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1、玉米白化苗的基因克隆与功能验证一、确定是核遗传还是质遗传 将亲本植株进行正反交实验：若正反交实验结果相同，即不论正交反交，F1代中均有白化苗出现，则白化性状由核 基因控制；若正反交实验结果不同，则白化性状由质基因控制。二、确定是单基因控制还是多基因控制将以获得的F7代种子种植，让表现型正常的玉米植株自交，得F8代种子。种植F8代种子， 观察幼苗的表现型，并记录实验结果，计算表型比：若白化型：正常型=1：3，则白化性状是由单基因控制的隐性遗传；若白化型与正常型 的比例不符合3：1，则白化性状是由多基因控制。三、定位目的基因方案A、全基因组扫描法利用微卫星标记，通过PCR利用特定序列的引物可将某条
2、染色体上特定位置的STR扩 增出来进行分析，探测在它周围是否存在与白化性状相连锁的相关基因。通过研究均匀分布 于整个基因组的微卫星标记来间接筛查其相关的基因。在得到阳性结果后，又可在这些阳性 位置附近在加密微卫星标记，用同样的方法来确定哪一个与突变基因连锁的可能性最大，这 样在不断缩小分析范围后，相关基因定位的范围也越来越明确，当目标基因的定位精确度达 到约 1cM 时，采用或是直接在该区域进行大规模测序，找到候选基因后在该白化性状及正 常植株中进行突变筛选；或选择与该白化表型呈连锁关系的微卫星位点作为标记筛选入基因 文库，以阳性克隆的DNA为探针筛选cDNA文库，对阳性cDNA克隆进行测序并
3、进行致病 基因突变最终筛选查出该性状的相关基因。方案B、基因组测序利用荧光毛细管电泳技术分别测定白化幼苗与正常幼苗两种表现型的玉米10对20条染 色体的 DNA 序列，并将两种表现型的玉米全基因组的核苷酸序列进行整体比对，从而确定 控制白化性状的基因位于某一条染色体的具体位置方案 C、 DNA 介导基因定位以标记（同位素、生物素或荧光染料）的DNA探针与白化幼苗中的染色体进行分子杂 交，杂交结果显示的标记处即为探针与染色体上目的基因片段结合位置。即可确定致病基因 的具体位置。方案D、引入第三方利用有明显性状的纯种植株杂交，得到的杂合子再进行自交，确定突变基因位于哪条染 色体上。利用染色体显微切
4、割技术在显微镜下切割特定的染色体区带，制备染色体区带特异 探针，对正常和突变植株作FISH分析，比较确定控制白化相关基因在染色体区带定位。四、目的基因的克隆与功能验证 方案A、图位克隆法分离目的基因根据目标基因在染色体上的确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选 BAC 克隆， 通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA 表达子库，寻找候选基因，得到候选基因后再进行如下分析确定目标基因。精确定位法确定该cDNA是否与目标基因共分离b、该基因的时空表达特点是否与表型一致 c、根据cDNA序列，通过生物信息或数据库了解该基因可能的功能d、筛选突变体子库，
5、 找出DNA序列上的变化与功能关系e、进行功能互补试验，通过转化突变体观察其表现型 是否恢复正常f、利用RNAi技术确定其功能方案 B、 TDNA 标签和转座子标签法分离目的基因利用转座子或T-DNA插入由基因组中某一基因失活或缺失而产生突变体中，然后用相 应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，通过反向PCR直接找到TDNA和转座子 的插入位点附近的DNA序列，以选到的这种阳性克隆片段为探针，筛选白化型植株的基因 cDNA文库，分离出其编码的基因cDNA，进一步筛选基因文库得到带有同源转位因子的目 的基因。五、意义 通过基因工程技术改造玉米的基因库，使控制白化性状的基因不表达，这样在育种过程 中能减少不必要的人力和肥料等的浪费。
