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1、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。3 定义3.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。3.2 基因突变 （Gene mutation）在化学致突变物作用下细
2、胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。3.3 碱基置换突变 （Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。3.4 移码突变（ Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（ Salmonella typhimurium/reverse mutation
3、assay） 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)原养型(his+)回复突变的试验方法。3.6 S9 经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的
4、S9混合液。5 仪器和设备 培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。6 培养基和试剂6.1 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 成分： L-组氨酸(MW 155) 78mg D-生物素(MW 244) 122mg 加蒸馏水至1000mL 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4冰箱。6.2 顶层琼脂培养基 成分： 琼脂粉1.2g 氯化钠1.0g 加蒸馏水至200mL
5、配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸0.5mmol/L生物素溶液20mL。6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分：枸椽酸(C6H8O7H2O)100g 磷酸氢二钾(K2HPO4)500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O)175g 硫酸镁(MgSO47H2O)10g 加蒸馏水至1000mL 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.4 20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖200g 加蒸馏水至1000mL 配制
6、：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4冰箱。6.5 底层琼脂培养基 成分：琼脂粉7.5g 蒸馏水480mL V-B培养基E10mL 20%葡萄糖溶液10mL 配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37培养箱中24h，备用。6.6 营养肉汤培养基 成分：牛肉膏2.5g 胰 胨5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g 加蒸馏水至500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.7 盐溶液
7、(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分：氯化钾(KCl)61.5g 氯化镁(MgCl26H2O)40.7g 加蒸馏水至500mL 配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 成分：磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)2.965g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)29.015g 加蒸馏水至500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4冰箱。6.9 S9混合液 成分每毫升S9混合液 肝S9100ml 盐溶液20ml 灭菌蒸馏水380ml 0.2
8、mol/L磷酸盐缓冲液500ml 辅酶II(NADP)4mmol 6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mmol 配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分， 使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂6.10.1 组氨酸生物素平板 成分：琼脂粉15g 蒸馏水944mL (V-B)培养基E20mL 20%葡萄糖20mL 灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL)10mL 灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL 配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-
9、B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板 成分：琼脂粉15g 蒸馏水940mL (V-B)盐溶液20mL 20%葡萄糖20mL 灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL 灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL 氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中)3.15mL 四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50，无菌条件下加入四
10、环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。6.10.3 营养琼脂平板 成份：琼脂粉7.5g 营养肉汤培养基500mL 配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。7 试验菌株及其生物学特性鉴定7.1 试验菌株 采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。7.2 生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示。表1 试验菌株鉴定的判断标准菌株组氨酸缺陷脂多糖屏障缺损氨苄青霉素抗性切除修复缺损四环素抗性自发回变菌落数*TA97TA98TA100TA102+-+90-18030-5
11、0100-200240-320注“+”表示需要组氨酸“+”表示具有rfa突变“+”表示具有R因子“+”表示具有uvrB突变“+”表示具有pAQ1质粒*在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增7.2.1 组氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37下培养24h后观察结果。结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。7.2.2 脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些
12、大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37下培养24h后观察结果。结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。7.2.3 氨苄青霉素抗性原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37下培养24h后观察结果。结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄
13、青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。7.2.4 紫外线敏感性原理：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37下孵育24h后观察结果。结果判断：具有uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。7.2.5 四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37下孵育24h后观察结果。结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。7.2.6 自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37培养箱中孵育48h后记数每皿回变
