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1、CTAB法提甜瓜DNA（1）从-80取出甜瓜叶片（约0.5g）放入预冷的研钵中，加液氮充分研磨成粉，研磨34次；（2）将粉末转至10ml无菌离心管中，加入60预热的2CTAB缓冲液4ml，上下颠倒混匀，60水浴25至60min，每隔5至8min颠倒混匀一次；（3）取出离心管冷至室温（约需46min），加入5ml的氯仿/异戊醇（241），颠倒80次混匀，室温（25）下5000r/min离心10min。（4）小心吸取上清3.6ml至另一离心管中，加4ml氯仿/异戊醇（241），颠倒80次混匀，室温（25）下5000r/min离心10min；（5）小心吸取上清2.7ml至另一离心管中，加入1/2体积
2、5mol/L NaCl，再加入2倍体积-20预冷的95%乙醇，颠倒80次混匀，-20下静置10min；（6）4，5000r/min离心10min，小心弃去上清；（7）加入4预冷的70%乙醇3ml，颠倒混匀以洗涤沉淀（可于-20放置一段时间），5000r/min离心5min，小心弃尽上清，室温下于通风橱中晾干；（8）将沉淀溶于400l TE缓冲液中，转至1.5ml EP管中，加入3l Rnase A（1mg/ml），37水浴30min；（可先混好后一次性加）（9）加入200l的饱和酚和200l的氯仿/异戊醇（241），颠倒80次混匀，室温，13000r/min离心10min； （10）小心吸取上
3、清300l于另一1.5ml EP管中，加入1/10体积3mol/L NaAc（PH5.2）和2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-80静置过夜，4，13000 r/min离心10min，小心弃去上清；（11）加1ml 4预冷的70%乙醇，室温静置10min，洗涤沉淀；（12）5000 r/min离心2min，弃尽上清，室温凉干；（13）加入100lTE溶液（可加80150lTE），充分溶解沉淀。（14）稀释一定倍数后取1l，120v，0.7%琼脂糖电泳12min检测DNA质量和浓度，加2ul Maeker15000作对照。试剂2CTAB提取缓冲液：2%CTAB；100mmol/L Tris-HCl，p
4、H=8.0；20mmol/L EDTA，pH=8.0；1.4mol/L NaCl；0.3%-巯基乙醇（使用前加）；1 %PVP40。氯仿/异戊醇：2415mol/L NaCl：蒸馏水配制，高压灭菌。无水乙醇95%乙醇70%乙醇RNase A：按说明配制成1mg/ml的溶液。TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH=8.0；1mmol/L EDTA，pH=8.0；双蒸水配制。3mol/L NaAc：双蒸水配制，用乙酸调pH5.2，高压灭菌。原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂, 溶解细胞膜，具有
5、从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素，蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+
6、或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖； 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等。加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合； 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白
7、酶处理核酸分离，纯化； 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化； 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或
8、沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。若长期储存建议使用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase。pH值为8.0，可防止DNA酸解。基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。（1）DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作
9、过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。（2）DNA降解，DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分，吸附或沉淀不完全，洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料，动植物要匀浆研磨充分；G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。
