15(5: 1067-1071.2 ZHANG X, AMELUNG W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine,mannosamine, and galactosamine in soilsJ. Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28(9: 1201-120
11、6.3 Wei Zhang, Hongbo He, Xudong Zhang. Determination of neutral sugars in soil by capillary gas chromatography after derivatization to aldononitrile acetatesJ. Soil Biology & Biochemistry 39, 2007, 2665-2669.4 WULF AMELUNG, MARTIN V. CHESHIRE and GEORG GUGGENBERGER. Determination of neutral and aci
12、dic sugars in soil by capillary gas-liquid chromatography after trifluoroacetic acid hydrolysis J. Soil Biol. Biochem. 1996, 28(12: 1631-1639.5 张威 ,何红波 , 张明 ,张旭东 . 糖腈乙酰酯衍生气相色谱法测定土壤水解性 单糖 J. 土壤通报 , 2008, 39(4:913-916.6 Guerrant G.O. and Moss C.W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime,alditol, and cyclitol acetates derivatives by gas chromatography J. Analytical Chemistry 56 ,1984, 633-638.
