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1、聚合酶链反应聚合酶链式反应（polymeras chain reaction , PCR 是 1985 年 由Kary Mulis创立的一种体外酶促扩增特异 DNA片段的方法。PCR 反应可以从长链DNA或众多DNA中特异性地扩增某一片段。它的灵敏 度非常高， 从几个基因拷贝， 甚至一个基因拷贝就可以扩增出大量的 同样片段。应用：绘制DNA物理图谱、DNA片段多样性、基因克隆、基因诱 变、DNA序列分析等许多领域都用到 PCF技术。PCF技术的原理：在PCF反应的第一个循环中，包括模板 DNA变 性，变性后的模板DNA与合成的引物退火，链延伸。第一个循环完成 后，开始第二个循环，其方式是重复第
2、一个循环的变性、退火、延 伸循环1步噪A：变性模板，步骤B：与引物退火Si J步骤C：扩增5循环1步骤A,步骤B3i5 c 5 州5步骤C3 皿5 355 33图12. 25 PCK扩增温度：原核生物的DNA模板变性，94C是足够的；退火温度可以 变化，一般低于Tmf直10C即可，如果目的基因的拷贝数极少，退火 温度在开始的基个循环之中可适当降低，甚至到 42C ;退火时间也 可变化；链的延伸温度，一般是 72C ;延伸的时间可由扩增片段的 大小而定，一般认为DNA聚合酶的聚合速度是1000bp/min。一、引物采用两个引物：Primer 1 是扩增片段编码链的上游一段 DNA（cDNA；）P
3、rimer 2 是非编码链下游的一段 DNA（cDNA。）Primer 的设计 :1. 引物的序列应位于基因组 DNA的高度保守区，而且与非扩增区无 同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异相结合，提高反应 的特异性。2. Primer 的长短以扩增片段的大小而定， Primer 越长，特异性越强。 扩增片段在1kb以内，Primer 一般以15-30nt为宜。引物过短或 过长均可使反应的特异性降低，同时引物过长还会浪费成本。3. 弓I物的GC含量以45%-558为佳，GQ应该随机分布，避免出现嘌呤、 嘧啶堆积现象。4. 引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文 结构。5. 二
4、个引物不应有互补序列，特别是 3端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。6. 引物5末端碱基无严格限制，在与模板 DNA吉合的引物长度足 够的条件下，其5端碱基可不与模板 DNA互补而成游离状态， 因此, 可在引物 5端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它 序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5端最多可加10 个bp碱基而对PCF反应无影响。7. 引物3端的1 2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延伸效率，从 而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的 3端碱 基很重要。引物 3末端碱基错配时，不同碱基的引发效率存在 很大差异，当末位碱基为 A 时，错配时引发效率大大降
5、低，当末 位碱基为 T 时，错配情况下亦能引发链的合成，所以 3末端的 碱基最好选T、C、G而不选A。8. 引物的 3端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸 如 Met Trp ，而且要避免三联体密码第 3 个碱基的摆动位置位于 引物的 3末端。9. Tm 值应低于延长温度。10. 若引物上需引进突变或加入酶切位点， 则 Primer 应适当长一些， 引入突变后的互补序列不宜少于10nt （扩增1kb以内的片断）。二、DNA聚合酶在水生栖热菌中分离到一种DNA聚合酶，在PCF变性温度下仍具 活性，这种酶定名为Taq聚合酶。另外，由于TagDNA聚合酶扩增片 段时往往在末端多加一个A,这样的PCR产物易于用T-载体克隆。三、RT-PCR在原核生物中可以直接用 PCF扩增DNA片段，但在真核生物中应 用最多的是首先分离mRNA通过反转录产生cDNA再进行PCFT增, 这就是 RT-PCR。
