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1、 miRNA的作用机制及功能研究进展王娟（学院生物系， 253023）摘要 microRNA (miRNA)是源性的大小在20-25nt的一类非编码RNAs，具有调节基因表达活性的功能，广泛存在于真核生物体，并在进化中保守。miRNA的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。本文总结了近几年来在miRNA的特征、生物发生、作用机制及功能意义上的研究进展。miRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，对其进行深入的研究，将有助于我们对生物体的各种生理病理机制的理解，并最终为疾
2、病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。关键词 siRNA； microRNA； piRNA; 微处理器; 核糖核酸切酶; 基因调控; 生长发育； 肿瘤治疗前言2006年，Andrew Fire 和Craig Mello 由于在RNAi（RNA interference，RNAi）及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖，这再次将人们的注意力拉到siRNA这样一种小分子RNA上。小分子RNA包括一个大家族，并在真核生物中具有广泛的调节功能。目前已经有至少两种小分子RNA被描述：来源于发夹状前体的miRNAs (microRNAs)和由长的dsRNAs加工而来的siRNAs (small
3、 interfering RNAs)。研究发现，miRNA与siRNA有很多相似之处，但也有很大的不同，二者的区别将在以下文中进行论述。最近又有文章报道了一种新的小分子RNA的发现25piRNAs (piwi-interacting RNAs),他们特异地在小鼠的生精细胞量表达。这些RNAs比以前发现的大多数小RNAs较大，约2631nt(nucleotides)，并与Argonaute蛋白家族的Piwi亚枝(Piwi-subclade)成员相联系。 Argonaute 蛋白大约100KD，具有PAZ (Piwi Argonaut and Zwille)和PIWI结构域。一种小RNA分子引导A
4、rgonaute蛋白识别靶分子并介导基因沉默。Argonaute家族被分为Ago和Piwi两个亚枝。一般，Ago成员广泛存在并与miRNAs 和siRNAs有关，而Piwi成员则限制在种系细胞和干细胞中表达。 克隆的piRNAs 在染色体中表现出极不均匀的分布，大多数piRNAs簇集于染色体中相对较小的基因座位，大小约1 kb到100 kb包含104500个小RNAs。尽管目前对这些RNAs的生物发生和功能还不清楚，但这些发现为小RNA生物学和种系细胞生物学增加了新的容。本文将重点论述miRNA的最新研究进展，miRNA自被发现，迅速成为近几年生命科学领域的研究热点。对它的研究将会对转录后基因
5、调节领域的发展产生深远影响。miRNA是一类长度约为22nt的小分子非编码单链miRNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体（pre-miRNA）加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3末端非翻译区(3untranslationalregion,3UTR)结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。miRNA家族的成员是在研究秀丽线虫的发育转变过程中作为小分子短暂RNA（stRNA）被发现的。研究发现，miRNA是stRNA中的一个大家族，并且在线虫、果蝇、植物、哺乳动物、甚至病毒中均有发现。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，
6、在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。1 miRNA的发现及命名早在1993年Lee等20利用遗传分析的方法已经在线虫中发现一个22nt的小分子非编码RNA:lin-4。Lee等注意到，lin-4或lin-14突变后造成线虫发育差时表型(heterochronic phenotype)，在线虫发育早期起作用的lin-4基因的突变使线虫中应该在早期出现的发育事件延迟发生，而lin-14基因的缺失突变却造成了完全相反的结果。后来证明，这种lin-4基因编码的约22个核苷酸的单链RNA通过不完全互补的方式结合到靶mRNA(target mRNA)lin-14的3末端非翻译区(3untransl
7、ationalregion，3UTR)，短暂下调lin-14蛋白的水平，促使线虫从L1期向L2期的过渡，但并不影响mRNA的水平。2000年Reinhart等22发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:let-7。第二个miRNA let-7的发现掀起了寻找miRNA的热潮，拟南芥、线虫、果蝇、小鼠、以及人类等各种生物及病毒中都相继有miRNA的报道,且主要以模式生物为主。miRNA种类的普遍性及多样性预示着它在生物界中具有更广泛的功能。miRNA的命名，除最早发现的几种miRNA（如：lin-4 和let-7等）以外，其他发现的都用“miR-#”来表示12，“#”为阿拉伯数字（如
8、miR-1，miR-2），对应的基因也用这三个字母后缀加数字命名，具体根据不同物种的命名习惯采用连字符、斜体或大写（如线虫和果蝇中的mir-1，水稻和拟南芥中的MIR-156）。2 miRNA的特征及与siRNA的比较2.1 miRNA的特征 2.1.1 结构特征 长度为22nt是miRNA一个最基本的特征, 且具有能形成分子茎环结构的前体。在动物中,前体的长度一般在7090nt,而在植物中前体的长度可变性很大,可以从几十到数百nt。2.1.2 miRNA的存在形式 miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 在基因组中有固定的基因座位，7090位于蛋白基因的基因间隔区
9、(intergenic region,IGR)，其余在含子，还有个别在编码区的互补链，说明它们的转录独立于其他的基因,具有本身的转录调控机制。最近有研究21发现，25%的人类已知miRNA位于蛋白质编码基因的基因区域(intronic regions)，其约50%定位于含子(introns)中,这些miRNA都具有独立的转录单元，可以作用于其主基因(host gene)的非翻译区(untranslated region，UTR)下调其蛋白质编码基因的表达水平，并且还可以作为重要的负反馈调节子。2.1.3 保守性 miRNA不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守。结构上，miRNA 在颈
10、部的保守性较强，而环部可以容纳较多的突变位点的存在。种系上，有些miRNA在一些物种中是高度保守的。约12的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比较发现，这些保守片断的碱基差异仅为12 nt；miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。在线虫中,发现85 %的miRNA 在C. briggsaze 基因组序列中是有同源物的18。最具有miRNA保守性的是let-7 RNA,let-7在C. elegans和人类中完全保守；大约40的C. elegans中的miRNA在人类中也是保守的。线虫C.elegans中的let-7 miRNA可以在果蝇基
11、因组,人的第9、11和22条染色体上各找到一个与之完全一致序列,另外在人的第9条染色体上还有一个仅差1个核苷酸的序列10。2.1.4 时空特异性 目前研究较清楚的lin-4与let-7呈时间特异性表达。在C.elegans中，lin-4只在幼虫的第一期和第二期存在;let-7却存在第三、第四期及成虫期,在第一和第二期并不存在；在拟南芥中，miR157在幼苗中高表达，miR171则在花中高表达23。同时,miRNAs的表达具有组织特异性。例如，mir-290mir-295只在鼠胚胎干细胞中表达，而在成体组织主要在胸腺和骨髓中表达14。最近一项研究28发现，miRNA靶目标在成熟小鼠和果蝇组织中的
12、表达水平要比在胚胎中低，同时，miRNA更倾向于靶向广泛表达的而不是组织特异性表达的基因，这项结果表明了miRNA广泛地参与胚胎发育及成体组织特性的维持。2.2 miRNA与siRNA的比较miRNA与siRNA 的根本区别是他们来源不同，而二者的作用机制相通。首先，miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点: 5端磷酸，3端均有2个游离核苷酸。3. miRNA和siRNA合是由双链的RNA或RNA前体形成的。4. 二者都是RISC(RNA induced silencing c
13、omplex)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。miRNA和siRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。3.本质区别在于作用位点上，miRN
14、A作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。4.在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。5.miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。miRNA与siRNA 的区别总结于表12。表1 miRNA和siRNA的区别 特性 miRNA siRNA 来源 源转录本 转基因、病毒RNA大小 约22nt 约22nt前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA催化酶 Drosha、Dicer或类似 DicerDicer的酶复合体RISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族匹配方式 不完全互补（动物）或 完全互补 完全互补（大多数植物）作用目标的专一性 相对较低 高 (特异性)续表1 特性 miRNA siRNA作用点 蛋白质合成水平 转录后水平靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解功能 发育过程中调节 抑制转录活性、病毒 源基因的表达 感染、表型遗传3 miRNA的生物发生 目前，关于miRNA的生物发生的研究已经取得较大进展。动物
