可溶性糖测定

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1、引言可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之 一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品 质的重要因素。对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风 味淡，品质差。因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有 重要意义。而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要 来源，具有较高的营养价值。本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、 原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定 量测定可溶性糖含量。1蒽酮比色法1.1原理糖在硫酸作用下

2、生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含 量有关。在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强 度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。1.2仪器与材料1.2.1实验仪器分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。1.2.2实验试剂（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中， 在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。（2）浓硫酸（比重1.84）。1.2.3实验材料植物叶片。1.3实验方法1.3.1标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从010分

3、别编号，按表24-1加入溶液和水。表1各试管加溶液和水的量管号01、23、45、67、89、10100 M g/ml蔗糖液 (ml)00.20.40.60.81.0水(ml)2.01.81.61.41.21.0蔗糖量（M g）020406080100然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸， 摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方 程。按表1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和 5ml浓硫酸，

4、充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1 min，取出后自然 冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含 量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。1.3.2可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g，共3份，或干材料。 分别放入3支刻度试管中，加入510ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min (提取2次)，提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。1.3.3显色测定吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5ml，以下步 骤与标准曲线测定相同，测定样

5、品的光密度。1.3.4结果计算可溶性糖含量(mg/g)=(从回归方程求得糖量/吸取样品液的体积)X提取液量X 稀释倍数：样品干重X10-62铜还原碘量法2.1原理试剂中的Cu2+与还原糖作用，生成氧化亚铜(Cu2O)沉淀。加入H2SO4后，氧化亚铜 溶解生成Cu+，试剂中的KIO3与KI在酸化的同是生成I2。KIO+5KI+3H SO -3K SO+3H O+3T 然后 Cu+被 T 氧化，2Cu+L -2Cu+ + 2I32 42 422，2溶液中剩余的碘以淀粉为指示剂 用 Na S O 标准溶液滴定. Na S O + I I I 乂 I小 J 刀、1-1 J ”、刀 /刀，八6少02/|

6、勺 I1 I 乂 1 |RJ /t ：1、aryo f七 七 。七Na2S2O6 + 2NaI同时以水代替样试液做空白滴定，将空白与样品的滴定差值带入由滴定标准系列糖 液计算的回归方程中，即可求得所求试样中还原糖的含量。2.2仪器与试剂2.2.1实验试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB / T 6682规定的至少三级水。氢氧化钠溶液碱性铜试剂，盐酸溶液c(HCl)=1mol/L，亚铁氤化钾溶液wK4Fe (CN) 6H2O=15%，硫酸锌溶液w(ZnSO4 7H2O) 6 H2O=30%，硫酸+草酸混 合液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠工作溶液c (Na2S2O3) =0.005mo

7、l/L，淀粉指示 剂，酚酞指示剂，氢氧化钠溶液c (NaOH) =0.5mol/L，葡萄糖标准液。2.2.2仪器和设备分析天平，高速组织捣碎机，电磁炉、可调温电炉或恒温水浴锅，25mL滴定管， (酸式、减式皆可)，鼓风干燥箱。2.3实验方法2.3.1样品制备(1) 新鲜样品：取有代表性的样品，洗净，把水吸干，用四分法取样，切碎，混 匀，用组织捣碎机匀浆。黄瓜，番茄等多汁蔬菜可直接制成匀浆。其他样品蔬菜可称取 切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆，韭菜等水分较少的蔬菜可称取切碎 混匀的样品100.0g，加入200mL水制成匀浆。去相当于10g样品的匀浆，精确到0.01g， 用水洗

8、入100mL容量瓶(V1)中，加入亚铁氤化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL (如菜豆 累高蛋白蔬菜可加入2mL)。摇匀后定容，放置片刻，等沉淀分离后过滤备用。(2) 干制品：将样品至于63C67C鼓风干燥后，用粉碎机粉碎，过0.5mm筛。 去1.00g2.00g粉碎的样品防雨烧杯中，加入少量水湿润，用水洗入100mL容量瓶中， 用沸水浴加热10min，冷却后，加入亚铁氤化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL，摇匀后定容， 过滤后备用。(3) 制品各种酱腌菜：去切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆。蔬 菜罐头可直接制取匀浆，操作步骤同5.1。番茄酱混匀后，可直接制取5.00g样品用水洗 入100

9、mL容量瓶同5.1操作。蔬菜汁称取混匀的样品20.00g用水洗入100mL容量瓶同 5.1操作。2.3.2还原糖的鉴定(1) 标准曲线的制作：用移液管吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的葡萄糖标 准液与100mL锥形瓶中，或200mmX25mm的试管中，各加水至5.0mL，加入5mL的 铜试剂，锥形瓶或试管口上加小漏斗，用相应的架子固定，置于沸水浴中加热15min。 取出后立即置于冷水中，冷却至25C到30C。将加盖小漏斗更换为表面皿(不可摇动)。 加入2mL硫酸+草酸的混合液，立即摇动，使氢氧化亚铜完全溶解。用硫代硫酸钠工作 溶液滴定至浅黄绿色时，加入约0.5mL的淀粉指示剂

10、，滴定至蓝色消失为终点。以糖的 含量(mg)为y，空白与糖液滴定差值为x，计算回归方程y=bx+a并计算出a和b的值。 标准曲线于没新配一次铜试剂和硫代硫酸钠储备液制备一次即可。(2) 试样还原糖的测定：根据不同样品中糖的含量，用移液管吸取5mL10mL(V2) 与50mL或100mL(V3)于容量瓶中.用水定容(含糖量低的样品不作次稀释处理)。从容量 瓶中吸取5.00mL (V5)与锥形瓶或试管中，加入5.00mL的铜试剂。以下按6.1.1标准 曲线的制作步骤操作。记录滴定值(V4)。同时以水代替试样作空白(可不加热)。将试 样与空白滴定差值带入回归方程即可算出试样中还原糖的含量。如试样与铜

11、试剂加热反 应后，砖红色氧化亚铜的含量较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取1mL 4mL样液，加水至5.00mL测定。滴定值应不少于标准曲线的最高点。(3) 试样可溶性总糖测定：用移液管吸取5mL10mL与50mL或100mL于容量 瓶中，加入1mL的盐酸溶液，置于沸水浴中加热10min，冷却，加入酚酞试剂12滴， 用约0.5mol/L氢氧化钠溶液中和至红色，再用稀盐酸调定红色刚刚消失，定容。以下 按还原糖步骤操作E。2.3.3结果计算试样中可溶性总糖的的含量以质量分数w1计，单位以百分率(%)表示，计算式 如下：W1=a+b(V0-V4) XV1X V3/V2 XV5XmX 1000

12、3费林试剂法3.1原理在沸热条件下，用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时将费林试剂中的二价铜还原 为一价铜，以亚甲基蓝为指示剂,稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无 色的还原型亚甲基蓝。3.2仪器与试剂3.2.1仪器设备高速组织捣碎机，电热恒温水浴，1000W调温电炉，200ml,250ml容量瓶，250ml 锥形瓶，50ml碱式滴定管。3.2.2实验试剂(1) 费林试剂甲：称取硫酸铜(CuSO45H2O,分析纯)34.6g溶于水中，稀释至500ml， 过滤，贮于棕色瓶内。(2) 费林试剂乙：称取氢氧化钠50g和酒石酸钾钠(KNaC4O6H4.4H2O,分析纯)138g 溶于水中，稀

13、释至500ml，用石棉垫漏斗抽滤。(3) 转化糖标准溶液：称取9.5g蔗糖(分析纯)用水溶解后转入1000ml容量瓶中，加 入6MHCl(分析纯)10ml,加水至100ml。在2025C下放置三天或在25C保温24h，然 后用水定容(此为酸化的1%转化糖液,可保存34个月)。测定时，取1%转化糖液 25.00ml放入250ml容量瓶中,加入甲基红指示剂一滴，用1MNaOH溶液中和后用水定 容，即为1mg/ml转化糖标准溶液。(4) 亚甲基蓝溶液：称取0.5g亚甲基蓝(分析纯)溶于100ml水中。(5) 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌Zn(OAC)2.2H2O，分析纯溶于水中，加冰 乙酸3ml

14、，稀释至100ml。(6) 亚铁氤化钾溶液：称取10.6g亚铁氤化钾】K4Fe(CN)63H2O,分析纯溶于水， 稀释至100ml。3.3实验方法3.3.1样品提取液制备取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分 法取样。称取100g鲜样加入等重量的水，放入组织捣碎机中捣成1:1匀浆，有些材料 匀浆比例可适当调整，多汁果蔬类可直接捣浆。称取匀浆25.0或50.0g(相当于样品12.5 或25.0g)放入150ml烧杯中，含有机酸较多的材料加0.52.0g粉状CaCO3调至中性(广 范试纸检试)。用水将样液全部转入250ml容量瓶中，并调整体积约为200ml。置80

15、2C 第4页水浴保温30min，其间摇动数次，取出加入乙酸锌溶液及亚铁氤化钾溶液各25ml,冷 却至室温后，用水定容，过滤备用。3.3.2可溶性糖测定(1) 费林试剂的标定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或在测定前先等体积混合后取 10.00ml混合液于250ml锥形瓶中，放入玻璃珠45粒，先加入比预测(按6.2进行预测) 仅少0.5ml的1mg/ml转化糖标准液。将此混合液置1000W电炉上加热,使其在2min 左右沸腾，准确煮沸2min,此时不离开电炉,立即加入0.5%亚甲基蓝指示剂6滴,并继续 以每45s的滴速滴加标准糖液，直至二价铜离子完全被还原生成砖红色氧化亚铜沉淀, 溶液蓝色褪尽为终点。用准确滴定标准糖液的毫升数V1,乘以标准糖液浓度mg/ml, 即得10ml费林试剂所相当的糖的毫克数。取已经制备的待测液100ml于200ml容量 瓶中，加6MHCl10ml。在802C水浴加热10min,放入冷水槽中冷却后，加甲基红指示剂 二滴用6M及1MNaOH溶液中和，用水定容。(2) 预测：取费林试剂甲、乙各5.00ml或10.00ml混合液于250ml锥形瓶中,，滴定 管加入待测糖液约15ml,在电炉上加热至沸，约沸15s后迅