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1、1 总 RNA 提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min ;打开离心机预冷(3) 力卩200卩氯仿，振荡15 sec室温放置3 min，分层； 4C, 12,000g，离心 15 mi n；(5) 取上清，加500卩异丙醇，混匀，室温放置10 min;(6) 4C, 12,000g，离心 10 mi n；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心 5 min ；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，
2、加50卩L DEPC 水，80C保存。此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总 RNA 需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。 OD260 值为核酸的吸 收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在间一般说明该核酸蛋白含 量在允许的范围内，可正常使用；此外还有 OD230值为多糖和酚类的吸收值，比 较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总 RNA浓度(卩 g/mL =A260 稀释倍数 40。2 反转录 /cDNA 第一链的合成纯化RNA以去除基因组 DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScrip
3、t RT reage ntwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：Total RNA1yg5X gDNA Eraser Buffer2yLgDNA Eraser1yLRNase Free dH2O补齐至 10yL条件为： 42oC, 2min；RNA 纯化后,即可进行反转录。其体系为：5 x PrimeScript Buffer 2( for Real Time)4yLPrimeScript RT enzyme mix I1yLRT Primer Mix1yL上一步的反应液10yLRNase Free dH2O补齐至 20yL操作条件为：(1
4、) 37oC 放置 15 min；(2) 85oC, 5 sec；(3) 4oC 保存。3 PCR按 TaKaRa公司的 Premix TaqVersion 2.0操作，PCR反应体系如下：Premix Taq25 yL模板5yL引物 1 (10 y M)1 yL引物 2 (10 y M)1 yLddH2O18 yLPCR 反应条件为：94 （预变性 5min; 94C 变性 30s, 53 C退 火 30s, 72 C 延伸30s,循环36次；72C延伸10min。PCR反应完毕，取反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用 10 yL反应产物）4 基因克隆及测序4.1 PCR 产物切胶
5、回收将 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳， 在紫外灯下观察并切下预期大小的 DNA 片段。使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割胶回收试剂 盒进行纯化，步骤如下：平衡吸附柱：向吸附柱 CB2中(吸附柱放入收集管中)加入 500 Z平衡 液BL , 13,400X g离心1 min,倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2重新套回收集 管中；(2) 按100 mg agarose胶加入100卩L溶液PC,置于50C中10 min左右， 中途混匀几次，至胶完全融化；(3) 将样品倒入一个吸附柱 CB2 中(吸附柱放入收集管中) ，室温下 13
6、,400 x g离心1 min,倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(4) 向吸附柱CB2中加入600卩L漂洗液PW (加乙醇)，室温下13,400x g离 心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400x g离心2 min，尽量除去 漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌 1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50卩L洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400x g室温离心2 min,收集到的洗脱 液即为回收的 DNA 纯化液；(8) 取5 Z的
7、纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液 中 DNA 含量。4.2目的片段与载体连接(1)胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂 盒说明书。在灭菌的0.5 mL离心管中配制如下溶液(10卩：回收 DNALigation Solution pMD18-T Vector16C反应30分钟，所得产物保存于4C冰箱备用4.3连接产物转化 E.coli DH5a(1)将5卩1连接产物加入到100 E.coli DH5a感受态细胞中，轻轻旋转离 心管混匀内容物，冰上静置 30 min；42C水浴热激转化90 sec立即放回冰上，放置3 min;(3)每管加入
8、500卩LLB 培养基 (室温放置)， 37oC 160-180 rpm 振荡培养 45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因； 在含有Amp (100卩g/mL的选择性平板上加入60-100卩L菌液，用无 菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用 Parafilm 膜封好；(5)将培养皿正放，37oC约50 min,待液体全部吸收后，倒置平板继续培养 10-16 h。4.4转化子的筛选及鉴定(1) 用无菌枪头挑取 LB 平板上 3-5个单菌落，分别接种到 3.5 mL LB 液体 培养基 中(含 100 卩 g/mL Amp，37oC，165rpm振荡培养 10-12 h; 用5卩菌液做模板，进行PCR鉴定(50卩L体系)，操作步骤同3。阳 性菌液由 Invitrogen 生物公司测序鉴定，余下的菌液 4oC 保存备用；(3)测序结果在Genbank数据库中进行比对分析。
