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1、-第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经历不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进展有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进展了广泛的科学研究和实践，取得了
2、一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于19831985年对大肠菌群检验方法进展了实验研究，并作了比照观察，同时对国常用的大肠菌群快速检测方法也进展了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学局部中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、VP、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和
3、445乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不管分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为根底。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36l温箱，培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按以下程序进展。 2别离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置3
4、6l温箱，培养1824小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l2个进展革兰氏染色，同时图3-I大肠菌群检验程序 (=)培养基 1乳糖胆盐发酵培基成分：蛋白胨 猪胆盐(或牛，羊胆盐) 乳糖、004溴甲酚紫水溶液 蒸馏水pH74制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，并放入一个小倒管，高压灭菌11515分钟。20g5g 1 Og25m11 000m1校正pH，参加指示剂，分装每管l 0ml，附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。用途：乳糖发酵试验用。原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖接
5、种乳糖发酵管，置361温箱培养242小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 4报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。 5检验程序。见图3-1类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。 乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞转化为葡萄糖后再被利用。 糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。 大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解
6、成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。 注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1) 2伊红美蓝琼脂培基成分：蛋白胨10g 乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 17g 2伊红Y溶液 20ml 065美蓝溶液 10ml 蒸馏水 1000ml pH7.1 制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶，高压灭菌12115分钟备用。临用时参加乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55，参加伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、
7、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。 3乳糖发酵培基 成分：蛋白胨 20g 乳糖 10g O04溴甲酚紫水溶液 25ml 蒸馏水 1000mlpH74 制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，参加指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌11515分钟。 附注： (1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。 (2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。 4蛋白胨水 成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g 氯化钠 5g 蒸馏水 1 000ml pH74表3-1 供发酵试验用的糖类、
8、醇类和糖苷类化学上的分类名称戍糖(C5H10O5)已糖(C6H12O6)双糖类(C12H22O11)兰糖类(C6H10O5)3多糖类(C6H10O5)*阿拉伯糖 arabinoSe木糖 *ylose鼠糖 rhamnose葡萄糖glucose de*trose果糖 fructose,levulose甘露糖 mannose半乳糖galactose麦芽糖 moltose乳糖lactose蔗糖sucrose草搪 trehalose纤维二糖 cellobiose木蜜糖 melibiose棉子糖 raffinose落叶松糖 melizitose菊糖inulin淀粉starch肝糖glucogen 糊精 d
9、e*trin一供发酵试验用的各种糖类(二)供发酵试验的各种醇类和糖苷类化学上的分类名称三元醇C3H5(0H)3四元醇C4H6(0H)4五元醇类C5H7(OH)6六元醇类C6H8(OH)8环己六醇(CHOH)6糖苷类甘油 glycerol赤丝藻醇erythritol侧金盏花醇 adonitol阿拉伯胶醇 arabitol甘露醇 mannitol卫矛醇 dulcitol山梨醇 sorbitol肌醇 inositol水苷 salicin七叶苷 aesculin松柏苷 coniferlin 制法：按上述成分配制，分装小试管，高压灭菌12l15分钟 附注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先
10、用菌种鉴定后方可使用。玫瑰吲哚)图3-2靛基质的产生及呈色的机理图 原理：细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，与对二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲跺而呈红色(见图3-2)。 (三)检验时应考前须知 1检验步序。大肠菌群的检验步序采用三步法(乳糖发酵试验、别离培养和证实试验)。第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板别离和证实试验后，有时可能成为阴性。大量检验数据说明，食品肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步序的符合情况也不一致(见表3-2)，所以在大肠菌群检验步序方面，应结合食品类别、污染情况以及样品中菌相的差异分别予以考虑
11、。在食品检验上，除个别情况外，一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阴性。只做一步初发酵，对表3-2检验步序与检出率的关系种样品名称检出阳性率B/A*100%C/B*100%类初发酵 (A)平板别离 (B)复发酵 (C)C/A*100%食品羊肉熟肉灌肠生牛奶甜炼乳奶粉醋酱油冰棍雪糕冰砖汽水炊具(碗) 483 298 540 450 163 77118 3l3 743 12 109 483 218 540 439 140 74 41 265 493 12 109 483 215 539
12、439 100 74 38258460 12 109 lOO 73.2 100 97.16 85.9 96.1 34.7 84.7 66.4 100 100 100 72.1 99.8 97.6 61.3 96.1 32.2 82.4 61.9 100 100 100 98.8 99.8 100 71.4 100 92.7 97.4 93.3 lOO100合计3306 2814 2727 85 825 96.9*些食品来说，误差是比拟大的。这样做，会有相当局部的合格样品被作为不合格样品处理应予注意。 2抑菌剂。大肠菌群检验中经常使用的抑菌剂有胆盐洗衣粉、十二烷基硫酸钠煌绿、龙胆紫，孔雀绿等。抑
13、菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的*些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有差误，即可对抑菌作用产生影响；有的抑菌剂当牌号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量。这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件我们曾对胆盐等三种抑菌剂进展大肠菌群检验效果的观察(见表33)。目前我国在食注:(一)表示不加抑菌剂：()数字系品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经实验观察无何明显差异，可相互替代。但其他胆盐的检验效果则不一致(见表34)，故不宜相互替代。目前由于胆盐不易购置，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠或兔胆盐等代替猪胆盐参加培基中，这会影响大肠菌群酶检验结果，应予注意。在胆盐用量上，实验说明1、O.5和0.25%三个剂
