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1、PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时 ,经常出现假阳性 、假阴性 、非特异性扩增和涂抹带。 尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论 ,有时可造成严重后果。为了提高转基因 检测的准确性和可靠性, PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现 象的发生。一个好的 PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、 重现性、鲁棒性,尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方 法予以综述。一、假阳性:(一)假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验
2、中的几个阴性对照中出现一个 或几个阳性结果 ,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。 实验中设立的阴性对 照可提示有无假阳性结果出现。(二)造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染:样本污染主要有收集样本的容器被污染,或样本放置时,由于密 封不严溢于容器外,或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染;样本核酸模板在提取过程 中,由于吸样枪污染导致标本间污染;2. PCR 试剂的污染:主要是由于在 PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸 水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。3. PCR 扩增产物污染:这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷 贝量大(一般为1013
3、拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。4. 气溶胶污染:在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动 反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶 胶颗粒可含 48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。5. 实验室中克隆质粒的污染:由于克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过 程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具 有很强的生命力 ,其污染可能性也很大。 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照 的检验室,这个问题比较常
4、见。(三)假阳性问题的试验控制在每次 PCR 检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴 性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染;阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA 提取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和 阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对 照,才能证明试验结果成立。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括:1、DNA 阳性对照:以含有目的片段的 DNA( 或质粒)作为模板进行扩增,证明 PCR 试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。 (注意
5、:阳性样品扩增 效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源)。2、DNA 阴性对照:以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增 过程中无假阳性现象。3、空白对照:以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR 抑制物对照:在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品 DNA ,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品 DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取对照 :空白提取对照扩增结果为阳性, 说明 DNA 提取试剂可能受到污染。6、阳性提取对照:阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误。如果 DNA 阳性对照扩增结果为阴性 ,或者 DNA 阴
6、性对照和空白对照扩增结果为阳性 , 则说明 PCR 试剂或扩增过程存在问题。(四)假阳性解决途径由于 PCR 的敏感性和效率特别高,所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现 假阳性 。尤其是 PCR 扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染 ,导致假阳性现象发生。1、规范实验室设计实验室设置上分配液区、 DNA 提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提 取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流。在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。不同工 作区域相互隔离,通过传递仓传递。PCR 前处理区(样品制备室、 DNA 提取室)和 PCR 准备室设置正压通风系统,并设 置通风柜或生物反应柜造成局部负
7、压;后 PCR 室( PCR 室及电泳室为高度污染区) 设置负 压通风系统,防止大量游离分子及气溶胶,对其它区域造成环境污染。配制 PCR 反应体系(配备冰箱及生物安全柜,此实验室要求无模板 DNA 存在)和向 PCR 反应体系中加入模板 DNA (配备生物安全柜及冰箱)要求在不同区域进行。2、规范试剂耗材管理1)验证:新购买的试剂需进行实验前验证;2)分装:双蒸水、引物和 dNTP 均应分装储存,并标明日期,以防污染;试剂的分装 应在装有紫外灯的超净工作台上进行;试剂分装成小份一次使用后弃去。3)消毒:除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。必要时,在加 样本前,反应管和试剂用
8、紫外线照射,以破坏存在的核酸。3、规范实验室操作1)控制污染源: PCR 产物和质粒操作空间是最大的污染源,应严格防止将这个空间 的物品带出;2)一次性用具:使用实验服和一次性手套,使用带有滤膜的移液器枪头,一次性反应 管和离心管;3)定期消毒:定期对实验室进行紫外照射,用10% 漂白剂、 3双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。4)定期通风:对实验室定期进行正压、负压通风处理;5)小心操作:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;加样 时,最后加阳性对照。4、技术处理1 )在 DNA 模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产 物。一般选用波长
9、254nm 照射 30min ( Nature , 1990 , 34:27 );2)PCR 实验中使用 dUTP ,而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的 PCR 产物,而不降解基困组 DNA 模板,然 后热灭活此酶,再进行扩增反应(Gene ,1990 ,93:125)。美国 PE 公司提供此类试剂盒;3)在 PCR 反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联 DNA 链,使之不能再扩增( Nucleic Acids Res ,1991 ,19 :99)。二、假阴性(一)假阴性现象与判断方
10、法如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果,提示本次实验中可能有假阴性结 果。但这里应注意,许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ,和标本相比来说,不 需纯化提取核酸的步骤,因此,如果在标本核酸纯化提取步骤有问题,即使阳性对照均呈阳 性,标本检测中还可能有假阴性。设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中同时对内标准基 因对照进行扩增,若内标准基因对照未能扩增出来,说明该反应管的结果可能有问题。(二)造成假阴性的原因1 仪器因素PCR 实验对仪器的依赖性是很高的,离心机、扩增仪都是造成 PCR 假阴性的因素。 扩增仪的主要问题是孔间差,引起扩增失败或扩增效率降
11、低。 而离心机的影响则更容易被忽 视。国内使用离心机很少使用离心加速度( XXXg )作为参数指标,而常使用转数作为参数 指标,这里就存在着一个问题,由于离心机的大小不同,有效跳心半径也不相同,因此同样 的转速所产生的离心力相差很大 (有的在数倍以上 ),所以在相同的离心时间下,有可能模板 并没有离心下来,造成 PCR 假阴性。这个问题在其他实验也有,但因其他实验都是测定大 分子蛋白沉淀, 对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注 意一下这个问题。2 试剂质量问题PCR 实验的成功与否试剂的质量至关重要,试剂的质量问题涉及多个方面:细胞的裂 解;模板的抽提;引物位点的
12、选择; Taq 酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结 果的假阴性。这些都是试剂质量的问题,因此选用高质量的 PCR 试剂非常重要。酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条 带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高, 一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看 OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现, 而且两引物带的亮
13、度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要 平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致 引物变质降解失效。3 核酸模板问题1)模板中含有杂蛋白质;2)模板中含有 Taq 酶抑制剂;3)模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;4)在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过 程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。4、物理原因:
14、 PCR 仪控温不准,也是 PCR 失败的原因之一。有时还有必要用标 准的温度计,检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。5、靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列 某段缺失使引物与模板失去互补序列,其 PCR 扩增是不会成功的。6 操作人员素质问题PCR 实验的环节很多,而且对每一环节的质量要求都很高,例如少加、漏加试剂、离 心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。(三)假阴性问题的试验控制在每次 PCR 检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴 性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染;阳性对照样品检测为阳性时,表明DN
15、A 提取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和 阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括:1、DNA 阳性对照:以含有目的片段的 DNA( 或质粒)作为模板进行扩增,证明 PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。(注意:阳性样品扩增效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源)。2、DNA 阴性对照:以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增 过程中无假阳性现象。3、空白对照:以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR
16、 抑制物对照:在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品 DNA ,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取对照 :空白提取对照扩增结果为阳性, 说明 DNA 提取试剂可能受到污染。6、阳性提取对照:阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误。如果 DNA 阳性对照扩增结果为阴性 ,或者 DNA 阴性对照和空白对照扩增结果为阳性 , 则说明 PCR 试剂或扩增过程存在问题。(四)假阴性解决方案1反应体系不灵敏: 1 )检查 PCR 试剂是否失效; 2 )检验引物是否降解: 3)优化 PCR 扩增体系与程序。2、PCR 反应存在抑制物: (1)