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1、文档供参考，可复制、编制，期待您的好评与关注！ 2012-07-10 14:41多西他赛与吉非替尼对人肺癌细胞的作用 来源：http:/多西他赛和吉非替尼均是晚期非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer, NSCLC)的一线和二线治疗药物，日前两者疗效都达平台期。除寻找新的靶向治疗靶点外，如何进一步提高化疗和表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EG FR-TKIs)的疗效是晚期NSCLC面临的问题。化疗药物与EGFR-TKIs作用的机制不同，理论上两者同时应用可能有增效作用。细胞学研究显示，EG FR-TKIs联合化疗药物能明显增强对NSCLC细胞生长的抑制作用，起到“1
2、+12”的作用川。但是，多项大型临床研究INTACTl 2 ,INTACT23、TRIBUTE4和TALENTS均显示EGFR-TKIs与化疗同时作用在有效率及生存期方面并未优于单独化疗，且无疾病进展时间和疾病控制率未能提高。上述结果引发了两个问题:(1)对于EGFR-TKIs与化疗同时使用是否一也存“优势人群”了例如TRIBUTE研究中EGFR突变患者采用化疗联合厄洛替尼的有效率显著高于野生型( 53 % vs. 18 % , P = 0. 012 ) ( 2 ) EGFR-TII与化疗序贯应用是否具增效作用，序贯应用增效作用是否也存在“优势人群”了日本的WJTOG0203 III期临床试验
3、证实，先化疗后序贯吉非替尼能够提高肺腺癌患者的总生存时间6es。说明化疗联合EGFR-TKIs的增效作用不仅与用药顺序有关，还可能与NSCLC细胞EGFR突变状况有关。因此，本研究的第一个日的是通过观察多西他赛和吉非替尼不同顺序用药对EGFR野生型和EGFR突变型细胞生长的影响，寻找NSCLC细胞不同EGFR突变状况的最佳给药方式。化疗与EG FR-TKIs二者联合应用增效与否的细胞学机制不明。既往研究显示，化疗同时应用EGFR-TKIs不增效的原因可能与细胞周期有关,H 化疗后序贯应用EGFR-TKIs产生协同增效作用可能与EGFR磷酸化有关91。近年的研究表明胰岛素样生长因子受体1( IG
4、F-1 R)亦可通过细胞内信号蛋自PI3 K/AKT影响细胞对化疗及EG FR-TKIs敏感性i o-i i 。因此，本研究的第二个日的旨在通过检测多西他赛与吉非替尼不同时序应用对EGFR野生型和突变型肺腺癌细胞的EGFR , IGF-1 R、下游信号蛋自表达磷酸化影响及细胞周期变化，寻找可能的细胞学机制。材料与方法1. 1材料人肺腺癌A549细胞由中科院上海细胞生物研究所提供，PC-9细胞由日本国立癌症中心小泉史明博士惠赠 z。四甲基偶氮哩盐3- ( 4 , 5-dime-thvlthiazol-2-vl)-2，5-diphenvl-tetrazolium bromide，MTT、二甲基亚矾
5、( DMSO)购自Sigma公司。吉非替尼和多西他赛分别由阿斯利康制药有限公司及江苏恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5 x 10-3mo1/L-20保存。胞外调节蛋自激酶(ERI1/2)一抗、蛋自激酶B ( AKT)一抗、IGF-1 R一抗、内参(3-actin ) ,磷酸化表皮生长因子受体(p-EG FR)一抗、磷酸化蛋自激酶B ( p-AKT)一抗、磷酸化胰岛素样生长因子受体1( p-IGF-1 R)一抗以及p-ERKl /2均购自Cell Signa-ling公司，表皮生长因子受体(EGFR)一抗购自SantaCruz公司，兔源及鼠源二抗购自Cell Signaling公司，BCA试剂
6、盒购自Pirce公司。ECL化学发光试剂盒购自GE Healthcare公司。DNA提取试剂盒购自天根生物公司。电泳仪及化学发光成像系统购自Bio-Rad公司，酶联免疫检测仪购自Bioce112010公司。流式细胞检测盒购自碧云天公司，流式细胞仪购自BeckmanCoulter公司。1. 2细胞培养人肺腺癌细胞A549和PC-9置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 ( Gibc。公司)培养液，370a ,5% a02培养箱中培养，细胞单层贴壁生长。实验取用生长状态良好的对数生长期细胞，胰酶消化传代，收集备用。1. 3 A549 ,Pa-9细胞的EGFR和K-Ras基因突变检测将处于对数生长
7、期的细胞，胰酶消化，离心重悬后按基因组DNA提取试剂(TIANGEN)说明操作提取DNA。分别取A549,Pa-9细胞DNA产物8闪进行电泳，1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。细胞EGFR及K-Ras突变检测送苏州为真生物医药有限公司，采用高分辨率溶解曲线分析技术(quantitativePCR high-resolution melting,qPCR-HRM)完成。1. 4四甲基偶氮哇盐( MTT)法检测药物对A549,Pa -9细胞生长作用影响取对数生长的细胞，接种至96孔培养板，A549 100()个细胞，Pa-9 200()个。每组4个平行复孔，细胞贴壁后，再按实验要求分别加人10
8、0闪含有不同浓度的多西他赛或吉非替尼的培养基，按实验设计时间换含有不同药物的培养基。每孔加MTT 20,1(Sg/L)，孵育4h后弃上清，加人150,1 DMSO，振荡15 min后酶标仪测定492 nm波长下各孔吸光值(A)，计算细胞抑制率和半数抑制浓度(IaSO。实验分组:PBS对照组(a、多西他赛单独作用72h组(D)、吉非替尼单独作用72h组( G) ,多西他赛作用24h序贯吉非替尼48h组( DG)、吉非替尼作用48h序贯多西他赛作用24h组(GD)和同时给药72h组(D+G)，实验重复3次。抑制率=100%一(用药组A值一空自对照A值)/(阴性对照组A值一空自对照A值)。1. 5
9、Western hlottin。检测细胞信号蛋白细胞按上述分组给药处理后，将原培养基连同胰酶消化下的细胞离心，冷PBS洗涤3次，加人含有蛋自酶抑制剂和磷酸化蛋自酶抑制剂的裂解液，冰上提取蛋自，BCA法测定蛋自浓度，等量上样，10% SDS-PAGE电泳，转膜，5%牛血清自蛋自封闭2h，一抗(1:40()一1000 ) 4 0C摇床孵育过夜，TBST洗膜lOmin x3次，二抗(1 : 2000)室温摇床孵育1h, TBST洗膜l Omin x 3次，ECL显色后化学发光成像系统成像。以Band Scan图像分析软件进行A值分析。1. 6流式细胞术检测细胞周期变化取生长状态良好的对数生长期A54
10、9细胞及PC-9细胞接种于30cm2的培养皿中。A549接种1 x 10个，PC -9接种2x10个。按上述分组给药，消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用碧云天流式细胞试剂盒提取和DNA染色，流式细胞仪测细胞周期，Ce11Fit软件进行细胞周期分布的测定;实验重复3次。1.7统计学分析采用SPSS 13. 0软件分析，数据用均数士标准差表示，多组间计量资料用单因素方差分析。以P 0. OS为差异具有统计学意义。2结果2. 1肺腺癌细胞EGFR和K-Ras基因表达采用qPCR-HRM对人肺腺癌A549 , PC-9细胞的EGFR基因18,19,20,21外显子和K-Ras基因2 ,3外显子进行突变
11、检测。结果显示，A549细胞的EGFR基因无突变，K-Ras基因第2外显子突变。PC-9细胞的EGFR基因第19外显子突变，K-Ras基因无突变。2. 2多西他赛与吉非替尼对肺腺癌细胞生长的影响正常培养的两株肺腺癌细胞生长均呈无限繁殖，A549细胞第2天进人对数生长期，PC-9细胞第3天进人对数生长期。多西他赛和吉非替尼单药或联合用药均能抑制A549和PC-9细胞生长，呈浓度依赖性。多西他赛和吉非替尼作用72h抑制A549细胞生长的ICS分)I为5. 24 x 10 - mol/L和1. 28 x 10-5mo1/L(P 0. OS)，抑制PC-9细胞生长的ICS分别为2. 13x 1()一“
12、mol/L和4. 58 x 1()一“mol/L。见图图1不同浓度吉非替尼和多西他赛对A549和PC-9细胞生长的影响分别取多西他赛和吉非替尼的ICSc作为固定浓度，按上述分组方法研究不同给药方式下两药对A549和PC -9细胞的抑制作用。结果显示，相比D,G组，DG组对A549和PC -9细胞的生长抑制作用均明显增强(P 0.05)，抑制率分别为60. 0%和57.45% (D+G)组只对EGFR突变型的PC -9细胞的生长抑制有增效作用，抑制率为53. 46%，较单药组明显增高(P 0.05);在EGFR野生型的A549细胞中，(D+G)组的抑制率为48. 25 %，与D,G组无明显差异。
13、而GD组对A549和PC-9细胞的抑制率均无明显的协同增效作用，抑制率分别为46. 46%和46. 59 0o。见表1。)2. 3多西他赛与吉非替尼不同时序应用对细胞EGFR,ERK,AKT, IGF-1 R表达及其磷酸化的影响单药多西他赛增强A549和PC-9细胞EGFR和ERK磷酸化，单药吉非替尼抑制A549和PC-9细胞EGFR和ERK磷酸化，多西他赛诱导EGFR和ERK磷酸化被序贯应用吉非替尼显著抑制，但不能被同时应用吉非替尼抑制。吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用不能被应用多西他赛逆转。多西他赛与吉非替尼不同时序应用对A549和PC -9细胞的AKT及其磷酸化均无明显影响。单药多
14、西他赛抑制A549细胞IG F-1 R表达及其磷酸化，单药吉非替尼增强A549细胞IG F-1 R表达及其磷酸化。两药联合对PC-9细胞的IG F-1 R表达无影响，但均抑制IG F-1 R磷酸化。两药同时应用对抑制PC-9的细胞IGF-1 R磷酸化具增强作用，对A549细胞IGF-1R磷酸化无明显影响。见图22. 4多西他赛与吉非替尼不同应用对细胞周期的影响对于A549细胞，G组未引起明显的细胞周期变化，D组可引起明显的G期阻滞，由C组的6. 63%上升为49.58%(P0.05) DG组有明显的图2吉非替尼和多西他赛同时及序贯应用对A549和PC-9细胞信号蛋白表达的影响GZ期阻滞，较C组
15、上升约54.11%(P0.05) (D+G)组和GD组各期细胞无明显变化。对于PC -9细胞，G组可引起明显的G,/G，期阻滞，G,/G，期细胞较C组上升29.96% (P 0. OS) D组可引起明显的GZ期阻滞，较C组上升30.13% (P0.05)DG组可见明显的G:期阻滞，较C组上升40. 77 %(P0.05) (D+G)组和GD组与C组相比，细胞周期变化不明显，味/G，期细胞比例提高13. 27%和17. 10%。见图3 3讨论本研究结果显示，人肺腺癌细胞A549细胞为EGFR野生型，K-Ras基因突变型;PC-9细胞为EG-FR突变型，K-Ras基因野生型。细胞生长实验显示A549和PC-9细胞分别为吉非替尼耐药型和敏感型，其ICSc分)I为1. 28 x 1()一5 mol/L和4. 58 X 1()一smol/L，对吉非替尼的敏感性相差1000倍，结果与既往报道的一致3141。基于临床研究显示化疗与EG-FR-TKIs同时或序贯应用可能存在“优势人群”，而这种“优势人群”可能源于EGFR突变状况，我们同时选用EGFR野生型的A549细胞和EGFR突变型的PC-9细胞进行研究并从细胞信号传导蛋自和细胞周期对其可能的细胞学机制进行探讨。Cappuzzo等 ISO报道的SATURN研
