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1、异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察简月奎，李起鸿，刘雷，杨柳【摘要】目的讨论异种脱蛋白骨(hetergeneusdeprtEinbne，HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究，为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验根据。方法山羊24只，在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20形成节段性骨缺损，实验组18只，植入异种DPB+自体Ss+rhBP2，用半环槽式外固定器固定。于术后每隔4周对3只进展股动脉墨汁灌注后处死，取新骨组织制成厚切片观察血管化情况，以另6只植入自体骨为对照。结果术后424周，实验组与对照组血管表现数目逐渐增多，排列渐趋规那么，血管大孝分布区域趋向均匀。测量血管数
2、目和面积，结果显示424周2组血管数目和面积统计学分析差异无显著性意义(P0.05)。结论异种脱蛋白骨复合物修复大动物大块骨缺损过程中血管化程度与自体骨相当，可以作为组织工程支架材料，并对其免疫原性和成骨才能等性能进展进一步研究。【关键词】异种脱蛋白骨；骨缺损；血管化；骨组织工程1材料与方法1.1主要仪器和试剂市售猪股骨;市售墨汁；20%甘露醇(西南药业公司)；10甲醛、浓盐酸、三氯化铁(重庆化学试剂厂)；半环槽式外固定器(第三军医大学李起鸿教授研制)；超低温冰箱(NUAIR，USA)；速眠新(军事医学科学院军事兽医研究所)；肝素钠(天津生化制剂厂)；氯胺酮(江苏恒瑞医药股份)。1.2异种DP
3、B的制备参照改进法2制备，将制备的猪DPB放入-80超低温冰箱冷冻3个月后取出，在-700Hg真空下包装，60照射后置-4保存。DPB于术前浸入含rhBP2浓度为75ngl3溶液中2h备用。1.3实验动物分组山羊(第三军医大学动物实验中心提供)，1012个月龄，雌雄不限，分笼喂养，体重(22.52.5)kg。随机均分2组，按植入材料分为实验组(异种DPB+自体Ss+rhBP2)和对照组(自体骨)。1.4山羊Ss培养及与异种DPB复合别离培养、搜集山羊Ss，调整细胞浓度为1.0106l，将细胞悬液接种于异种DPBrhBP2上，2l块，放入37、52、饱和湿度的2培养箱中培养6h再加含15FBS的
4、DEF12培养基1l，23d后常规换液。1.5动物手术术前拍双侧胫骨X线片，测量胫骨干长度，所有动物骨缺损制备和外固定一样，操作由同一组人员完成。半环槽式外固定器固定，所有螺母旋紧。根据X线片得到的胫骨长度，右侧胫骨中下段造成20骨和骨膜段缺损4，据分组植入不同的植入物，其中Ss均来自山羊自体骨髓。术后每隔4周摄肢体正侧位X线片。肌注速眠新0.08l/kg，麻醉后固定，常规条件摄片。1.6配制墨汁及灌注市售墨汁过滤后，按721的比例将墨汁、10甲醛和20甘露醇混合配制成灌注液，6层医用纱布过滤，用前恒温水浴加热至38。速眠新0.08lkg与氯胺酮2g/kg肌肉注射复合麻醉后固定，肝素1000U
5、kg肌注全身肝素化，在腹股沟区切开皮肤、皮下组织，游离股、静脉。结扎股动脉、离断，远端插管、固定；结扎股静脉、离断，远端切开放血。快速向股动脉远端推注大量肝素生理盐水(每500L生理盐水中参加肝素12500U)冲洗直至股静脉流出清亮液体为止。然后从股动脉注入38墨汁灌注液至股静脉流出黑色液体，皮肤趾甲变黑，结扎股动、静脉。处死山羊，取下胫骨，低温放置24h后10甲醛溶液中固定2周。进展大体解剖及厚切片观察新骨血管化情况。1.7大体解剖观察切开皮肤，暴露皮下组织和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，观察皮下组织、肌肉和骨膜血管网。1.9统计方法采用SPSS13.0统计软件进展数据处理，数值以均数标准差(s)
6、表示，采用单因素方差分析进展比拟。2结果2.1术后观察所有实验山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡。26h清醒，并能站立进食。螺母松动后及时旋紧，无外固定松动失败，皮肤无坏死。2d内伤肢能落地，但不能负重，2周后可以局部负重，3周能细微跛行，4周后能自由活动，无跛行。2.2大体解剖观察肌肉和软组织已经被墨汁黑染，皮下、肌肉筋膜和骨膜可清楚的观察到血管大孝分支、走行方向及互相吻合呈网状。2.3影像学观察术后4周骨缺损区出现植入物边缘毛糙，8周出现大小不等、形状不规那么的透光性骨吸收区。术后12、16、20、24周，2组表现为时间依从性的骨修复，表现为骨缺损区两断端之间高密度钙化影，新生骨与两断端完全
7、相连接，大局部塑形，可见髓腔影(图1)。表12组术后不同时间点新骨血管数目比拟略2组比拟：P0.05表22组术后不同时间点新骨血管面积比拟略两组比拟：P0.053讨论异种骨的应用主要是免疫原性和成骨才能，而移植后的血管化及其速度是评价去除免疫原性程度的一项重要指标，去免疫原性的程度能为受植的动物所耐受。对新骨能否生成，血管化过程对骨再交融方式起决定性作用3，以往作为骨移植材料制备的异种骨多作为单纯的充填物，或添加自体细胞或生长因子进展研究，这些实验在小型动物实验或大型动物小段骨缺损修复获得了成功4。在修复骨缺损的部位上，李晓辉等5添加碱性成纤维细胞生长因子与局部脱蛋白骨复合修复家兔股骨头缺损获
8、得良好的效果，但在大型动物的大段骨缺损，特别是在血供较差，肌肉覆盖较少的胫骨中下段修复报道较少。作者的改进法在制备过程中尽量保存胶原蛋白，去除非胶原蛋白、肽类及脂类、细胞等，显著降低了抗原性，同时保存了良好的力学强度、天然的网状孔隙系统，为细胞的黏附、增殖及分化提供良好的三维空间构造，并参加骨诱导性细胞因子rhBP2，在植入前复合山羊自体Ss，使复合物既具有骨传导性，又具有骨诱导性，促使其成骨才能增强。在一系列理化性能检测、平安性及小动物免疫原性及成骨研究的根底上6，本实验在修复羊胫骨干大段骨缺损过程时对组织工程骨的血管化问题进展了研究，结果显示，所有实验组山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡，影像学显示对骨缺损有完全修复。血管化过程表现为血管数量逐渐增多，血管分布逐渐均匀。血管面积图像分析结果显示实验组与自体骨移植修复组比拟，2组新骨的血管化程度经统计学分析差异无显著性意义(P0.05)，说明本组研制的异种脱蛋白骨复合物修复大动物长骨大段缺损的血管化，其血管化与自体骨相当。实验结果证实，所制备的异种脱蛋白骨免疫原性较低，可以用于修复大动物长骨大段骨缺损，血管化速度及程度与作为金标准自体骨移植相比无显著性差异。为临床大段骨缺损修复提供实验根据。关于异种脱蛋白骨复合物在临床骨缺损的修复中的应用，尚有待进一步研究。
