荧光标记二抗的选择

《荧光标记二抗的选择》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光标记二抗的选择（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、荧光标记二抗的选择荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP 或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。选 用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用 的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流 式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可 以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的

2、染料，荧光染 料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：_【异硫氧酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4， 最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的 黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于 FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧 光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿 色较为敏感，通常切片标

3、本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的最大缺点是淬 灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。【四甲基异硫氧酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC) Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发 射波长(570, 590, 620nm)。尽管TRITC经常和FITC 一起在双标记实验中使用，使 用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显 微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FI

4、TC)和Cy5 一起使用， 因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发 光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。 因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发，在流式细胞仪中用FITC作双标， 另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫 红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈 现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。 因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。【菁类染料-Cyanine dyes(

5、Cy2, Cy3, Cy5)】Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC 使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的 苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微 弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦 联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射 光波长很接近TRITC,在荧光显微镜中，可使用和TRITC 一样的滤波片。Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50%的光强，在氦氖灯(543nm) 或者汞灯(

6、546nm)下则约75%。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5 一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发 光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98%的荧光，在氦氖灯 下(633nm)为63%。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。 由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想 的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。 在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用 Cy5。【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoeryth

7、rin(PE)荧光标记二抗】存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红 蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后， 其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时 不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广， 最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记 物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材 料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而 且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【Aminomet

8、hylcoumarin Acetate (AMCA)】耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜 来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较 弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠 范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用 于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测 蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。 AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的 检测AMCA所激发的蓝

9、色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的 抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发， 因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的 波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红 (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明 显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。流式细胞术多色荧光分析指南2009年6月11日流式细胞术多色荧光检测是目前精细鉴定细胞亚群及分析不同细胞亚群功能的重要 手段，在国

10、际和国内均得以广泛应用。然而，面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染 料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间的颜色补偿究竟有多大呢？下面提供 两个表格谨供参考，希望能给您带来一丝感悟。1荧光素激发波长(nm)发射波长(nm)长通滤片带通滤片eFluorTM450405, 407450-440/40, 450/50Pacific Blue405, 407455-440/40, 450/50eFluorTM605NC355, 405, 407605595LP605/40eFluorTM625NC355, 405, 407625595LP605/50eFluorTM650NC355, 405

11、, 407650630LP660/40FITC488518-530/30Alexa Fluor488488519-530/30PE488575550LP575/26,585/40PE-Cy5488667635LP670/14,695/40PE-Cy5.5488695685LP695/40PerCP-Cy5.5488695685LP695/40,710/40PE-Cy7488785735LP780/60,780/40APC633,635,640660-660/20Alexa Fluor647633,635,640668-660/20Alexa Fluor700633,635,640723685L

12、P710/40, 720/45710/50,APC-eFluorTM780633,635,640780735LP780/60APC-Alexa Fluor750633,635,640775735LP780/60注释:1. 以eFluorTM450为例：最大激发波长为405 nm或407 nm,最大发射波长为450 nm,流式细 胞仪检测时无需长通滤片(LP, Long Pass),而需440/40 (即检测波长范围为440 + 20 nm) 或450/50 (即检测波长范围为440 土 25 nm)的带通滤片(BP, Band Pass)。2. 以eFluorTM605Nc为例：最大激发波长为

13、335 nm, 405 nm或 407 nm,最大发射波长为605 nm, 流式细胞仪检测时需595LP长通滤片(即大于595 nm的光可透过滤片，而小于595 nm的光 被滤片反射)，和605/40 (即检测波长范围为605 + 20 nm)的带通滤片。Alexa APC-Alexa eFluorTM eFluorTM eFluorTMFITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APCFluor Fluor 750450605nc650nc700FITC1.100.000.080.000.000.000.000.000.00PE16.520.011.620.000.000.000.

14、000.410.00PerCP-Cy5.53.3727.523.500.745.290.160.000.0631.83PE-Cy70.272.0111.480.110.861.860.000.000.08APC0.000.012.190.050.6222.800.000.0677.17Alexa Fluor7000.000.0019.350.1129.468.840.000.005.83APC-AlexaFluor 7500.090.003.095.345.1025.700.010.030.00eFluorTM4500.270.000.000.000.000.060.220.150.09eFluorTM605NC1.5116.990.000.020.030.320.001.476.02eFluorTM650NC0.241.021.430.011.060.000.440.001.02注释:1. 表中数值表示各荧光检测通道间的颜色补偿值(compensation),单位为。2. 以FITC和PE为例：若流式细胞仪的FL1通道检测FITC, FL2通道检测PE,则需将仪器的补 偿设置为FL1-%FL2=1.10, FL2-%FL1=1