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1、基因工程1基因工程的基本工具1）用来切割目的基因和载体的工具：限制性核算内切酶。 可是 DNA分子中某特定核苷酸序列的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键 断裂。限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 黏性末端和平末端 。2）将切下来的 DNA片段拼接成新的 DNA分子靠 DNA连接酶完成。根据来源不同分为： EcoliDNA 连接酶： 连接黏性末端； T4DNA连接酶： 连接黏性末端和平末端3） 将目的基因送入受体细胞的载体有：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。2基因工程的操作程序(1) 目的基因的获取从基因文库中获取。利用 PCR技术扩增： PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等
2、条件。人工化学方法合成：已知 mRNA序列，利用反转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在 逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在 DNA聚合酶 的作用下，合成双链DNA分子；已知蛋白质的功能根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序 ，通过化学方法合成。(2) 基因表达载体的构建（基因工程的核心）基因表达载体的构建方法用同种限制酶切割目的基因和载体的目的：让切割得到的目的基因和载体含有相同的粘性末端 。基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因复制原点。启动子：位于基因的
3、首段， 是 RNA聚合酶识别和结合的部位。标记基因 ：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 。（3）将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法导入动物细胞： 显微注射技术导入微生物：感受态细胞法（Ga2+处理法）Ga2+处理大肠杆菌的目的： 使细胞处于感受态，更容易吸收周围环境中的外源DNA分子(4) 目的基因的检测与鉴定1）检测目的基因是否进入受体细胞：DNA分子杂交 (DNA和 DNA之间 )2）检测目的基因是否转录出：分子杂交技术(DNA和 mRNA之间 )3）检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原抗体杂交细胞工程1、植物组织培养技术
4、(1) 原理：离体植物细胞通过 脱分化形成愈伤组织，通过再分化 形成具有根和芽的试管幼苗或胚状体， 再通过细胞分裂、分化发育成一个完整的植株。该技术称为植物组织培养，其原理为植物细胞的全能性 。(2) 已分化的细胞仍具有发育成完整植株的潜能，是因为： 细胞内含有本物种全部的遗传信息。(2) 细胞全能性表达的条件： 完整细胞核、离体、无菌、一定的营养、激素 和其他适宜的外界条件。(3) 全能性大小：植物细胞：受精卵 生殖细胞 体细胞。动物细胞：受精卵 生殖细胞 胚胎干细胞 体细胞核 ( 动物细胞全能性受限制，但细胞核具有全能性) 。（ 4）培养基的成分为水、无机盐、维生素、氨基酸、蔗糖、植物激素
5、 ( 生长素和细胞分裂素 等) 等；培养基要求进行严格的灭菌。（ 5）通过植物组织培养技术进行繁殖的方式属于 无性繁殖2、植物体细胞杂交技术（ 1）如图，植物细胞 A 和植物细胞 B 在进行杂交之前，必须先利用 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得具有活力的 原生质体 。（ 2）原生质体 A 和原生质体 B 的融合必须要进行人工诱导。人工诱导方法有两大类：物理方法（离心、震动、电击等）和化学方法（ 聚乙二醇 ）（ 3）原生质体完成融合的标志：再生出新的细胞壁 。（ 4）植物体细胞杂交包含植物细胞融合和杂种细胞的植物组织培养两个过程。其最终结果是形成杂种植株，因此其原理是： 细胞膜的流动性和植物细胞
6、的全能性。（ 5）植物体细胞杂交的意义： 克服了远缘杂交不亲和的障碍3、动物细胞培养动物细胞培养的特殊条件归纳(1) 胰蛋白酶的使用：首先用胰蛋白酶 处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为 细胞贴壁 。培养过程中细胞铺满瓶壁、细胞表面相互接触时就会停止生长， 出现接触抑制 现象，此时，同样需要用 胰蛋白酶 使细胞分散开。(2) 避免杂菌污染的措施： 培养液及培养用具灭菌处理； 加入一定量的 抗生素 ；定期更换培养液。(3) 特殊的营养条件：液体培养基。加入 动物血清 、血浆等。（血清含促细胞生长因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖。）通入氧气以满
7、足代谢的需要。通入二氧化碳以维持培养液的pH。4、动物细胞核移植和克隆动物(1) 原理：细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了动物细胞核的全能性 和细胞膜的流动性 。而非动物细胞的全能性。(2) 种类：动物细胞核移植技术可分为胚胎细胞核移植技术和 体细胞核移植技术，前者比较容易。（ 3）克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与 供核亲本 一致。（ 因为控制生物性状的遗传物质主要分布在细胞核中。）（ 4）材料：供体细胞：发育良好的动物胚胎细胞或体细胞受体细胞： 减数第二次分裂中期的次级卵母细胞 。（原因： a. 卵母细胞之内存在激发细胞核全能性表达的物质； b. 卵母细胞
8、体积大，便于操作； c. 卵黄多，营养物质丰富。）(5) 核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同的原因：克隆动物绝大部分 DNA来自于供体细胞核，但其线粒体中的 DNA来自于去核卵细胞。性状受基因与环境共同影响。在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。5、动物细胞的融合（ 1）原理：动物细胞融合形成杂交细胞，杂交细胞进行细胞培养，获得大量的克隆细胞，但没有形成生物体，因此动物细胞融合的原理是细胞增殖和细胞膜的流动性， 不包含细胞全能性。(2) 进行动物细胞的诱导融合，形成的杂种细胞有三种： AA型、 BB型、AB型。只有 AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要用选择
9、性培养基进行筛选。(3) 相比植物体细胞杂交，动物细胞融合特有的诱导方法是用 灭活的病毒 处理，其他物理、化学诱导融合的手段与植物体细胞杂交过程中原生质体诱导融合的方法相同。（ 4）动物细胞融合的意义： 克服了远缘杂交的不亲和性 。6、单克隆抗体的制备(1) 原理：一个 ( 或一种 ) 浆细胞 ( 效应 B 细胞、 B 淋巴细胞 ) 只产生一种抗体，小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖。因此杂交瘤细胞就具备了既能无限增值 ，又能大量产生 单一抗体 的特征。(2) 培养方法：体内培养和体外培养。(3) 单克隆抗体的主要优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备 。 特别提醒 (1) 取相应 B 淋巴细胞前必须
10、先注射 相应抗原 ，否则不能获得单克隆抗体。(2) 细胞融合后需经两次筛选第一次：在特定的选择性培养基上，未融合的亲本细胞 (B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞 ) 和融合的具有同种核的细胞 (B 淋巴 B 淋巴融合细胞、 骨髓瘤骨髓瘤融合细胞 ) 都会死亡，只有融合的杂种细胞 ( 杂交瘤细胞 ) 才能生长。这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖，又能产生单一的特异性抗体。第二次：经选下面是将某细菌的基因A 导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。择性培养的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞( 很多种杂交瘤细胞 ) ，需经克隆化培养和抗体检测，经筛选后才可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。（ 4）过
11、程：请据图回答：(1) 获得 A 有两条途径：一是以A 的 mRNA为模板，在 _的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 _作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的 mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的 _序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用 PCR技术扩增 DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4 种脱氧核苷酸和耐热性的 DNA聚合酶，扩增过程可以在 PCR扩增仪中完成。(3)由 A 和载体 B 拼接形成的 C 通常称为。(4)在基因工程中，常用 Ca2 处理 D，其目的是。题组一从植物细胞工程进行命题1植物叶肉细
12、胞原生质体的分离和培养的主要过程可用下图所示图解简单表示：ab叶片原生质体悬液纯净的原生质体洗净、灭菌、切条、酶解过滤、离心cde愈伤组织 胚状体 植株培养基中培养(1) 培育胚状体利用了 _这一项生物技术，胚状体再继续培养，则可培育出完整的植株，这体现了 _。培养基中除了含有一定的营养外，还必须含有 _等植物激素，还需要对培养基进行严格的_。(2) 如果愈伤组织是三七叶肉细胞培养产生的，若为了获得三七的细胞产物，则只需要培养到 _；若 为了获 得三七的 人工种子， 则需要 培养到_。如果愈伤组织是棉花叶肉细胞培养产生的，通过基因工程要获取抗虫棉，目的基因导入棉花愈伤组织细胞常用的方法是_法。(3)从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，必须要经过_。无丝分裂有丝分裂减数分裂原代培养传代培养植物体细胞杂交细胞融合脱分化再分化2下图是细胞融合示意图，请据图回答下列问题：(1) 过程应使用处理细胞，以去除植物细胞壁。(2) 如果将已去除细胞壁的植物细胞放入等渗溶液中，细胞呈现什么形状？_。(3) 过程的诱导方法有 _和_两大类。(4) 过程是细胞壁的再生过程，与此过程密切相关的细胞器是_。(5) 过程中进行的细胞分裂方式是 _，该过程先诱导细胞分裂形成_
