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1、固定化葡糖淀粉酶：通过高度活化的乙二醛琼脂糖载体共价修饰酶表面摘要：商业糖化酶固定不变的高活性乙二醛琼脂糖载体非常缓慢。所得衍生物是只有6倍比可溶性酶更稳定。只有6倍，比水溶性酶更稳定。未修饰的淀粉酶，高度糖基化的，只有少量赖氨酸能够与载体上乙二醛基团反应。因此，酶表面通过羧基的化学修饰高度富集的氨基组（带碳二亚胺激活）与乙二胺。胺化的酶保持了良好的活性（80）和它的百分表现出相同的稳定性比未修饰的酶。固定化酶的固定化非常迅速的高活性乙二醛琼脂糖载体。新生成的衍生物保留活性的50，是超过500倍，比在热灭活的实验可溶性酶更稳定。1 简介葡糖淀粉酶（-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1
2、.3），也称为淀粉葡糖苷酶（AMG），是一种外切酶作用于从直链淀粉，支链淀粉和糖原的非还原端以连续的方式释放出1,4-糖苷键D-葡萄糖。它也水解（16）和-（13）糖苷键，但与水解（14）键速率相比慢得多。葡糖淀粉酶是一种工业上重要的酶和它用于麦芽寡糖大量转化成葡萄糖和食品、饮料和发酵工业中所需的各种糖浆。该工业过程将通过使用固定化系统将更具经济效益，因为它们允许酶的再利用和常常导致也在针对不同的失活酶的稳定性的提高剂，例如，高温。葡糖淀粉酶的固定化已被使用各种载体（无机材料，聚合物，磁性粒子的研究，等）和不同的酶 - 载体偶联方法，如吸附或共价偶联到固体基质中所需的各种糖浆，以及由包封或封装
3、在聚合物质。其他作者描述回收值从5至90。然而，热稳定已经非常低（低于5倍）。固定化酶衍生物必须非常稳定，以便对许多反应循环是有用的。许多用于酶固定化协议涉及酶在预先存在活化的载体的简单共价附着（戊二醛，溴化氰所需的各种糖浆，NHS活化载体等）。温和的固定化处理之后（例如，在形成酶和载体之间的单点共价连接的）的关键酶性质（即，3D稳定）没有得到很大的提高。与此相反，多点共价连接可促进与此相关的稳定的酶结构的硬化效果。事实上，在我们的实验室中，令人关注的稳定性已通过使用高度活化乙二醛活化载体改进的固定化的协议来实现。乙二醛琼脂糖凝胶通过具有最高量的赖氨酸残基中所需的各种糖浆，即进一步的多点共价连
4、接最大可能性，可以实现其表面区域有利于酶的第一个共价固定。这可能对酶的稳定性是一个显著影响。未修饰的葡糖淀粉酶在这项工作中，固定化在不同的高度氨基化的酶和高度活化乙二醛 - 琼脂糖载体进行了研究。固定化率，酶活性的保存和热稳定的不同固定化衍生物进行了研究。2.材料与方法2.1 材料糖化酶（AMG200L），黑曲霉捐赠诺维信公司A / S（Bagsvaerd中所需的各种糖浆，丹麦）；葡萄糖氧化酶（47,200units/克，固体）从A型到II-S、尼日尔和过氧化物酶（113Purpurogalin单位/ mg固体）自有限公司（圣路易斯中所需的各种糖浆，MO）Sigma化学购辣根I型；淀粉购买自A
5、cros有机物（新泽西州，美国）；交联琼脂糖珠6和10的（重量/体积）从ABT（琼脂糖珠科技）（马德里中所需的各种糖浆，西班牙）购买。DEAE琼脂糖4B是从GE-Healthcase生物科学AB（Uppsala的购买中所需的各种糖浆，瑞典）。 2,3-环氧-1-丙醇（glycydol），乙二胺（EDA），2,2-连氮基 - 双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）中所需的各种糖浆，hydrochlo-骑N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（CDI）和硼氢化钠购自Sigma化学购买。有限公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。高碘酸钠自Fluka（NEU乌尔姆中所需的各种糖浆，
6、德国）购买。有机溶剂和所有其他试剂均为分析纯。2.2 纯化商业AMG 添加剂加入到商业酶制剂稳定酶分子。一些添加剂被吸附在酶表面，阻碍酶表面与活化的载体之间的相互作用（数据未示出）。除此之外，添加剂由于固定化酶的存在可以影响真正的稳定因素，（固定化酶的半衰期和可溶性酶之间比率）。这样，在商业AMG的纯化中，以消除所述稳定的添加剂。商业AMG通过DEAE琼脂糖吸附/脱附法纯化，然后通过透析针对于4在温和搅拌过量的磷酸钠缓冲液，pH7.0为24小时，并使用10至12 kDa的截止膜。2.3 酶活性测定可溶性和固定化AMG的酶活性在25下，在pH6.5，50mM柠檬酸盐缓冲液中制备加入1g/L淀粉底
7、物，在pH为6，浓度为50mM磷酸盐缓冲液，中制备的葡萄糖氧化酶 - 过氧化物酶-ABTS体系，用的比色法测定葡萄糖产生的初始反应速率。通过测定吸光度，最大吸收波长在405nm。反应混合物含有所需的各种糖浆0.5ml葡萄糖苷（2.5克/升），过氧化物酶0.5毫升（2.5克/升），0.4毫升ABTS（1mM）和1克/升淀粉溶液1 ml。通过在反应物加入25-200升的水溶性酶溶液开始反应，或加入固定化酶使反应停止。催化活性用国际单位表示（每分钟释放1mol葡萄糖）。该可溶性纯化酶表现出100mol / mg的比活性蛋白质。2.4 固定化酶活性载体的制备 通过活化的琼脂糖基质（6琼脂糖凝胶）与缩水
8、甘油，与高碘酸盐发生氧化，制备乙醛酰 - 琼脂糖载体。在冰浴上，缓慢搅拌下加入预先用蒸馏水洗涤的琼脂糖105g，通过和30毫升蒸馏水冷溶液和50ml含有1.425克硼氢化钠1.7N NaOH，进行混合。36毫升缩水甘油要缓慢加入，避免引起的温度上升超过25。搅拌15小时，反应结束。醚化载体（甘油琼脂糖），真空下在玻璃过滤器中用蒸馏水洗涤。最后一次洗涤后，将凝胶彻底过滤，干燥以除去间质湿度。然后， 105克凝胶再悬浮895毫升的水（载体的悬浮率为1:10）和3.21克高碘酸钠溶液中。轻轻摇动2h冷却至室温后，乙二醛琼脂糖载体充分用水洗涤和过滤。2.5 AMG的固定 固定化过程进行监测测量的酶活性
9、的上清液并在整个悬浮液在不同的时间间隔。此外，与可溶性酶对照用于确定pH值，T或稀释的酶的固定化过程中的可能的灭活效果。在所有情况下，将悬浮液用载体比1:10（制备体积：悬浮液体积），在25下以不同的时间并轻轻地搅拌。载体装载有低量的酶（其中0.5和2mg每ml载体蛋白质）为了测定酶活性时，避免传质的限制。不同的衍生物载体有不同的酶量，为了获得非常相似的活性，每毫升用10U生物催化剂。将高度活化乙醛酰-琼脂糖载体上的固定酶稀释于pH为10.05，浓度为100mM的碳酸氢钠缓冲液中，并与载体孵育。为结束反应，硼氢化钠达终浓度为1mg / ml，并进一步在搅拌下孵育30分钟。最后，将制备好的固定化
10、载体用过量的pH为7，浓度为25mM磷酸钠冲洗，并在4储存，直到进一步使用。固定化过程中的参数被定义为：固定化的产率（YI）为固定化酶的量和可溶性酶的量之间的比值。衍生物的回收活性（RA）是所述衍生物测量活性与固定在载体上的可溶的酶的活性之间的比值。2.6活性检测固定化酶衍生物在不同条件下失活。这些分别不同温度，离子强度，酶浓度和pH条件下孵育，在相应的图中有详述说明。悬浮液的酶样品，定期取出，残余的酶活性的计算为在限定时间内各样品的活性与初始活性比率。稳定因子被定义为衍生物的半衰期与可溶性酶之间的比率。所有的失火实验（以及作为固定和化学修饰）平行做三次，所有实验结果（残余活性，半衰期时间等）
11、误差不超过5%。在表格和附图中，每个值代表三次实验的平均值。2.7 酶表面的化学修饰 纯化的AMG的表面化学修饰通过天冬氨酸和谷氨酸残基插入氨基活性基团在。根据先前述，该胺化过程在乙二胺（EDA）在10mM的碳化二亚胺（CDI）的存在下进行。所以，酶溶液是在pH值4.75，0.5M的EDA溶液，用比率1:10（酶的量：溶液体积），含CDI的10mM制备的。轻轻搅动1.5小时，酶溶液透析5mM的钠磷酸盐缓冲液，pH7通过24小时，在4，用12-14 kDa的截止膜。3.结果与讨论3.1 在不可逆的固定纯化AMG乙醛琼脂糖载体图1表示纯化的AMG对乙醛酰基高度活化6琼脂糖固定化过程。（100微摩尔醛基/毫升载体）。在固定化条件（25C，pH值10.05），24小时的反应中可溶性酶保持完全活性。在此反应之后，大约最初活性的55被固定在载体上。为了获得衍生物呈现10IU/毫升，我们已经提供了纯化19IU（0.19mg）每毫升活化载体水溶性酶。在非常慢的固定化率，可能是由于在赖氨酸基团的含量低存在于酶表面的未糖基化的小区域。3.2.2胺化AMG对高活性的固定收益率在pH10乙醛琼脂糖支持是约100和回收的活性为60左右。经化学修饰的激烈共价固定关于乙醛酰 - 琼脂糖酶大大增加的稳定性相比可溶性固定的生物催化剂（500倍更稳定酶）。
