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1、发酵微生物培养和代谢过程发酵工程利用微生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物细胞积累所需产品的一门技术学科。特点以生命科学为基础结合先进的工程技术手段和其他自然科学原理按照预先的设计改造生物体利用微生物动物或植物体对原料进行加工生产出人类所需产品或达到某种目的的技术传统发酵概念最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。生物化学上发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。工业上所称的发酵泛指利用微生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，
2、它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过程微生物产物是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业微生物的生物转化是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。发酵工业是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。生产菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买从大自然中分离筛选新的微生物菌种。一般菌种分离纯化和筛选的步骤标本采集-标本材料的预处理-富集培养-菌种初筛-菌种复筛-性能鉴定-菌种保藏采样的注意事项1）保持相对无菌；
3、2）样本的代表性；3）采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4）应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5）采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。样品菌液稀释计数直接计数法比浊测定光密度法间接测量法(DNA RNA 粘度 产物 消耗等)稀释分离法 平板涂布分离法 组织分离法施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某些或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势
4、，而得以快速分离纯化的目的。子实体是指在气生菌丝中可产无性或有性孢子，有一定形态和构造的任何菌丝体组织菌株鉴定形态学(光镜 暗视野 扫描电镜 透射电镜 荧光)生理生化实验(糖酵解试验 淀粉水解试验)遗传学鉴定(PCR测序)微生物菌种选育目的(防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品)优良菌株要求1）有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强。2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产品及其它产物。3）生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力。4）产品成本低。能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合
5、成产物5）有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。7）不易感染它种微生物或噬菌体。8）生产特性要符合工艺要求。如发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义。9）遗传性能相对稳定。10）生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）。方法基因突变： 自然选育(spontaneous mutation)是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育(strain breeding)的过程。生产菌种斜面-制备单孢子悬浮液-分离出单菌落（鉴定 移种）-斜面种
6、子（初筛）-高产菌株-沙土管菌株-斜面种子-摇瓶复筛-高产纯化株-生产试验或进一步选育保藏简单易行 效率低进展慢诱变育种(Mutagenesis breeding)是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再经过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。确定出发菌株菌种的纯化选优出发菌株的性能鉴定同步培养制备单细胞（或单孢子）悬液活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变处理（中间培养）平板分离计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选用简单快捷的方法重复筛选摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）
7、速度快、收效大出发菌株（original strain）指用于诱变育种的起始菌株。要求1）出发菌株要有一定的目标产物生产能力；2）营养要求低，产孢子多且早；3）生长繁殖快，有良好的代谢特性；4）对诱变剂敏感，变异幅度大；5）选用多个出发菌株进行诱变收效较快。表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的现象分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。光复活作用（photoreactivation）可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。营养缺陷型（auxotrop
8、h）诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分或其前体物（precursor）才能正常生长的变异菌株。基因重组(gene recombination)： 将两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式杂交杂交育种的优点：a) 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。b) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。方法细菌接合F因子转导R因子转移转化和转导原生质体融合(protopl
9、ast fusion)通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。融合子（fusant）1）受接合型或致育性的限制小，两亲株没有供体和受体 之分，有利于不同种属微生物的杂交。2）重组频率高于其他杂交方法。3）遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。4）可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方 或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高 筛选效率。5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。遗传标记的筛选(营养缺陷型遗传标记 抗药性标记 荧光染色标记 失活原生质体供体法)原生质体的制备融合与再生融合子的鉴定融合子
10、是在选择性培养基上检出的，即通过两个遗传标记互补确定的。如利用营养缺陷型互补等基因工程将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或DNA体外重组技术。表达载体必须具备的条件1）能够独立复制；2）应具有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记；3）应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别；4）应具有使启动子受到抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录；5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆外源基因，而不转录其他无关基因；6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。基因工程菌的稳定性分裂不稳定
11、 是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。结构不稳定 是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的拷贝数；外源基因的表达效率；表达产物的稳定性；细胞的代谢负荷。真核细胞中具生理作用的基因在大肠杆菌中有三种表达方式，即融合蛋白、非融合蛋白和分泌性表达蛋白融合蛋白 是指蛋白质的N端是一段原核DNA编码的序列，C端接上真核基因编码的序列。优点：基因操作简便，表达蛋白在细菌体内比较稳定，易实现高效表达。缺点：因融合蛋白中含有一段原核多肽序列，会影响真核蛋白的免疫原性（immunogenicity ）。非融合蛋白 是在大肠杆
12、菌中以真核蛋白mRNA的AUG密码子为起始表达的蛋白质。可以很好的保持蛋白质原有的生物 活性，其最大的缺点是容易被蛋白酶降解。分泌型表达蛋白 是通过将外源基因连接到编码原核蛋白信号肽的下游实现的。常用的信号肽有碱性磷酸酶(phoA)信号肽、膜外周质蛋白(OmpA)信号肽、霍乱弧菌毒素B亚单位(CTXB)等。基因的定向进化在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造目的物，使之适于人类的需要。基因的直接进化(directed evolution)在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。定点突变 (site
13、-specific mutagenesis 或site-directed mutagenesis) 在目的DNA片段（例如：一个基因）的制定位点上引入特定的碱基对变化的技术易错PCR一种相对简单、快速廉价的随机突变方法通过改变PCR反应条件使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变，关键是控制DNA的突变频率Mg2+和Mn2+提高；dNTP比例改变DNA Shuffling等基本原理：先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝引物时，引起模板转换，重
14、组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。一般通过23个循环，得到产物大幅度提高的重组突变体。DNA shuffling分子水平的体外定向进化技术Genome shuffling细胞水平的体内定向进化技术优良生产菌种应具备的基本特性1）有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强。2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产品及其它产物。3）生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力。4）产品成本低。能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物5）有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。6）对需
15、要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。7）不易感染它种微生物或噬菌体。8）生产特性要符合工艺要求。如发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义。9）遗传性能相对稳定。10）生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）。影响微生物菌种稳定性的因素：变异；污染；死亡菌种的衰退(degenration) 变异有正变（自发突变）和负变两种，负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。 衰退的表现1）原有形态形状变得不典型；2）生长速度变慢；3）代谢产物生产能力下降；4）对外界不良环境的抵抗力下降。 菌种退化现象：菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越
